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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Abscessus Mycobacterium es un patógeno emergente que provoca un amplio espectro de síndromes clínicos en seres humanos. Estos incluyen infecciones cutáneas, así como las infecciones pulmonares crónicas severas, en su mayoría se encuentran en inmunocomprometidos y en pacientes con fibrosis quística 1,2,3,4. M. abscessus también es considerado como una de las principales especies de micobacterias de rápido crecimiento responsables de las infecciones nosocomiales y yatrogénica en los seres humanos. Por otra parte, varios informes recientes destacan la posibilidad de que M. abscessus podía cruzar la barrera sangre-cerebro y inducir lesiones importantes en el sistema nervioso central (CNS) 5,6. A pesar de ser un cultivador rápido, M. exposiciones abscessus también varias características patógenas que están relacionados con los de Mycobacterium tuberculosis, incluyendo la capacidad de permanecer en silencio durante años dentro de las estructuras granulomatosas y generar lesiones caseosas en los pulmones 7. Más alarmante es el bajo sensibilidad de M. abscessus a los antibióticos, lo que hace que estas infecciones extremadamente difíciles de tratar que conduce a una tasa de fracaso terapéutico significativo 8,9. La amenaza importante de esta especie es principalmente su resistencia intrínseca a los antibióticos, lo cual es motivo de gran preocupación en las instituciones de salud pública 10 y una contraindicación para el trasplante de pulmón 11.

M. abscessus pantallas morfotipos (R) de colonias lisas (S) o ásperos que conducen a diferentes resultados clínicos. En contraste con la cepa S, R bacterias tienen una tendencia a crecer de extremo a extremo, lo que lleva a una cuerda o similar a un cordón estructura 12,13. Varios estudios independientes basados ​​en modelos ya sea celulares o animales revelaron el fenotipo hiper-virulencia de la R morfotipo 14,15. A partir de estudios epidemiológicos, los casos más graves de M. infecciones pulmonares abscessus parecen estar asociados con R variantes de 16, que son la única variante quese ha visto a persistir durante años en un huésped infectado 3. La diferencia morfotipo se basa en la presencia (en S) o pérdida (en R) de glicopeptidolípidos asociadas a la superficie (GPL) 12. Sin embargo, debido a las limitaciones inherentes de los modelos de celular / animales disponibles actualmente utilizado para estudiar M. infección abscessus, nuestro conocimiento sobre los hechos fisiopatológicos de las variantes R o S sigue siendo oscuro. La infección de ratones inmunocompetentes vía intravenosa o en aerosol conduce a la colonización transitoria, lo que impide el uso de ratones para estudiar las infecciones persistentes y en vivo las pruebas de sensibilidad de drogas 17. Por lo tanto, el desarrollo de modelos animales susceptibles a la manipulación de la respuesta del huésped es un gran desafío. En este contexto, los modelos no mamíferos de infección se han desarrollado recientemente, incluyendo Drosophila melanogaster 18 que ofrece una serie de ventajas como el coste, la velocidad y la ética o la aceptabilidadVer el modelo de ratón. El modelo de pez cebra (Danio rerio) de infección también se ha explorado para visualizar, mediante formación de imágenes no invasiva, la progresión y la cronología de M. infección abscessus en un animal vivo 19. Es importante destacar que también se estableció una prueba de concepto para demostrar su idoneidad para in vivo evaluaciones antibióticos contra M. abscessus 17,20.

El pez cebra se han utilizado ampliamente durante las últimas dos décadas para estudiar las interacciones entre diversos patógenos y el sistema inmune del huésped 21. El creciente éxito de este modelo de vertebrados alternativa se basa en las principales y únicas oportunidades que motivaron y validan su uso para una mejor comprensión de numerosas infecciones virales y bacterianas 19,22,23,24,25,26,27,28,29. A diferencia de la mayoría de otros modelos animales, embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, lo que permite imágenes de fluorescencia no invasiva 30. Esta Has llevado a estudiar M. abscessus infectado embriones de pez cebra con detalles sin precedentes, que culminó con la descripción de grabación extracelular, que representan un ejemplo de plasticidad morfológica bacteriana. Cording representa un nuevo mecanismo de subversión del sistema inmunológico y un mecanismo fundamental promover patogénesis de la aguda M. infección abscessus 19.

Este informe describe las nuevas herramientas y métodos que utilizan el embrión de pez cebra para descifrar las características fisiopatológicas de M. abscessus infección y para estudiar las interacciones íntimas entre los bacilos y el sistema inmune innato. En primer lugar, un protocolo de microinyección detallado que incluye el procesamiento de la inóculo bacteriano, la preparación de embriones, y la infección per se, se presenta. Métodos adaptados específicamente para evaluar M. virulencia abscessus midiendo diferentes parámetros, como la supervivencia de acogida y la carga bacteriana, se presentan. Se presta especial atención sobre la formapara supervisar, a nivel espacio-temporal, el destino y la progresión de la infección y de la respuesta inmune del huésped a M. abscessus usando microscopía de video. Por otra parte, para investigar la contribución y el papel de los macrófagos durante M. abscessus infección, métodos para generar los macrófagos-agotado embriones (utilizando enfoques ya sea genetically- o basados ​​químicamente) se describen. Por último, los protocolos para visualizar las interacciones específicas con los macrófagos o neutrófilos utilizando ya sea fijo o embriones vivos están documentados.

El objetivo de este informe es estimular más estudios para arrojar nueva luz en M. mecanismos de virulencia abscessus y en particular el papel de acuerdo en el establecimiento de un proceso de infección aguda e incontrolada.

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Protocol

Procedimientos experimentales pez cebra deben cumplir con los reglamentos institucionales y gubernamentales pertinentes. Para el presente estudio, los experimentos de pez cebra se realizaron en la Universidad de Montpellier, según las directrices de la Unión Europea para el manejo de animales de laboratorio (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) y aprobados bajo la referencia CEEA-LR-13007.

1. Preparación de los reactivos y microinyección Equipo

  1. Preparar el agua peces disolviendo 0,06 g instantánea sal del mar del océano en 1 L de agua destilada 31, entonces autoclave para esterilizar (120 ° C durante 20 minutos) y almacenar a 28,5 ° C durante un máximo de 1 mes.
  2. Prepare la solución de azul de metileno disolviendo 1 g de azul de metileno en 1 L de agua destilada. Añadir 300 l de solución de azul de metileno en 1 l de agua los peces para obtener agua de pescado azul, a continuación, autoclave para esterilizar y almacenar a 28,5 ° C durante un máximo de 1 mes.
    NOTA: El additiel azul de metileno en agua de pescado previene el crecimiento de moho.
  3. Preparación de tampón fosfato salino (PBS)
    1. Preparar una solución madre de PBS X 10 disolviendo 5,696 g de Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg de KCl y 78.894 g de NaCl en 1 L de agua destilada y ajustar el pH a 7,0 con HCl. Para obtener 1 X PBS, diluir a 100 ml de la solución de 10 X PBS en 900 ml de agua destilada y autoclave durante 20 min a 120 ° C para esterilizar.
    2. Añadir 0,05% de Tween 80 para obtener 1 X PBST y almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 1 año.
  4. Preparar oleico enriquecimiento Acid Dextrosa catalasa (OADC) disolviendo 8,5 g de NaCl, 50 g Albúmina de suero bovino, 20 g de D-glucosa, 40 mg de catalasa de hígado bovino y 0,5 g de ácido oleico en 1 L de agua destilada luego filtrar esterilizar la solución y almacenarlo a 4 ° C durante un máximo de 6 meses.
  5. Preparar 100 ml de ácido metanosulfónico acetato de 3-aminobenzoato (tricaína) solución madre, mediante la disolución de 400 mg tricaipolvo ne en 97,9 ml de agua destilada. Añadir 2,1 ml de 1 M Tris (pH 9) para ajustar el pH a 7,0 y almacenar la solución a -20 ° C.
  6. Preparar las agujas de inyección microcapilar tirando de capilares de vidrio de borosilicato (1 mm OD X 0,78 mm ID) usando un dispositivo extractor de micropipeta con los siguientes ajustes: Presión de aire 650; Calentar 999; Tire de 50; Velocity 80; Tiempo 200.
  7. Preparar una solución de agar al 1,5% en agua pescados azules y verter 25 ml de agar fundido en 100 mm placas de Petri. En la parte superior del agar derretido, colocar los moldes hechos en casa con el fin de imprimir canales específicos. "V" canales -shaped se utilizan para los embriones de posición mientras que la "U" se utilizan para los huevos (Figura 1) 31. Una vez solidificado, retirar con cuidado el pie de imprenta.
    NOTA: Cubra el agar con agua pescado azul para evitar la deshidratación y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 2 meses.

Figura 1 Figura 1. cámaras de posicionamiento para las inyecciones de pez cebra. (A) canales en forma de U para huevos (panel izquierdo) y canales en forma de V de embriones (panel derecho). Huevos de pez cebra / embriones se colocan en los canales y alineados a lo largo del mismo eje. Cámaras (B) de visualización para la observación microscópica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación y almacenamiento del M. abscessus inóculo

  1. M. condiciones de crecimiento abscessus
    1. Placa a cabo M. abscessus desde un -80 ° C en glicerol en un agar Middlebrook 7H10 que contiene 10% de OADC y 0,5% de glicerol (7H10 OADC) y suplementado con el antibiótico apropiado dependiendo del marcador de resistencia llevado por el vector que codifica la proteína fluorescente. Incubar las placasa 30 ° C durante 4-5 días.
    2. Recoger una colonia micobacteriana fluorescencia positiva y inocular 1 ml de caldo de Middlebrook 7H9 suplementado con OADC, 0,2% de glicerol, 0,05% de Tween 80 (7H9 OADC / T) con el antibiótico requerida en un tubo de plástico estéril de 15 ml. Se incuba a 30 ° C durante 1 semana sin agitación.
      NOTA: Tween 80 restringe la formación de grumos y la agregación bacteriana.
    3. Resuspender el pre-cultivo obtenido en 2.1.2 en 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T en 150 cm 2 frascos de cultivo de tejidos a una final 0,1 OD 600 (correspondiente a alrededor de 5,10 7 bacterias / ml) y se incuba adicionalmente a 30 ° C durante 4 días para obtener un cultivo exponencial de crecimiento (OD 600 = 0,6 a 0,8).
      NOTA: Para reducir al mínimo la formación de grumos, especialmente de la variante rugosa, la incubación no debe exceder de 5 días. Ambas variantes lisas y rugosas muestran una tasa de crecimiento similar.
  2. Preparación de la M. inóculos abscessus60;
    NOTA: Debido a la alta propensión de áspera M. abscessus para formar grandes agregados y para producir cuerdas, un tratamiento específico es necesario generar inóculos homogénea y controlada cuantitativamente antes de la microinyección en los embriones. Este tratamiento también se aplica para suavizar las bacterias que producen agregados, aunque en menor medida que la cepa rugosa.
    1. Cosecha de manera exponencial-crecer cultivos de 150 cm 2 frascos de cultivo de tejidos por centrifugación a 4, 000 xg durante 15 min a TA en un tubo de plástico estéril de 50 ml y resuspender el sedimento bacteriano en 1 ml 7H9 OADC / T. Alícuota 200 l de suspensiones bacterianas en 1,5 ml tubos de microcentrífuga.
      NOTA: El trabajo con pequeños volúmenes de 1 ml jeringas es necesario obtener suspensiones altamente homogéneos.
    2. Homogeneizar las suspensiones bacterianas con una aguja de 26 G (15 arriba y abajo secuencias), sonicado tres veces durante 10 segundos (con 10 seg descansos entre cada sonicación sesecuencia) usando un sonicador de baño de agua. Añadir 1 ml de 7H9 OADC / T y agitar brevemente. Centrifugar 3 min a 100 x g.
    3. Recoger cuidadosamente el sobrenadante que contiene micobacterias-para evitar las aglomeraciones y la piscina las suspensiones homogéneas en un tubo de plástico estéril de 50 ml.
    4. Compruebe visualmente la presencia de agregados bacterianos restantes eventuales.
      NOTA: Si los agregados están todavía presentes, proceder a una etapa de centrifugación adicional a 100 xg durante 2 min, y se recoge el sobrenadante.
    5. Centrifugar la suspensión a 4.000 xg durante 5 min, resuspender el precipitado en 200 l 7H9 OADC / T y proceder a la inyección.
    6. Evaluar la concentración bacteriana definitiva en placas diluciones seriadas (en 1 x PBST) en 7H10 agar OADC y contando las unidades formadoras de colonias (UFC) después de 4 días de incubación a 30 ° C. UFC debe determinarse para cada nuevo lote.
    7. Preparar las existencias inóculos congelados mediante el almacenamiento de 5 alícuotas a -80 & #176; C.
      NOTA: La evaluación de UFC de los -80 ° C alícuotas congeladas es un requisito previo para determinar el número exacto de bacterias viables como congelación / descongelación puede afectar la viabilidad bacteriana del inóculo. Estos inóculos congelados están listos para ser utilizado para las inyecciones posteriores. Puesto que todas las alícuotas contienen el mismo número de CFU, permiten la inyección de bacterias de una manera reproducible de un experimento a otro.
  3. Control de la calidad del inóculo
    NOTA: la tinción de Ziehl-Neelsen (específico de micobacterias) se puede utilizar para comparar la calidad de las suspensiones bacterianas antes y después de los procedimientos de homogeneización descritos en 2.2.
    1. Spot y hacia fuera una gota de la suspensión bacteriana homogeneizada en un portaobjetos de vidrio y deje que se seque por completo, fijar el frotis por lo menos durante 30 minutos en un plato caliente ajustado a 65-70 ° C y las manchas utilizando un protocolo de tinción de Ziehl-Neelsen .
    2. Observe la mancha bacteriana con un microscopio utilizando un 100Objetivo X y comparar con una mancha de una suspensión no procesada bacteriana (Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Preparación de dispersado M. inóculos abscessus. tinción de Ziehl-Neelsen de R o S variantes cultiva en medio de caldo antes de cualquier tratamiento (paneles superiores) o después del tratamiento (paneles inferiores) para reducir el tamaño y el número de agregados de micobacterias (etapas sucesivas de lavado con jeringa, sonicación y decantación) . Las bacterias se observaron utilizando un microscopio con 100 X 1,4 APO aceite objetivo NA). Las barras de escala:. 20 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Preparación de embriones de pez cebra

  1. El desove y la recolección de huevos de pez cebra
    1. El día antes de spignoración, raza de adultos de pez cebra mediante la colocación de 2 machos y 1 hembra (por lo general una proporción de 2: 1 permite que la tasa de fertilización óptima) en una cámara de cría, que consiste en una pecera independiente con una colección canasta de huevos 31.
      NOTA: cestos de recolección de huevos se utilizan para proteger los huevos de ser comido por los padres y facilitar la recolección de huevos.
    2. A 1 HPF, huevos y embriones de cosecha única desarrollados adecuadamente en una placa de 100 mm de Petri llena con 25 ml de agua pescado azul (máximo 100 embriones por placa) y mantenerlos a 28,5 ° C. Los huevos no fertilizados se descartan.
  2. Preparación de embriones de pez cebra para inyecciones
    1. A eso de las 24 horas después de la fecundación (HPF), dechorionate los embriones con unas pinzas finas en una placa de 100 mm de Petri y mantenerlos a 28,5 ° C.
    2. Recoge los 30-48 embriones HPF utilizando una pipeta y transferirlos a una cámara de "V" posicionamiento en forma de llenado de 25 ml de agua de pescado que contiene 270 mg / L tricaína.Coloque los embriones adecuadamente en los canales utilizando una herramienta de punta microloader casera (punta cargador micro casera recortado) optimizado para una micro-manipulación más fácil.
      NOTA: Orientar el lado dorsal hacia abajo para inyecciones intravenosas en la vena caudal o de la cara dorsal hacia arriba para inyecciones musculares cola.

4. Micro-inyección Procedimiento

NOTA: El procedimiento de micro-inyección para M. abscessus es similar a la descrita anteriormente para M. marinum inyecciones de 32. Para evaluar la cronología de M. infección abscessus (supervivencia, las cargas bacterianas, cinética y características de la infección), se prefieren las inyecciones en la vena caudal de 30 hpf embriones. Para visualizar el reclutamiento de células inmunes, las inyecciones se realizan en sitios localizados, como es en los músculos de la cola en 48 HPF embriones.

  1. Diluir el inóculo micobacteriana en 1 X PBST (dependiendo del número de CFU aadministrarse según lo determinado en el paso 2.2.6), que contiene un 10% de rojo fenol para comprobar la inyección adecuada.
  2. Cargar una aguja de inyección microcapilar 5-10 l de inóculo bacteriano usando una punta microloader, conecte la aguja de microinyección en el soporte del micromanipulador tridimensional conectado al inyector y romper la parte superior de la aguja con unas pinzas finas para obtener una abertura de diámetro de 5.10 micras.
  3. Calibrar el volumen de inyección ajustando la presión de microinyección (20-50 hPa) y el tiempo (0,2 seg).
    NOTA: El volumen de inyección requerida se calibra mediante la determinación visual del diámetro de una gota expelida en la yema de un embrión.
  4. Para inyección en la vena caudal, colocar el embrión con la parte ventral hacia la aguja (como se describe en la sección 3.2.2) y coloque la punta de la aguja cerca de la abertura urogenital, apuntando a la vena caudal, y empuje suavemente la punta de la aguja en el embrión hasta que apenas penetra la caudregión de la vena al. Entregar el volumen deseado de preparación bacteriana, por lo general 1/3 nl que contiene alrededor de 100 UFC / nl.
  5. Para la inyección intramuscular, coloque el embrión con el lado dorsal hacia la aguja (como en la sección 3.2.2), colocar la aguja más de un somito e inyectar un volumen pequeño (1 nl) de inóculo.
    NOTA: En cuanto a inyecciones en la vena caudal, infecciones intramusculares son también difícil de realizar. Se debe tener cuidado para evitar una sobrecarga que puede dañar los tejidos circundantes.
  6. Al final del procedimiento de inyección, controlar el tamaño del inóculo inyectando el mismo volumen de suspensión bacteriana en una gota de PBST estéril seguido por chapado en 7H10 OADC y contando el CFU. Alrededor de 100 embriones se pueden inyectar con una aguja.
    NOTA: Debido áspera M. abscessus puede continuar a formar agregados en la aguja, las inyecciones deben realizarse inmediatamente después de la preparación del inóculo.
  7. La transferencia de los fis infectadosh placas individualmente en 24 pocillos que contenían 2 ml / pozo de agua los peces y se incuba a 28,5 ° C. Los embriones inyectados con 1-3 nl 1 X PBST pueden ser utilizados como controles.
  8. Infección adecuada de bacterias fluorescentes en los embriones se controló usando un microscopio de fluorescencia.

5. Generación de macrófagos Empobrecido embriones

NOTA: el agotamiento selectivo de los macrófagos de los tejidos se utiliza para investigar su contribución y el papel durante la infección. Para visualizar el agotamiento adecuado de los macrófagos, se recomienda utilizar una línea transgénica con macrófagos fluorescentes, donde mCherry se expresa específicamente bajo el control del promotor específico de macrófagos MPEG1 19.

  1. Procedimiento basado Lipo-clodronato-
    NOTA: El procedimiento de lipo-clodronato permite un agotamiento selectivo de los macrófagos de los tejidos (pero no neutrófilos) 19. Este compuesto no altera ni la supervivencia de los embriones ni affect la integridad de las bacterias. Un protocolo detallado para preparar clodronato encapsulado en liposomas se ha informado anteriormente 33.
    1. En 24 hpf, dechorionate los embriones y transferirlos a un plato de "V" en forma de inyección lleno de agua peces suplementado con tricaína para mantener los embriones en un estado anestesiado hasta el final del procedimiento de inyección, como se describe en 3.2.2. Orientar la cara dorsal hacia abajo.
    2. Cargar una aguja de inyección microcapilar con clodronato encapsulado en liposomas (lipo-clodronato), conecte la aguja de microinyección en el soporte del micromanipulador tridimensional y romper la parte superior de la aguja con pinzas finas para obtener un diámetro de abertura de la punta de 10 micras.
    3. Para calibrar el volumen de inyección, ajustar la presión de microinyección a 20 hPa y el tiempo de inyección para 0,2 seg. Coloque la punta de la aguja cerca de la abertura urogenital, apuntando a la vena caudal, y empuje suavemente la punta de la aguja en elembrión hasta que apenas penetra en la región de la vena caudal y entregar el volumen deseado de solución (2-3 nl, 3 veces).
      NOTA: La suspensión-lipo clodronato es muy pegajoso y se debe vórtex antes de la inyección para evitar el bloqueo del sistema vascular y muerte del embrión. Es crucial para proceder a varias inyecciones sucesivas de pequeños volúmenes.
    4. La transferencia de los embriones en 100 mm platos Petri que contienen agua peces y mantenerlos a 28.5 ° C hasta que la infección.
    5. Controlar el agotamiento adecuado de los macrófagos por microscopía fluorescente.
      NOTA: el agotamiento completo de los macrófagos es eficaz durante 4 días después de la administración-lipo clodoronate.
  2. Procedimiento basado-morfolino
    1. El día antes del desove, raza adulto pez cebra mediante la colocación de 2 machos y 1 hembra separados por una barrera de plástico en una cámara de cría.
    2. Al día siguiente, ≈ 30 minutos después de que la luz se enciende en el centro de pez cebra, eliminar la barrera que separahombres y mujeres. Espere unos 20 minutos después del inicio del desove para optimizar la tasa de fecundación. Recoger los huevos y retrasar su desarrollo mediante la transferencia en una placa de Petri de 100 mm lleno de agua pescado azul frío (4 ° C).
      NOTA: El control de la desove es crucial para los experimentos basados ​​morfolinos. Morpholinos sólo puede ser inyectado en los huevos hasta la etapa de cuatro células.
    3. Recoge los huevos usando una pipeta y depositar los huevos en la "U" en forma de inyección en la cámara llena de agua pescado azul frío y bloquear los huevos en los canales utilizando una herramienta casera punta microloader.
    4. Preparar la solución morfolino PU.1 que contiene 10% de rojo fenol, como se describió anteriormente 19. Cargar una aguja de inyección microcapilar con la preparación morfolino y conecte la aguja de microinyección en el soporte del micromanipulador tridimensional, luego romper la punta de la aguja con pinzas finas para obtena diámetro abertura de la punta de 10.5 micras.
    5. Para calibrar el volumen de inyección, ajustar la presión de la microinyección de 20 a 50 hPa y el tiempo de inyección a 0,2 seg. Coloque la punta de la aguja cerca del huevo y empuje suavemente la punta de la aguja a través del corion en el huevo y entregar el volumen de la solución morfolino deseada, típicamente 3-5 nl.
    6. Después de micro-inyección, transferir los huevos en una placa de Petri de 100 mm en peces de agua y se incuba a 28,5 ° C hasta que comienza el procedimiento de infección.
    7. Analizar el (completa) el agotamiento adecuado de los macrófagos en morphants PU.1 por microscopía fluorescente en 30 a 48 HPF..
      NOTA: Dependiendo de la concentración inyectada, morfolinos p U.1 también pueden afectar el número de neutrófilos tempranos. Para confirmar el agotamiento adecuado de los macrófagos sin alterar el número de neutrófilos, se recomienda utilizar una línea de pez cebra transgénico doble con macrófagos y neutrófilos fluorescentes (con GFPexpresión impulsada especialmente por el promotor mpx) 19.

6. Cuantificación de la carga bacteriana

  1. Determinación por enumeración UFC
    1. En el punto de tiempo deseado, recoja grupos de embrión infectado (5 por condiciones) en 1,5 ml tubos de microcentrífuga (1 embrión / tubo), crio-anestesiar los embriones por incubación en hielo durante 10 min y la eutanasia mediante una sobredosis de tricaína (300- 500 mg / L)
    2. Lavar los embriones con agua estéril dos veces y prescindir de ellos en un nuevo tubo, Lyse cada embrión con 2% de Triton X-100 diluido en 1 X PBST usando una aguja 26-G y homogeneizar la suspensión hasta que la lisis completa. Centrifugar la suspensión y resuspender el precipitado en 1 X PBST con 0,05% de Tween 80. diluciones seriadas de los homogeneizados se sembraron en Middlebrook 7H10 OADC y complementan con el BBL MGIT PANTA, según lo recomendado por el proveedor.
      NOTA: M. abscessus ser más susceptibles a NaOH treatment que M. marinum, la descontaminación de los lisados ​​de pescado sin afectar M. crecimiento abscessus se puede lograr con éxito utilizando el cóctel de antibióticos de BBL MGIT PANTA.
    3. Incubar las placas durante 4 días a 30 ° C y las colonias de recuento.
  2. Determinación por fluorescencia Pixel Count (FPC) mediciones en embriones vivos
    NOTA: Para determinar las cargas bacterianas a través de la emisión de fluorescencia, imágenes seriadas de embriones infectados se adquieren y la intensidad de fluorescencia medida por FPC (identificación de bacterias por el análisis de partículas) utilizando una macro casera desarrollado para el programa gratuito ImageJ. Un análisis de partículas requiere de una imagen en blanco y negro binario que se basa en una serie de umbral que permite discriminar la señal fluorescente de interés desde el fondo.
    1. En el punto de tiempo deseado, tricain-anestesiar embriones infectados (5-10 por condición) en 35 mm placas de Petri como se describe en 3.2.2.
    2. Retire el agua y submerge los embriones y toda la superficie del plato con 1% de agarosa de bajo punto de fusión en el agua los peces, y luego alinear lateralmente los embriones. Cubra la agarosa solidificada con agua los peces tricaína que contiene.
    3. Adquirir imágenes de fluorescencia de todo el embrión utilizando un microscopio de epifluorescencia con un objetivo 10 X.
      NOTA: La adquisición de imágenes de fluorescencia es un paso crítico del procedimiento de medidas FPC. Es importante utilizar un monitor calibrado con una sonda de calibración de color. Ajuste del tiempo óptimo de exposición para obtener un fondo mínimo durante la adquisición evita la saturación de la señal. Las imágenes deben estar en formato TIFF de 8 bits. Ajustes idénticos se mantienen durante todo el experimento para fines cuantitativos.
    4. Retire cuidadosamente la agarosa de los embriones con una herramienta casera punta microloader. Estos embriones pueden ser utilizados para los análisis posteriores si es necesario. Antes de la cuantificación de la carga bacteriana, cada imagen será de calidad controlada. Para unanalyze las imágenes y convertir la intensidad de fluorescencia en FPC por pez, abra el programa gratuito ImageJ.
      NOTA: El valor FPC refleja la carga bacteriana como se muestra anteriormente utilizando M. marinum 34.
    5. Determinar el umbral requerido para el análisis de imágenes usando una imagen de un embrión no infectada (varios embriones de control pueden ser utilizados para obtener un umbral de promedio). Ir a la imagen → Ajustar → Umbral y luego mueva el control deslizante inferior de la ventana de umbral hacia la derecha hasta el fondo se vuelve completamente negro (es decir, para obtener un fondo debe estar en cero). Registre el valor correspondiente.
    6. En la imagen J, abra la macro FPC (archivo adicional) y siga las instrucciones: busque la carpeta de imágenes que va a medir y luego entrar en el umbral determinado previamente y haga clic en "Aceptar".
      NOTA: La macro resta automáticamente el fondo. A continuación se aplica un umbral. Señales fluorescentes son identificadoscado tras el análisis de partículas.
    7. Copia y pega los datos de la ventana de resumen para el software que desee para el análisis de datos.
      NOTA: En contraste con el método de determinación de UFC, el método FPC es no invasivo y permite volver a utilizar los embriones para su posterior análisis y, sobre todo, el seguimiento de la dinámica / cinética de la carga bacteriana de forma individual. Es, por lo tanto, permite reducir significativamente el número de animales, de acuerdo con las normas éticas.

7. Imaging M. Los embriones infectados abscessus-

  1. Imágenes en vivo de M. infección abscessus
    1. Mount embriones tricaína anestesiados (véase 3.2.2) en 1% agarosa de bajo punto de fusión en una placa de Petri de 35 mm antes de observaciones de microscopía de epifluorescencia. Use un plato de fondo de vidrio para microscopía confocal invertido o en una sola diapositiva depresión cavidad para microscopía confocal vertical. Orientar el embrión hasta la posición deseada y la tapala agarosa solidificada con agua los peces tricaína que contiene.
    2. Utilice un microscopio de epifluorescencia con un objetivo de 10 X para adquisición de fluorescencia y de transmisión de imágenes secuenciales de todo el embrión. También puede utilizar un microscopio confocal con 40X o 63X objetivos para visualizar la actividad de las células inmunes después de una infección.
  2. Imaging fijado M. embriones abscessus infectados
    1. La eutanasia a los embriones como se describe en 6.1.1 y transferirlos a 1,5 ml tubos de microcentrífuga y fijar los embriones en paraformaldehído al 4% en 1 X PBST durante 2 horas a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Eliminar paraformaldehído por lavado de los embriones dos veces con 1 X PBST durante 10 min.
      NOTA: Para preservar la fluorescencia, embriones fijos deben ser protegidos de la luz.
    2. Para preservar la integridad de los tejidos y de fluorescencia, los embriones se incuban sucesivamente en el aumento de soluciones de concentración de glicerol (10, 20, 30, 40 y 50% diluido en 1 X PBST), para10 min por condición.
      NOTA: Se ha corregido embriones se pueden almacenar durante varios meses en el 50% de glicerol a 4 ° C.
    3. Coloque el embrión embebido en 50% de glicerol en una cámara de observación (Figura 1B) 31.
    4. Imagen usando 40X o 63X objetivos en un microscopio confocal.

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Representative Results

Aunque diversos sitios anatómicos pueden ser inyectados 32, las inyecciones de la vena caudal se utilizan a menudo para generar infección sistémica para análisis posteriores experimentos de supervivencia, incluyendo la determinación de la carga bacteriana, la actividad de la fagocitosis o la formación del cordón. Las inyecciones en los músculos de la cola se utilizan para evaluar el reclutamiento de macrófagos en el sitio de la inyección (Figura 3A). Para investigar y comparar la virulencia de variantes R y S de M. abscessus, suspensiones bacterianas fluorescentes se inyectan en la vena caudal de 30 hpf embriones (Figura 3a) 19. En contraste con la variante S, el morfotipo R induce una infección más robusto y letal en embriones de pez cebra (Figura 3B), caracterizado por el rápido desarrollo de abscesos bacterianos dentro del Sistema Nervioso Central (SNC) (Figura 3C). Inyecciones sistémicas tanto con la variantes R y S llevan a infecciones del SNC y la diferencia enlos fenotipos de patología y virulencia se pueden cuantificar ya sea por microscopía de fluorescencia de observación (Figura 3C), enumerando las UFC por pez (Figura 3D) o mediante la determinación del FPC de imágenes obtenidas (Figura 3E). Es importante destacar que, UFC y determinación FPC se correlacionan y señalan a las cargas bacterianas más grandes para la cepa R que la cepa S a las 3 y 5 dpi. En general, estos resultados apoyan firmemente el pez cebra como modelo relevante y no invasiva de la infección para estudiar la cronología del proceso de infección.

Quizás una de las características más espectaculares fue revelado por microscopía de vídeo que permite la visualización de los cables de serpentina en el SNC de los embriones infectados con la variante R (Figura 4). Gracias a la transparencia óptica de los embriones, la cinética de la formación de R-espinal podría ser monitoreado y la imagen de una manera no invasiva, que ilustra la alta propensión de la variante R para replicar extracellularly. Esta tasa de replicación no controlada, combinada con la destrucción celular / tisular conduce rápidamente al desarrollo de abscesos y la muerte en última instancia larval.

Los macrófagos se sabe que juegan un papel importante durante la infección micobacteriana y en particular por conducción de la formación de granulomas 35. Dos estrategias complementarias se pueden utilizar para estudiar M. abscessus crecimiento / virulencia en embriones de macrófagos-agotado: los procedimientos basados ​​en morfolino-lipo clodronate- y (Figura 5A). La infección de embriones macrófagos empobrecido con la variante R conduce a un aumento masivo de las cargas bacterianas y producción de cordones según lo revelado por video microscopia (Figura 5B), lo que lleva a extremadamente rápida la muerte (100% embriones muertos en 3 ppp; Figura 5C) . Esto indica claramente que se requieren los macrófagos para controlar M. infección abscessus.

Para investigar más a fondo el papel de los macrófagosdurante la infección, los embriones transgénicos específicos que albergan los macrófagos fluorescentes rojas (MPEG1: mCherry) se pueden utilizar 19. La inyección de M. abscessus expresar Wasabi en el músculo de la cola o en la vena caudal induce un marcado reclutamiento de células mieloides, principalmente macrófagos, en el sitio de la infección. Este reclutamiento conduce a la fagocitosis de las bacterias individuales eficiente (Figura 6A-6B). A pesar de la presencia de macrófagos, microscopía confocal revela la aparición de grandes cordones bacterianas que los macrófagos no pueden fagocitar (Figura 6C). En conjunto, estos resultados ponen de relieve un nuevo mecanismo de evasión inmune basado en el papel de acuerdo en la prevención de la fagocitosis por micobacterias.

Figura 3
Figura 3. M. infección abscessus en embriones de pez cebra. (A) (Panel superior) la infección intravenosa realizado inyectando fluorescente M. abscessus (se muestra en blanco) en la vena caudal (flecha 1), posterior a la apertura urogenital, en 30 hpf embriones. (Panel inferior) infección intramuscular realizado mediante la inyección de micobacterias fluorescente (se muestra en blanco) en el músculo de la cola durante un somite (flecha 2), 48 hpf embriones. (BE) 30 hpf embriones por vía intravenosa infectado con M. tdTomato- Las curvas de supervivencia de embriones abscessus (R y S variantes). (B) infectados con ≈ 300 CFU R o S variantes o PBS inyectaron controles (n = 20). Se muestran resultados representativos de tres experimentos independientes. (C) Spatiotemporal visualización de cualquiera de los R o la variante S expresando tdTomato (blanco) en diversos momentos después de la infección señala realizado por imágenes en vivo de fluorescencia. Para cada cepa, una fluorescencia y la transmisión de superposición representante de embriones infectados enteros es sho wn. Los mismos embriones fueron imágenes en 3 y 5 dpi. (DE) cargas bacterianas dentro de los embriones infectados con variantes ya sea R o S (≈ 200 CFU) determinado por CFU contando (D) o mediciones FPC (E). (D) CFU de lisado de embriones individuales en diversos puntos de tiempo después de la infección determinada por placas en Middlebrook 7H10 OADC complementado con el BBL MGIT PANTA. Los resultados se expresan como media ± SD de registro (barras horizontales) CFU por embrión a partir de tres experimentos independientes (n = 5). Mediciones (E) FPC a partir de embriones vivos individuales en diversos puntos de tiempo después de la infección basado en el análisis de partículas usando ImageJ. Los resultados se expresan como media ± SD de registro (barras horizontales) FPC por embrión a partir de tres experimentos independientes (n = 5). Todas las imágenes se obtuvieron con un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara a color digital. t = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
La Figura 4. En grabación vivo de la variante R. 30 hpf embriones infectados por vía intravenosa con la variante R de M. abscessus y fotografiado en varios puntos de tiempo después de la infección para visualizar la progresión de la formación del cordón umbilical. La flecha roja se utiliza como un punto de referencia fijo con el fin de seguir la evolución espacio-temporal de la cuerda. Las imágenes DIC de la parte de la cola que contiene el cable de serpentina creciente están en caja (microscopio equipado con una cámara de color). Las barras de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5. El agotamiento de los macrófagos conduce a aumento de la proliferación espinal. Los embriones (A) se agotan usando el procedimiento de lipo-clodronato o basado en el procedimiento a base de morfolino. (Panel superior) liposomas clodronato encapsulado (lipo-clodronato) se inyectan por vía intravenosa en 24 HPF Tg (MPEG1: mCherry) embriones. Dentro de la circulación, lipo-clodronato se envolvió rápidamente por los macrófagos que se someten a la posterior apoptosis. (Izquierda inferior del panel) La inyección de la preparación morfolino de knock-down de la expresión del gen PU.1 en fecundado Tg (MPEG1: mCherry) huevos de pez cebra. (Panel de la derecha hacia abajo) El agotamiento correcto de los macrófagos en los embriones se comprueba por microscopía de fluorescencia (BC) 30 hpf que contiene macrófagos (+) o de macrófagos-agotado. (-) Embriones (después del tratamiento lipo-clodronato) están infectados con M. abscessus R expresando tdTomato (muestra en blanco). (B) curvas (C) de supervivencia de los embriones que contienen macrófagos o macrófagos-agotado infectadas con ≈300 CFU M. abscessus R (n = 20). Se muestran resultados representativos de tres experimentos independientes. Todas las imágenes fueron adquiridas con un microscopio conectado a una cámara de color. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Comportamiento de los macrófagos en los embriones infectados de forma local o sistémica con M. abscessus (A) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). embriones de pez cebra se infectan por vía intramuscular con Wasabi-expresión de M. abscessus R. Imagi Vivong utilizando un microscopio confocal de visualizar reclutó macrófagos phagocytizing micobacterias individuo (en minutos después de la infección, MPI). Intensidad máxima de la proyección que muestra un intenso reclutamiento de macrófagos (rojo) en el lugar de la inyección (microscopio confocal con agua 40X APO 0,8 objetivo NA). Barra de escala: 20 micras (BC) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). Embriones intravenosa infectados con M. abscessus R expresando Wasabi se fijaron y fotografiada por microscopía confocal (40X) a 4 hpi (B) y 3 dpi (C). (B) de proyección máxima intensidad de los macrófagos (rojo) u otras células mieloides, presumiblemente neutrófilos (flechas), que contiene micobacterias aisladas (verde) cerca del lugar de la inyección (microscopio confocal con aceite 63X APO 1,33 objetivo NA). Barra de escala: 10 m (C) de proyección máxima intensidad que muestra un macrófago (rojo) incapaces de fagocitar un cable (verde) (microscopio confocal con aceite 63X APO 1,33 objetivo NA)..Barra de escala:. 5 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El pez cebra ha surgido recientemente como un excelente sistema modelo vertebrado para estudiar la dinámica de la infección bacteriana usando amplio campo y la imagen confocal en tiempo real 36. La combinación de suspensiones dispersas de micobacterias (protocolo 2.2), junto con los métodos de micro-inyección (protocolo 4) permite que las infecciones sistémicas, reproducibles y posterior seguimiento y visualización de la progresión de la infección con un enfoque especial en las interacciones bacterianas con macrófagos de acogida. La virulencia de M. abscessus in vivo puede ser investigado gracias a la utilización de pez cebra de tipo salvaje de oro 37. Para estudiar las interacciones entre M. abscessus y alojar las células mieloides, varias líneas de pez cebra transgénicos pueden utilizarse como Tg (MPEG1: mCherry) para visualizar los macrófagos 19. Líneas reportero transgénicos adicionales como la que Tg (mpx: GFP) 38 o Tg (lyz: DsRed) 39 wITH sea verde de neutrófilos rojo, respectivamente, también se puede utilizar para hacer frente a la función específica de estos granulocitos en respuesta a la infección.

M. abscessus, y en particular la variante R, exhibe una propensión natural a formar agregados bacterianos masivas 19, evitando así microinyección reproducible. Además, los montones el hecho de que las formas variantes R mucho más grandes que la variante S se opone también a la comparación potencial de los fenotipos de virulencia para las dos variantes isogénicas. El protocolo descrito en el apartado 2 permite obtener homogénea y dispersa M. suspensiones abscessus para microinyección en embriones. Esta preparación se puede aplicar a cualquier otra especie de micobacterias o cepas mutantes que exhiben propiedades de agregación excesivas. Desde la etapa de sonicación puede alterar la capa más externa de la pared celular de micobacterias, se debe tener cuidado para evaluar el impacto de este tratamiento físico sobre la viabilidad bacteriana por correoACH nueva cepa.

Determinación de las cargas bacterianas se basa habitualmente en CFU contando después de la siembra embriones lisadas en medio de agar selectivo en diversos puntos temporales después de la infección, como se describe en el protocolo 6.1. Este procedimiento incluye varias limitaciones: ya que los animales son sacrificados, cada embrión (o grupo de embriones) se pueden utilizar para la determinación de un solo punto de tiempo. Además, este método sigue siendo inexacta debido a una gran proporción de bacterias que se mataron y / o se pierden durante la lisis, diluciones seriadas subsiguientes, o principalmente por la formación de grumos. Contando el UFC es también una tarea laboriosa. Como alternativa, el protocolo 6.2 describe un método eficiente para cuantificar la M. carga abscessus que incluye etapas de manipulación limitados, basado en el análisis de imágenes fluorescentes de los embriones infectados con la cuantificación de píxeles, como se desarrolló originalmente para M. marinum 40,41. Este método FPC basado en el análisis de partículas, muestra una buena correlación wITH los conteos de CFU. Del mismo modo, mediante la combinación de la microscopía de fluorescencia y la cuantificación, los cambios relativos en el número de células inmunes innatas por embrión se pueden cuantificar mediante análisis de imagen usando líneas transgénicas adecuadas.

Embriones de pez cebra se pueden utilizar para evaluar el papel de célula inmune durante la infección y el agotamiento de los macrófagos fue encontrado para afectar negativamente a la supervivencia de acogida en respuesta a M. infección abscessus. Agotamiento específico de macrófagos se puede generar de manera eficiente utilizando el procedimiento basado lipo-clodronato-(protocolo 5.1) o el procedimiento a base de morfolino (protocolo 5.2). Sin embargo, ya que la presencia de los macrófagos es crucial para el establecimiento y el mantenimiento del sistema vascular y para el desarrollo embrionario correcta, se recomienda para la ablación de la producción de macrófagos a las 24 hpf utilizando lipo-clodronato.

El embrión de pez cebra aparece como un modelo único para estudiar M. infecciones abscessus y el papel de extracelularular acuerdo como una estrategia de subversión del sistema inmunológico. Si determinantes control de grabación en M. abscessus se puede identificar, podrían conducir al desarrollo de opciones terapéuticas innovadoras. Vincular el uso de pez cebra, junto con tecnologías de alto rendimiento innovadores 42 también se abre el campo para el descubrimiento de fármacos y nuevos enfoques farmacológicos contra este patógeno resistente a los medicamentos.

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Acknowledgments

Los autores agradecen a K. Kissa útil para los debates y para proporcionar lipo-clodronato y L. Ramakrishnan por el generoso regalo de pTEC27 y pTEC15 que permiten la expresión de tdTomato y Wasabi, respectivamente. Este trabajo forma parte de los proyectos de la Agencia Nacional de Investigación VII Programa Marco de la Comunidad Europea (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 y DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) y (FP7-PEOPLE-2011-ITN) en virtud de acuerdo de subvención no. PITN-GA-2011-289209 por Marie-Curie de Formación Inicial Red FishForPharma. También queremos agradecer a la Asociación de Gregory Lemarchal y Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) para la financiación de CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

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