Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dechiffrera och Imaging patogenes och Cording av Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus är en framväxande patogen som orsakar ett brett spektrum av kliniska syndrom hos människor. Dessa inkluderar hudinfektioner samt svåra kroniska lunginfektioner, oftast påträffas i nedsatt immunförsvar och patienter med cystisk fibros 1,2,3,4. M. abscessus betraktas också som en stor snabbväxande mycobakteriearter ansvarar för nosokomiala och iatrogena infektioner hos människor. Dessutom betonade flera färska rapporter möjligheten att M. abscessus kunde korsa blod-hjärnbarriären och inducera viktiga lesioner i det centrala nervsystemet (CNS) 5,6. Trots att en snabb odlare, M. abscessus utställningar också flera patogena funktioner som är relaterade till de av Mycobacterium tuberculosis, inklusive förmågan att tiga i flera år inom granulomatösa strukturer och generera Kaseös lesioner i lungorna 7. Mer oroväckande är den låga sensitivity för M. abscessus mot antibiotika, vilket gör dessa infektioner extremt svåra att behandla som leder till en väsentlig terapeutisk felfrekvens 8,9. Det viktiga hot av denna art är främst dess inneboende resistens mot antibiotika, vilket är av stor betydelse i offentliga vårdinrättningar 10 och en kontraindikation för lungtransplantation 11.

M. abscessus visar släta (S) eller grova (R) koloni morphotypes som leder till olika kliniska resultat. I motsats till S-stammen, R bakterier har en tendens att växa ände mot ände, vilket leder till ett rep eller en lina liknande struktur 12,13. Flera oberoende studier baserade på antingen cellulära eller djurmodeller avslöjade hyper virulens fenotyp av R morphotype 14,15. Från epidemiologiska studier, de mest allvarliga fallen av M. abscessus lunginfektioner verkar vara förknippade med R-varianter 16 som är den enda variant somhar sett att bestå i flera år i en infekterad värd 3. Den morphotype skillnaden är beroende av närvaro (i S) eller förlust (i R) av ytan associerade glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund av de inneboende begränsningarna hos de för närvarande tillgängliga cellulära / djurmodeller för att studera M. abscessus infektion, vår kunskap om de patofysiologiska händelser R eller S-varianter förblir oklar. Infektion av immunkompetenta möss via intravenösa eller aerosoler vägar leder till övergående kolonisation, hindrar användningen av möss för att studera ihållande infektioner och för in vivo drogresistensbestämning 17. Därför utvecklar djurmodeller kan bli föremål för manipulation av värdsvaret är en stor utmaning. I detta sammanhang har icke-däggdjurs modeller infektions nyligen utvecklats, inklusive Drosophila melanogaster 18 som erbjuder flera fördelar såsom kostnad, snabbhet och etiska godtagbarhet over musmodellen. Zebrafisk (Danio rerio) modell av infektion har även undersökts för att visualisera, icke-invasiv bildbehandling, utvecklingen och kronologi över M. abscessus infektion hos ett levande djur 19. Det är viktigt att en proof of concept konstaterades också att visa sin lämplighet för antibiotika bedömningar in vivo mot M. abscessus 17,20.

Zebrafisk har använts i stor utsträckning under de senaste två decennierna för att studera samspelet mellan olika patogener och värdens immunsystem 21. Den ökande framgången för denna alternativa ryggradsdjur modell bygger på stora och unika möjligheter som motiverade och validerade dess användning för en bättre förståelse av många virus- och bakterieinfektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Till skillnad från de flesta andra djurmodeller, zebrafisk embryon är optiskt transparenta, vilket gör att icke-invasiv fluorescens avbildning 30. Detta utmärs ledde till studera M. abscessus infekterade zebrafisk embryon med oöverträffade detaljer, som kulminerade med beskrivningen av extracellulära ligt, som representerar ett exempel på bakteriell morfologisk plasticitet. Cording representerar en ny mekanism för underminering av immunsystemet och en nyckelmekanism främja patogenes av akut M. abscessus infektion 19.

Denna rapport beskriver nya verktyg och metoder med hjälp av zebrafisk embryot att dechiffrera patofysiologiska drag av M. abscessus infektion och att studera intima samspelet mellan baciller och det medfödda immunförsvaret. Först, en detaljerad mikroinjektion protokoll som inkluderar hanterande av den bakteriella ympen, embryo förberedelser, och infektion i sig, presenteras. Metoder särskilt anpassat för att bedöma M. abscessus virulens genom att mäta olika parametrar, såsom värd överlevnad och bakteriell belastning, presenteras. Särskilt fokus ges på huratt övervaka, vid en spatiotemporal nivå, ödet och progression av infektionen och värdens immunsvar på M. abscessus hjälp av video mikroskopi. Dessutom, för att undersöka bidrag och roll makrofager under M. abscessus infektion, metoder generera makrofager-utarmat embryon (med antingen genetically- eller kemiskt baserade metoder) beskrivs. Slutligen protokoll visualisera specifika interaktioner med makrofager eller neutrofiler använder antingen fasta eller levande embryon dokumenteras.

Syftet med denna rapport är att stimulera ytterligare undersökningar för att kasta nytt ljus i M. abscessus virulens mekanismer och särskilt den roll som ligt i upprättandet av en akut och okontrollerad infektionsprocessen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafisk experimentella procedurer måste uppfylla de relevanta institutionella och statliga regleringar. För den aktuella studien har zebrafisk experiment gjordes vid universitetet Montpellier, enligt EU: s riktlinjer för hantering av försöksdjur (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) och godkänts under beteckningen CEEA-LR-13007.

1. Beredning av reagenser och mikroinjektion Equipment

  1. Förbered fisk vatten genom att lösa 0,06 g Direkt Ocean Havssalt i en L destillerat vatten 31, sedan autoklav för att sterilisera (120 ° C under 20 minuter) och förvara vid 28,5 ° C i upp till en månad.
  2. Bered metylenblått lösning genom upplösning av 1 g metylenblått i 1 L destillerat vatten. Tillsätt 300 pl av metylenblåttlösning i en L fisk vatten för att erhålla blå fisk vatten, sedan autoklav för att sterilisera och förvara vid 28,5 ° C i upp till en månad.
    OBS: additipå metylenblått i fisk vatten förhindrar mögeltillväxt.
  3. Framställning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS)
    1. Bered en 10 X PBS förrådslösning genom upplösning av 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg KCl och 78,894 g NaCl i 1 L destillerat vatten och justera pH till 7,0 med HCl. För att erhålla en X PBS, späd 100 ml av 10 X PBS-lösning i 900 ml destillerat vatten och autoklav under 20 minuter vid 120 ° C för att sterilisera.
    2. Lägg 0,05% Tween 80 för att erhålla en X PBST och förvara vid rumstemperatur under upp till 1 år.
  4. Förbered Oljesyra Dextros Katalas (OADC) anrikning genom upplösning 8,5 g NaCl, 50 g bovint serumalbumin, 20 g D-glukos, 40 mg Katalas från bovin lever och 0,5 g oljesyra i en L destillerat vatten och filtrera sterilisera lösningen och förvara den vid 4 ° C i upp till 6 månader.
  5. Bered 100 ml av etyl-3-aminobensoat metansulfonsyra (tricaine) förrådslösning, genom att lösa upp 400 mg tricaine pulver i 97,9 ml destillerat vatten. Lägg 2,1 ml av 1 M Tris (pH 9) för att justera pH-värdet vid 7,0 och lagra lösningen vid -20 ° C.
  6. Förbered microcapillary injektionsnålar genom att dra borosilikatglas kapillärer (1mm OD X 0,78 mm ID) med en mikropipett avdragare enhet med följande inställningar: Lufttryck 650; Värm 999; Drag 50; Hastighet 80; Tid 200.
  7. Bered en 1,5% agar lösning i blå fisk vatten och häll 25 ml smält agar i 100 mm petriskålar. På toppen av det smälta ägarn, placera hemlagad formar för att avtryck specifika kanaler. "V" -formade kanaler används för att positions embryon medan "U" -formiga används för ägg (fig 1) 31. När stelnat, avlägsna noggrant avtryck.
    OBS: Täck ägarn med blå fisk vatten för att undvika uttorkning och förvara vid 4 ° C i upp till 2 månader.

Figur 1 Figur 1. Positioneringskammare för zebrafisk injektioner. (A) U-formade kanaler för ägg (till vänster) och V-formade kanaler för embryon (höger panel). Zebrafisk ägg / embryon läggs i kanalerna och inriktade längs samma axel. (B) Visningskammare för mikroskopisk observation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Upprättande och Lagring av M. abscessus Inokulat

  1. M. abscessus tillväxtbetingelser
    1. Plate ut M. abscessus från en -80 ° C glycerolstam på en Middle 7H10-agar innehållande 10% av OADC och 0,5% glycerol (7H10 OADC) och kompletterades med det lämpliga antibiotikumet beroende på resistensmarkören som bärs av vektorn som kodar för det fluorescerande proteinet. Inkubera plattornavid 30 ° C under 4-5 dagar.
    2. Plocka upp en fluorescens-positiva mykobakteriellt koloni och inokulera en ml Middlebrook 7H9-buljong kompletterad med OADC, 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / T) med den erforderliga antibiotikumet i ett 15 ml sterilt plaströr. Inkubera vid 30 ° C under en vecka utan skakning.
      OBS: Tween 80 begränsar klumpar och bakteriell aggregering.
    3. Resuspendera förodling erhållen i 2.1.2 i 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T i 150 cm 2 vävnadsodlingsflaskor till en slutlig 0,1 OD 600 (motsvarande cirka 5,10 7 bakterier / ml) och inkubera vidare vid 30 ° C under 4 dagar för erhållande av en exponentiellt växande kultur (OD 600 = 0,6 till 0,8).
      OBS: För att minimera klumpar, särskilt när det gäller den grova varianten, ska inkubation inte överstiga 5 dagar. Både släta och grova varianter visa en liknande tillväxt.
  2. Beredning av M. abscessus inokulat60;
    OBS: På grund av hög benägenhet grov M. abscessus att bilda stora aggregat och att producera sladdar, är nödvändigt med en specifik behandling för att skapa homogena och kvantitativt kontrollerade inokula före microinjections i embryon. Denna behandling appliceras också att släta bakterier som producerar aggregat, om än i mindre utsträckning än den grova stammen.
    1. Skörd exponentiellt växande kulturer från 150 cm 2 vävnadsodlingskolvar genom centrifugering vid 4, 000 xg under 15 min vid RT i en 50 ml steril plaströr och återsuspendera den bakteriella pelleten i 1 ml 7H9 OADC / T. Alikvotera 200 il bakteriesuspensioner till 1,5 ml mikrocentrifugrör.
      OBS: Att arbeta med små volymer i 1 ml sprutor krävs för att uppnå mycket homogena suspensioner.
    2. Homogenisera de bakteriesuspensioner med 26-G nål (15 upp och ner sekvenser), Sonikera tre gånger under 10 sekunder (med 10 sek pauser mellan varje sonication seföljd) under användning av ett vattenbad sonikator. Tillsätt 1 ml 7H9 OADC / T och vortex en kort stund. Centrifugera 3 minuter vid 100 x g.
    3. Försiktigt samla mykobakterier innehållande supernatanter att undvika klumpar och slår samman homogena suspensioner i en 50 ml sterilt plaströr.
    4. Kontrollera visuellt med avseende på närvaro av eventuella återstående bakterie aggregat.
      OBS: Om aggregat är fortfarande närvarande, gå vidare till en ytterligare centrifugeringssteg vid 100 xg under 2 minuter, och samla supernatanten.
    5. Centrifugera suspensionen vid 4000 xg under 5 min, suspendera pelleten i 200 pl 7H9 OADC / T och gå vidare till injektionen.
    6. Utvärdera den slutliga bakteriekoncentrationen genom plätering serieutspädningar (i 1 x PBST) på 7H10 OADC agar och räkna kolonibildande enheter (CFU) efter 4 dagars inkubation vid 30 ° C. CFU bör bestämmas för varje nytt parti.
    7. Förbered frysta inokulat lager genom att lagra 5 l alikvoter vid -80 & #176 C.
      OBS: CFU bedömning av -80 ° C frysta portioner är en förutsättning för att fastställa det exakta antalet livskraftiga bakterier som frysning / upptining kan påverka bakteriell livskraft ympen. Dessa frysta inocula är redo att användas för efterföljande injektioner. Eftersom alla alikvoter innehåller samma antal av CFU, tillåter de injicera bakterier på ett reproducerbart sätt från ett experiment till ett annat.
  3. Inoculum kvalitetskontroll
    OBS: Ziehl-Neelsen färgning (specifikt för mykobakterier) kan användas för att jämföra kvaliteten på de bakteriesuspensioner före och efter homogenisering förfaranden som beskrivs i 2.2.
    1. Spot och bredde ut en droppe av den homogeniserade bakteriesuspensionen på en glasskiva och låt den torka helt, fastställa smeta under minst 30 minuter på en varm platta inställd på 65-70 ° C och fläck med hjälp av en Ziehl-Neelsen färgningsprotokollet .
    2. Observera bakterie smeta med ett mikroskop med hjälp av en 100X objektiv och jämför med ett utstryk av ett icke bearbetat bakteriesuspensionen (Figur 2).

Figur 2
Figur 2. Framställning av spridda M. abscessus inokulat. Ziehl-Neelsen färgning av R eller S varianter odlas på buljongmedium innan någon behandling (övre paneler) eller efter behandling (lägre paneler) för att minska storleken och antalet mykobakteriella aggregat (successiva steg syringing, ultraljud och dekantering) . Bakterier observerades med ett mikroskop med 100 x APO olja 1,4 NA mål). Skala barer:. 20 um klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

3. Förbereda Zebrafish embryon

  1. Lek- och uppsamling av zebrafisk ägg
    1. Dagen före spantsätta, ras vuxna zebrafisk genom att placera 2 hanar och en hona (vanligtvis en 2: 1-förhållande optimal gödslingsmängden) i en avelskammare, som består av ett separat akvarium med en insamling av ägg korg 31.
      OBS: Ägg insamlingskorgar används för att skydda äggen från att bli uppätna av föräldrarna och underlätta ägg skörd.
    2. Vid en HPF, skörd ägg och bara korrekt utvecklade embryon i en 100 mm petriskål fylld med 25 ml blå fisk vatten (max 100 embryon per fat) och hålla dem vid 28,5 ° C. Icke-befruktade ägg kastas.
  2. Beredning av zebrafisk embryon för injektioner
    1. Vid ungefär 24 timmar efter befruktning (HPF), dechorionate embryon med fina pincett i en 100 mm petriskål och hålla dem vid 28,5 ° C.
    2. Samla 30-48 HPF embryon med hjälp av en pipett och överföra dem till ett "V" -format positionering kammare fylld med 25 ml av fisk vatten innehållande 270 mg / L tricaine.Lägg embryon korrekt i kanalerna med hjälp av en hemmagjord microspets verktyg (hemlagad klippta mikro lastare tips) optimerad för en enklare mikro manipulation.
      OBS: Orientera ryggsidan nedåt för intravenösa injektioner i svansvenen eller ryggsidan uppåt för svansen muskel injektioner.

4. Micro-injektionsproceduren

OBS! Mikroinjektion förfarande för M. abscessus liknar den som beskrivits tidigare för M. marinum injektioner 32. För att bedöma kronologi över M. abscessus infektion (överlevnad, bakterie laster, kinetisk och egenskaper infektion), är injektioner i kaudalvenen 30 HPF embryon föredra. För att visualisera rekrytering av immunceller, är injektioner görs i lokala webbplatser som är i svans muskler i 48 HPF embryo.

  1. Späd det mykobakteriella inokulumet i 1 x PBST (beroende på antalet CFU tilladministreras såsom bestäms i steg 2.2.6), innehållande 10% röd fenol för att kontrollera korrekt injektion.
  2. Ladda en microcapillary injektionsnål med 5-10 il av bakterie inokulum med hjälp av en microloader spets, anslut mikroinjektion nålen i innehavaren av den tredimensionella mikromanipulator ansluten till injektorn och bryta upp nålen med fina pincett för att få en öppningsdiameter av 5 till 10 | im.
  3. Kalibrera injektionsvolym genom att justera mikroinjektion trycket (20-50 hPa) och tid (0,2 sek).
    OBS: Den erforderliga injektionsvolymen kalibreras genom visuell bestämning av diametern hos en droppe ut in äggulan i ett embryo.
  4. För kaudalvenen injektion, placera embryo med den ventrala sidan är vänd mot nålen (som beskrivs i avsnitt 3.2.2) och placera nålspetsen nära urogenitala öppningen, med inriktning på kaudalvenen, och tryck försiktigt spetsen av nålen i embryot tills den precis genomborrar caudal ven regionen. Leverera den önskade volymen bakteriepreparat, vanligtvis 1-3 nl innehållande cirka 100 CFU / nl.
  5. För intramuskulär injektion, placera embryot med ryggsidan vänd mot nålen (som i avsnitt 3.2.2), placera nålen över en somit och injicera en liten volym (1 nl) av inokulat.
    OBS: När det gäller kaudalvenen injektioner, intramuskulära infektioner är också svårt att utföra. Försiktighet måste vidtas för att undvika en överbelastning som kan skada de omgivande vävnaderna.
  6. Vid slutet av injektionsproceduren, styra storleken på inokulatet genom att injicera samma volym av bakteriesuspension i en droppe steril PBST följt av utstrykning på 7H10 OADC och räkning av CFU. Omkring 100 embryon kan injiceras med en nål.
    OBS: Eftersom grov M. abscessus får fortsätta att bilda aggregat i nålen, injektioner måste göras omedelbart efter framställning av inokulat.
  7. Överför infekterade fish individuellt i 24-brunnars plattor innehållande 2 ml / brunn fisk vatten och inkubera vid 28,5 ° C. Embryon som injicerats med 1-3 nl 1 x PBST kan användas som kontroller.
  8. Korrekt infektion av fluorescerande bakterier i embryon övervakas med hjälp av ett fluorescensmikroskop.

5. Generering av Macrophage utarmade embryon

OBS: Selektiv utarmning av makrofager från vävnader används för att undersöka deras bidrag och roll under infektion. För att visualisera rätt utarmning av makrofager, är det rekommenderat att använda en transgen linje med fluorescerande makrofager, där mCherry specifikt uttrycks under kontroll av makrofager specifika MPEG1 promotorn 19.

  1. Lipo-klodronat baserade förfarandet
    OBS! Lipo-klodronat förfarande tillåter en selektiv utarmning av makrofager från vävnader (men inga neutrofiler) 19. Denna förening innebär varken förändrar överlevnaden av embryon eller affect integriteten av bakterier. Ett detaljerat protokoll för att förbereda liposominkapslad klodronat har tidigare 33 rapporterats.
    1. Vid 24 HPF, dechorionate embryon och överföra dem till ett "V" -format injektion skål fylld med fisk vatten kompletterat med tricaine att upprätthålla embryon i en sövd tillstånd fram till slutet av injektionsproceduren som beskrivs i 3.2.2. Orientera ryggsidan nedåt.
    2. Ladda en microcapillary injektionsnål med liposominkapslad klodronat (lipo-klodronat), anslut mikroinjektion nålen i innehavaren av tredimensionella mikromanipulator och bryta upp nålen med fina pincett för att få en spetsöppningsdiameter på 10 nm.
    3. För att kalibrera injektionsvolym, justera mikroinjektion trycket till 20 hPa och insprutningstiden till 0,2 sek. Placera nålspetsen nära urogenitala öppningen, med inriktning på kaudalvenen, och tryck försiktigt spetsen av nålen iembryo tills det bara tränger kaudalvenen regionen och leverera önskad volym av lösning (2-3 nl, 3 gånger).
      OBS! Lipo-klodronat suspension är mycket klibbiga och bör virvlas före injektion för att undvika att kärlsystemet och dödande av embryot. Det är viktigt att gå vidare till flera på varandra följande injektioner av små volymer.
    4. Överför embryon i 100 mm petriskålar innehållande fisk vatten och hålla dem vid 28,5 ° C tills infektion.
    5. Styra den korrekta utarmning av makrofager genom fluorescensmikroskopi.
      OBS: Komplett makrofag utarmning är effektiv för 4 dagar efter lipo-clodoronate administration.
  2. Morfolino-baserade förfarande
    1. Dagen före leken, ras vuxna zebrafisk genom att placera 2 hanar och en hona åtskilda av en plastbarriär i en avelskammare.
    2. Nästa dag, ≈ 30 min efter att ljuset tänds i zebrafisk anläggningen, ta bort barriären som separerarmän och kvinnor. Vänta ca 20 min efter början av leken för att optimera gödslingen. Skörda äggen och bromsa deras utveckling genom att överföra dem i en 100 mm petriskål fylld med kallt blå fisk vatten (4 ° C).
      OBS: Styrningen av leken är avgörande för morpholinos-baserade experiment. Morpholinos kan endast injiceras i äggen upp till fyra celler skede.
    3. Samla äggen med hjälp av en pipett och sätta ner äggen i "U" -format injektions kammare fylld med kallt blå fisk vatten och blockera ägg i kanalerna med hjälp av en hemmagjord microloader spets verktyg.
    4. Förbered pu.1 morfolino lösning innehållande 10% av röd fenol, såsom tidigare beskrivits 19. Ladda en microcapillary injektionsnål med morpholino preparatet och anslut mikroinjektion nålen i innehavaren av tredimensionella mikromanipulator, sedan bryta spetsen av nålen med fina pincett för att obtaina spetsöppningsdiameter av 5 till 10 | im.
    5. För att kalibrera injektionsvolym, justera mikroinjektion trycket till 20-50 hPa och insprutningstiden till 0,2 sek. Placera nålspetsen nära ägget och tryck försiktigt spetsen av nålen genom chorion i ägget och leverera önskad morpholino lösningsvolymen, typiskt 3-5 nl.
    6. Efter mikroinjektion, överföra ägg i en 100 mm petriskål i fisk vatten och inkubera vid 28,5 ° C tills infektionen börjar söka.
    7. Analysera rätt (komplett) utarmning av makrofager i pu.1 morphants genom fluorescerande mikroskopi vid 30 till 48 HPF..
      OBS! Beroende på koncentrationen injiceras, kan p U.1 morpholinos också påverka antalet tidiga neutrofiler. För att bekräfta rätt utarmning av makrofager utan att ändra antalet neutrofiler, är det rekommenderat att använda en dubbel transgen zebrafisk linje med fluorescerande makrofager och neutrofiler (med GFPuttryck specifikt drivs av mpx promotorn) 19.

6. Bakteriell Burden Kvantifiering

  1. Fastställande av CFU uppräkning
    1. Vid den önskade tidpunkten, samla grupper av infekterade embryot (5 per förhållanden) i 1,5 ml mikrocentrifugrör (1 embryo / rör), Cryo-söva embryona efter inkubering på is under 10 min och avliva med användning av en överdos av tricaine (300- 500 mg / I)
    2. Tvätta embryona med sterilt vatten två gånger och fördela dem på ett nytt rör, lyse varje embryo med 2% Triton X-100 utspätt i 1 x PBST med hjälp av en 26-G nål och homogenisera suspensionen tills fullständig lys. Centrifugera suspensionen och suspendera pelleten i 1 x PBST med 0,05% Tween 80. Serieutspädningar av homogenaten stryks ut på Middle 7H10 OADC och kompletteras med BBL MGIT PANTA, som rekommenderas av leverantören.
      OBS: M. abscessus vara mer mottagliga för NaOH treatment än M. marinum, sanering av fisk lysat utan att påverka M. abscessus tillväxt kan med framgång uppnås med hjälp av BBL MGIT PANTA antibiotika cocktail.
    3. Inkubera plattorna under 4 dagar vid 30 ° C och räkna kolonier.
  2. Fastställande av fluorescens Pixel Count (FPC) mätningar i levande embryon
    OBS: För att bestämma bakterie laster via fluorescensemission, är seriebilder av infekterade embryon förvärvats och fluorescensintensitet mätt med FPC (identifiering av bakterier genom partikelanalys) med hjälp av en hemmagjord makro utvecklats för ImageJ freeware. En partikel analys kräver en binär svartvit bild som bygger på en tröskelområde som gör det möjligt att diskriminera den fluorescerande signalen av intresse från bakgrunden.
    1. Vid den önskade tidpunkten, tricain-söva infekterade embryon (5-10 per tillstånd) i 35 mm petriskålar som beskrivs i 3.2.2.
    2. Avlägsna vatten och submeRGE embryon och hela diskytan med 1% låg smältpunkt agaros i fisk vatten, sedan justera i sidled embryona. Täck stelnade agarosen med fisk vatten innehållande tricaine.
    3. Förvärva fluorescens bilder av hela embryo med hjälp av en epifluorescensmikroskop med en 10 x mål.
      OBS! Fluorescens bild Förvärvet är ett kritiskt steg i FPC mätningar förfarandet. Det är viktigt att använda en kalibrerad bildskärm med en färgkalibrering sond. Justera den optimala tiden för exponering för att erhålla en minimal bakgrunds under förvärv förhindrar mättnad av signalen. Bilderna måste vara i en 8-bitars TIFF-format. Identiska inställningar behålls under hela experimentet för kvantitativa syften.
    4. Ta försiktigt agarosen från embryon med en hemlagad microloader spets verktyg. Dessa embryon kan användas för efterföljande analyser vid behov. Före kvantifiering av bakteriehalten, varje bild skall kvalitet kontrolleras. Till ennalyze bilderna och konvertera fluorescensintensiteten i FPC per fisk, öppna ImageJ freeware.
      OBS: FPC värdet återspeglar den bakteriella bördan som tidigare visats med hjälp av M. marinum 34.
    5. Bestäm krävs tröskeln för bildanalys med hjälp av en bild av en icke-infekterade embryo (flera kontroll embryon kan användas för att erhålla ett genomsnittligt gränsvärde). Gå till Bild → Justera → Threshold och sedan flytta den nedre reglaget i tröskel fönstret till höger tills bakgrunden blir helt svart (dvs att erhålla en bakgrund bör vara noll). Anteckna motsvarande värde.
    6. Inom Bild J öppnar FPC makrot (kompletterande fil) och följ anvisningarna: leta upp mappen med bilder som ska mätas och ange sedan det tröskelvärde som tidigare fastställts och klicka på "OK".
      OBS: Makrot subtraherar automatiskt i bakgrunden. Ett tröskelvärde anbringas därefter. Fluorescerande signaler är identirade följande analys partikeln.
    7. Kopiera och klistra in data från sammanfattningen fönstret till önskad programvara för dataanalys.
      OBS: Till skillnad från CFU bestämningsmetoden är FPC-metoden icke-invasiv och tillåter återanvända embryona för efterföljande analyser och, viktigare, övervakning dynamiken / kinetiken hos den bakteriella belastningen på individuell basis. Det är därför, gör det möjligt att avsevärt minska antalet djur i samförstånd med etiska regler.

7. Imaging M. abscessus- infekterade Embryon

  1. Live avbildning av M. abscessus infektion
    1. Mount tricaine-sövda embryon (se 3.2.2) i 1% låg smältpunkt agaros i en 35 mm petriskål före epifluorescensmikroskopi observationer. Använd ett glas nedre skålen för inverterad konfokalmikroskopi eller i en enda hålrum depression bild för upprätt konfokalmikroskopi. Orientera embryot till önskad position och täckden stelnade agarosen med fisk vatten innehållande tricaine.
    2. Använd en epifluorescensmikroskop med en 10 x mål för sekventiella fluorescens förvärv och transmissions bilder av hela embryot. Alternativt kan du använda en konfokalmikroskop med 40X eller 63x mål att visualisera aktiviteten hos immunceller efter en infektion.
  2. Imaging fast M. abscessus infekterade embryon
    1. Euthanize embryona enligt 6.1.1 och överföra dem till 1,5 ml mikro-centrifugrör och fixera embryona i 4% paraformaldehyd i ett X PBST under 2 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. Avlägsna paraformaldehyd genom tvättning embryona två gånger med 1 x PBST under 10 minuter.
      OBS: För att bevara fluorescens måste fasta embryon skyddas från ljus.
    2. För att bevara integriteten hos vävnader och fluorescens, är embryon inkuberas successivt öka glycerol koncentrations lösningar (10, 20, 30, 40 och 50% utspädd i 1 x PBST), för10 min per tillstånd.
      OBS: Fast embryon kan lagras under flera månader i 50% glycerol vid 4 ° C.
    3. Lägg embryot inbäddade i 50% glycerol i en visningskammare (figur 1B) 31.
    4. Bild med 40X eller 63x mål på ett konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Även olika anatomiska platser kan injiceras 32, är kaudalvenen injektioner ofta används för att generera systemisk infektion för efterföljande analyser inklusive överlevnad experiment, bakteriell belastning beslutsamhet, fagocytos aktivitet eller sladd bildning. Injektioner i svansmusklerna används för att bedöma rekryteringen av makrofager på platsen för injektion (figur 3A). För att undersöka och jämföra virulens R- och S-varianter av M. abscessus är fluorescerande bakteriesuspensioner injiceras i svansvenen 30 HPF embryon (Figur 3A) 19. I motsats till S-varianten, inducerar R morphotype en mer robust och dödlig infektion i zebrafiskembryon (Figur 3B), kännetecknad av den snabba utvecklingen av bakteriella abscesser inom det centrala nervsystemet (CNS) (figur 3C). System injektioner med både R- och S-varianter leder till CNS-infektioner och skillnaden ide patologi och virulens fenotyper kan kvantifieras antingen genom fluorescensmikroskopi observation (fig 3C), genom att räkna upp CFU per fisk (fig 3D) eller genom bestämning av FPC av förvärvade bilder (figur 3E). Viktigt, CFU och FPC beslutsamhet är korrelerade och påpeka för större bakterie belastningar för R-stammen än S-stammen vid 3 och 5 dpi. Sammantaget dessa resultat stöder starkt zebrafisk som en relevant och icke-invasiv modell för infektion för att studera kronologi infektionsprocessen.

Kanske en av de mest spektakulära inslagen avslöjades av video-mikroskopi som gör det möjligt att visualisera ormliknande sladdar inom CNS av embryon infekterade med R-variant (Figur 4). Tack vare den optiska transparensen av embryona, kan den kinetiska för R-sladd bildning övervakas och avbildas på ett icke-invasivt sätt, som illustrerar den höga benägenheten av R-variant för att replikera extracellularly. Denna okontrollerade replikering hastighet, kombination med cellulär / vävnads förstörelse leder snabbt till utvecklingen av bölder och slutligen larv död.

Makrofager är kända för att spela en viktig roll under mykobakteriell infektion och i synnerhet genom att driva granulombildning 35. Två kompletterande strategier kan användas för att studera M. abscessus tillväxt / virulens i makrofager utarmade embryon: den lipo-clodronate- och morfolino-förfaranden (Figur 5A). Infektion av makrofager utarmat embryon med R variant leder till en massiv ökning av bakterie laster och rep produktion avslöjades av video-mikroskopi (Figur 5B), vilket leder till extremt snabb död (100% döda embryon vid 3 dpi, figur 5C) . Detta visar tydligt att makrofager är skyldiga att kontrollera M. abscessus infektion.

För att ytterligare undersöka vilken roll makrofagerunder infektion, specifika transgena embryon hyser röda fluorescerande makrofager (MPEG1: mCherry) kan användas 19. Injektion av M. abscessus uttrycka Wasabi i svansen muskel eller i kaudalvenen inducerar en markant rekrytering av myeloida celler, huvudsakligen makrofager, vid stället för infektion. Denna rekrytering leder till en effektiv fagocytos av enskilda bakterier (Figur 6A-6B). Trots närvaron av makrofager, avslöjar konfokalmikroskopi uppkomsten av stora bakterie sladdar som makrofager inte kan fagocytera (figur 6C). Sammantaget markerar dessa fynd en ny mekanism för immun skatteflykt baserat på sig rollen som ligt att förebygga mykobakteriella fagocytos.

Figur 3
Figur 3. M. abscessus infektion i zebrafiskembryon. (A) (Top panel) Intravenös infektion som utförs genom att injicera fluorescerande M. abscessus (visas i vitt) i kaudalvenen (pil 1), bakre det urogenitala öppningen i 30 HPF embryon. (Lower panel) Intramuskulär infektion som utförs genom att injicera fluorescerande mykobakterier (visas i vitt) i svansen muskeln över en somit (pil 2), i 48 HPF embryon. (BE) 30 HPF embryon intravenöst infekterade med tdTomato- M. abscessus (R- och S-varianter). (B) Överlevnadskurvor av embryon infekterade med ≈ 300 CFU antingen R- eller S-varianter eller PBS injicerades kontroller (n = 20). Representativa resultat från tre oberoende experiment visas. (C) Spatiotemporal visualisering av antingen R- eller S-varianten uttrycker tdTomato (vit) vid olika tider pekar efter infektion utfördes genom fluorescens realtidsundersökning. För varje stam, är en representativ fluorescens och överföring lagring av hela smittade embryon sho wn. Samma embryon avbildades vid 3 och 5 dpi. (DE) Bakteriella laster inom embryon som infekterats med antingen R- eller S-varianter (≈ 200 CFU) bestäms av CFU räkna (D) eller FPC mätningar (E). (D) CFU från lysat av enskilda embryon vid olika tidpunkter efter infektion bestämdes genom utstrykning på Middlebrook 7H10 OADC kompletterat med BBL MGIT PANTA. Resultat uttrycks som logaritmiska medelvärdet ± SD (horisontella staplar) CFU per embryo från tre oberoende experiment (n = 5). (E) FPC mätningar från enskilda levande embryon vid olika tidpunkter efter infektion baserad på partikelanalys med ImageJ. Resultat uttrycks som logaritmiska medelvärdet ± SD (horisontella staplar) FPC per embryo från tre oberoende experiment (n = 5). Alla bilder erhölls med en epifluorescensmikroskop utrustat med en digital färgkamera. t = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. In vivo cording av R-varianten. 30 HPF embryon infekterade intravenöst med R variant av M. abscessus och avbildas vid olika tidpunkter efter infektion för att visualisera progressionen av sladden bildning. Den röda pilen används som en fast referenspunkt för att följa Spatiotemporal utvecklingen av sladden. DIC bilder av en del av svansen som innehåller den växande serpentin sladden är inramade (mikroskop utrustat med en färgkamera). Skala barer:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

0 / 53130fig5.jpg "/>
Figur 5. Förbrukning av makrofager leder till ökad sladd spridning. (A) Embryon utarmas med hjälp av lipo-klodronat baserade förfarandet eller morfolino baserade förfarandet. (Ovanpanelen) klodronat inkapslade liposomer (lipo-klodronat) injiceras intravenöst i 24 HPF Tg (MPEG1: mCherry) embryon. Inom cirkulationen är lipo-klodronat snabbt uppslukas av makrofager som genomgår efterföljande apoptos. (Vänster-lägre panelen) Injektion av morpholino förberedelse för att knock-down expressionen av pu.1 genen i befruktade Tg (MPEG1: mCherry) zebrafisk ägg. (Höger ned panel) Korrekt utarmning av makrofager i embryon kontrolleras av fluorescensmikroskopi (BC) 30 HPF makrofag-innehållande (+) eller makrofager slut. (-) Embryon (efter lipo-klodronat behandling) infekteras med M. abscessus R uttryck tdTomato (visas i vitt). (B) (C) Överlevnads kurvor av makrofager innehållande eller makrofager utarmade embryon infekterade med ≈300 CFU M. abscessus R (n = 20). Representativa resultat från tre oberoende experiment visas. Alla bilder förvärvades med ett mikroskop ansluten till en färgkamera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Beteende av makrofager i embryon infekterade antingen lokalt eller systemiskt med M. abscessus (A) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). zebrafisk embryon infekteras intramuskulärt med Wasabi-uttryck M. abscessus R. Levande imaging med användning av ett konfokalt mikroskop för att visualisera rekryterade makrofager phagocytizing individuell mykobakterier (i minuter efter infektion, MPI). Maximal intensitet projektion visar en intensiv rekrytering av makrofager (röd) till injektionsstället (konfokalmikroskop med 40X APO vatten 0,8 NA mål). Skala bar: 20 m (BC) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). Embryon intravenöst infekterade med M. abscessus R uttryck Wasabi fixerades och avbildas av konfokalmikroskopi (40X) vid 4 HPI (B) och 3 dpi (C). (B) Högsta stödnivå projektion av makrofager (röd) eller andra myeloida celler, förmodligen neutrofiler (pilar), innehållande isolerade mykobakterier (grön) nära injektionsstället (konfokalmikroskop med 63X APO olja 1,33 NA mål). Skala bar: 10 m (C) Högsta stödnivå projektion visar en makrofag (röd) inte fagocytera en sladd (grön) (konfokalmikroskop med 63X APO olja 1,33 NA mål)..Skala bar:. 5 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den zebrafisk har nyligen dykt upp som en utmärkt ryggradsdjur modellsystem för att studera dynamiken i bakteriell infektion med hjälp av brett fält och konfokal avbildning i realtid 36. Kombinationen av spridda mykobakteriella suspensioner (protokoll 2.2) tillsammans med mikroinjektion metoder (protokoll 4) medger reproducerbara systemiska infektioner, och efterföljande övervakning och visualisering av utvecklingen av infektion med en särskild inriktning på de bakteriella interaktioner med värdmakrofager. Virulens hos M. abscessus in vivo kan undersökas tack vare användningen av vildtyp gyllene zebrafisk 37. För att studera interaktioner mellan M. abscessus och värd myeloidceller kan flera transgena zebrafisk linjer användas, såsom Tg (MPEG1: mCherry) att visualisera makrofager 19. Ytterligare transgena reporter linjer såsom den som Tg (mpx: GFP) 38 eller Tg (LYZ: DsRed) 39 wed antingen gröna röda neutrofiler, respektive, kan också användas för att ta itu med den specifika roll dessa granulocyter som svar på infektionen.

M. abscessus, och i synnerhet R-variant uppvisar en naturlig benägenhet att bilda massiva bakteriella aggregat 19, vilket förhindrar reproducerbar mikroinjektion. Dessutom det faktum att R variantformer mycket större klumpar än S-varianten utesluter också potentialen jämförelse av virulens fenotyper för de två isogena varianter. Protokollet beskrivs i avsnitt 2 tillåter att erhålla homogen och spridda M. abscessus suspensioner för mikroinjektion i embryon. Detta preparat kan tillämpas på alla andra mycobakteriearter eller mutantstammar som uppvisar överdrivna aggregerande egenskaper. Eftersom sonikeringssteg kan förändra yttersta mykobakteriella cellväggslager, bör försiktighet iakttas för att bedöma effekterna av denna fysiska behandling bakteriell livsduglighet för earje ny stam.

Bestämning av bakteriella bördor förlitar rutinmässigt på CFU räkna efter utstrykning lyserade embryon på selektivt agarmedium vid olika tidpunkter efter infektion, såsom beskrivs i protokoll 6,1. Detta förfarande innefattar flera begränsningar: eftersom djur avlivas, kan varje embryo (eller grupp av embryon) användas för bestämning av en enda tidpunkt. Dessutom har denna metod fortfarande felaktig på grund av att en stor andel av bakterier som dödas och / eller förlorade under lys, efterföljande serieutspädningar, eller huvudsakligen av klumpar. Räkna CFU är också en mödosam uppgift. Som ett alternativ, protokollet 6.2 beskriver en effektiv metod för att kvantifiera M. abscessus börda som innehåller begränsade steg hantering, baserat på en analys av fluorescerande bilder av infekterade embryon med pixel kvantifiering, som ursprungligen utvecklades för M. marinum 40,41. Denna FPC metod baserad på partikelanalys, visar en god korrelation wed CFU countings. På liknande sätt, genom att kombinera mikroskopi och fluorescens kvantifiering, relativa förändringar i medfödda immuncellantal per embryo kan kvantifieras genom bildanalys med lämpliga transgena linjerna.

Zebrafisk embryon kan användas för att utvärdera rollen av immunceller under infektion och makrofag utarmning befanns påverka värdöverlevnad som svar på M. abscessus infektion. Specifika makrofag utarmning effektivt kan skapas med hjälp av lipo-klodronat baserat förfarande (protokoll 5,1) eller morfolino baserade förfarandet (protokoll 5,2). Ändå, eftersom närvaron av makrofager är avgörande för upprättandet och upprätthållandet av det vaskulära systemet och för korrekt embryonal utveckling, är det rekommenderat att avlägsna makrofager produktion vid 24 HPF använder lipo-klodronat.

Zebrafisk embryo visas som en unik modell för att studera M. abscessus infektioner och roll extracellular ligt som ett immunförsvar underminering strategi. Om bestämnings styra cording i M. abscessus kan identifieras, kan de leda till utveckling av innovativa terapeutiska alternativ. Länka användningen av zebrafisk tillsammans med innovativa hög kapacitet teknik 42 också öppnar fältet till läkemedelsutveckling och nya farmakologiska metoder mot denna läkemedelsresistenta patogener.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma till K. Kissa för hjälpsamma diskussioner och för att åstadkomma lipo-klodronat och L. Ramakrishnan för den generösa gåvan av pTEC27 och pTEC15 som tillåter uttryck av tdTomato och Wasabi, respektive. Detta arbete är en del av projekten i den franska nationella forskningsinstitut (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 och DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) och Europeiska gemenskapens sjunde ramprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) enligt bidragsavtal nr. PITN-GA-2011-289209 för Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vill också tacka Association Gregory Lemarchal och Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) för att finansiera CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

Infektion , Zebrafisk infektion patogenes medfödd immunitet makrofager mikroinjektion fluorescensmikroskopi levande avbildning ligt.
Dechiffrera och Imaging patogenes och Cording av<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I zebrafiskembryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter