Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Anvendelse af Ramsay-analysen til at måle Fluid sekretion og Ion Flux priser i Published: November 25, 2015 doi: 10.3791/53144
Automatic Translation
1, 1
1Department of Internal Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

Denne protokol beskriver anvendelsen af Ramsay assay til måling af væske sekretionshastigheder fra isolerede Malpighian (renal) tubuli fra Drosophila melanogaster. Desuden anvendelsen af ​​ionspecifikke elektroder måler natrium og kalium koncentrationer i den udskilte væske, tillader beregning af transepitel ion flux, er beskrevet.

Abstract

Modulation af renal epitelial iontransport tillader organismer for at opretholde ioniske og osmotisk homeostase i ansigtet af varierende ydre forhold. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubulus tilbyder en enestående mulighed for at studere de molekylære mekanismer i epitel iontransport, på grund af de kraftige genetik på denne skadegører, og tilgængeligheden af sine nyretubuli til fysiologisk undersøgelse. Her beskriver vi anvendelsen af ​​Ramsay assay til måling af væske sekretionshastigheder fra isoleret flyve nyretubuli, med anvendelse af ionspecifikke elektroder til måling af natrium og kalium koncentrationer i den udskilte væske. Dette assay muliggør undersøgelse af transepitel væske og ionstrømme af ~ 20 tubuli ad gangen, uden at det er nødvendigt at overføre den udskilte væske til en separat apparat til måling af ionkoncentrationer. Genetisk distinkte tubuli kan analyseres for at vurdere rollen af ​​specifikke gener i transportprocesser. Derudover bathing saltvand kan ændres til at undersøge virkningerne af sine kemiske egenskaber, eller narkotika eller hormoner tilføjet. Sammenfattende denne teknik tillader molekylær karakterisering af grundlæggende mekanismer i epitel iontransport i Drosophila tubulus, samt regulering af disse transportmekanismer.

Introduction

Renale epitel iontransport ligger til grund organismal iono- og osmoregulering. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubulus tilbyder en enestående mulighed for at studere de molekylære mekanismer i epitelial ion transport. Dette skyldes kombinationen af de stærke genetik Drosophila, parret med tilgængeligheden af sine nyretubuli til fysiologisk undersøgelse. Ramsay assay, opkaldt efter den undersøger, som banebrydende teknik 1, måler væskesekretion satser fra isolerede Malpighian tubuli, og blev etableret i Drosophila i 1994 af Dow og kolleger 2. Dette banede vejen for yderligere undersøgelser ved hjælp af Drosophila genetiske værktøjer, såsom GAL4-UAS systemet 3,4, for at definere celle-specifikke signalveje regulerer væske sekretion. Et eksempel omfatter calcium signalering som respons på et peptidhormon 5, blandt mange andre 6,7.

ve_content "> en kombination af genetiske teknikker og klassiske fysiologiske undersøgelse har vist, at urin generation i fluen sker gennem sekretion af et kaliumchlorid-rige væske fra hovedsegmentet af tubuli. Dette sker via den parallelle transepitel sekretion af kationer, primært K + men også Na +, gennem den primære celle og Cl -. sekretion gennem stjerneformet cellen 8-12 Evnen til separat at måle transepiteliale K + og Na + flux giver en mere detaljeret karakterisering af transportmekanismer end måling af væske sekretion alene. For eksempel i ustimulerede Drosophila tubuli, Na + / K + -ATPase-inhibitoren ouabain har ingen effekt på fluid sekretion 2, selv når dets optagelse i celler vigtigste inhiberes af organisk aniontransporter inhibitor taurocholat 13. Imidlertid Linton og O'Donnell viste, at ouabain depolarisererden basolaterale membran potentiale, og øger Na + flux 9. Som vist i Repræsentative resultater, vi gentaget disse resultater, og viste, at K + flux er samtidig faldet 14; den øgede Na + flux og faldt K + flux har modsatrettede virkninger på fluid sekretion, hvilket resulterer i nogen nettoændring i sekretion. Der er således to beslutninger til "ouabain paradoks", dvs. den oprindelige iagttagelse, at ouabain har nogen virkning på fluid sekretion i Drosophila tubulus:. Dels i stimulerede tubuli, virkningen af ouabain på fluid sekretion fremgår ikke på grund af dens optagelse af organisk aniontransporter 13; og for det andet i ustimulerede tubuli, ouabain har modstående virkninger på transepitelialt Na + og K + flux, hvilket resulterer i nogen nettoændring i fluid sekretion (se Repræsentative resultater og ref. 9). Derfor er den primære rolle af Na + / K + ATPase i ustimulerede tubuli er at sænke intracellulære Na + koncentration til at frembringe en positiv koncentrationsgradient for Na + -coupled transportprocesser på tværs af basolaterale membran. Faktisk ved separat måling Na + og K + fluxe, vi påvist, at tubuli mangler fluen natrium-kalium-2-chlorid cotransportøren (NKCC) er faldet transepitelial K + flux, uden yderligere fald efter ouabain Desuden, og ingen ændring i transepitel Na + flux 14. Disse resultater støttede vores konklusion, at Na + ind i cellen gennem NKCC recirkuleres gennem Na + / K + -ATPase. I et andet eksempel Ianowski et al. Observerede, at en sænkning bad K + koncentration fra 10 mM til 6 mM reduceret transepitheliale K + flux og forøget transepitel Na + flux i tubuli fra Rhodnius prolixus, med nogen nettoændring i fluid sekretion + flux og K + flux på tværs af larver tubuli er også blevet observeret i Drosophila tubuli som reaktion på varierende salt kost 16 og i to myg arter som reaktion på opdræt saltholdighed 17.

Den største udfordring i målingen af ​​transepitelial ion flux i Ramsay assay forberedelse er bestemmelsen af ​​ion koncentrationer inden det udskilte væske. Denne udfordring er blevet mødt med varierende løsninger, herunder flamme photometery 18, anvendelse af radioaktive ioner 19, og elektron sonde bølgelængde dispersivt spektroskopi 20. Disse teknikker kræver overførsel af den udskilte væske fald til et instrument til måling af ionkoncentrationer. Da mængden af væske, der udskilles af den ustimulerede Drosophila tubulus er lille, typisk ~ 0,5 nl / min, udgør det en teknisk udfordring, og også indfører fejl, hvis nogle af de udskilte væsketabt ved overførsel. I modsætning hertil anvendelsen af ionspecifikke elektroder tillader måling af ion aktivitet (hvorfra der kan beregnes ionkoncentration) in situ. Den nuværende protokol blev tilpasset fra den, der anvendes af Maddrell og kolleger til at måle transepitel K + flux på tværs af Rhodnius tubulus hjælp valinomycin som K + ionofor 21 og beskriver også anvendelsen af en 4-tert -butylcalix [4] aren-tetraeddikesyre tetraethylester-baserede Na + -specifik ion-specifik elektrode kendetegnet ved Messerli et. al. 22. Ion-specifikke elektroder er også blevet anvendt til at måle ion koncentrationer i væske, der udskilles af Malpighian tubuli i Ramsay assay voksne 9,23 og larver 16 Drosophila melanogaster, New Zealand Alpine Weta (Hemideina Maori) 24 og myg 17.

Her beskriver vi i detaljer brugen af ​​Ramsay somsige at måle fluid sekretionshastigheder i Malpighian tubuli fra Drosophila melanogaster, samt anvendelsen af ionspecifikke elektroder til at bestemme koncentrationerne af K + og Na + i den udskilte væske og dermed beregningen af transepitelialt ionstrømme. En oversigt over assayet er tilvejebragt i figur 1.

Figur 1

Figur 1. Skematisk af Malpighian tubuli og Ramsay-analysen med brug af Ion-specifikke elektroder til måling ionkoncentrationer. Denne figur illustrerer opsætningen for Ramsay analysen. (A) Hver flue har fire tubuli, et par anteriore tubuli og et par posteriore tubuli, der flyder i bughulen omgivet af hæmolymfe. I hvert par, de to tubuli deltage i urinlederen, som derefter tømmer urinen ved krydset af mellemtarmen og hindgut. Tubuliene er blinde ender. Urin frembringes af fluid-udskillende hovedsegmentet (vist med rødt) og strømmer mod ureter og ud i tarmen. Efter dissektion bliver tubulus parret adskilt fra tarmen ved transecting ureter. (B) Parret af tubuli overføres derefter til en dråbe saltvand badning inden for en brønd i assay skålen. En af de to tubuli, der er nævnt her som "anker tubulus," er viklet omkring en metalstang og er inert. Den anden tubulus er udskillende tubulus. Den indledende segment (som ikke udskiller væske) og vigtigste segment af secernerer tubulus forbliver inden for dråbe badning saltvand. Ioner og vand træk fra badning saltvand og ind i tubulus lumen de vigtigste segment, og derefter bevæge sig mod ureter, som ville forekomme in vivo. Den nederste segment (blå) er uden for badning saltvand og derfor inaktivt. Da ureter skæres, fremgår det secernerede fluid som en dråbe fra den afskårne ende af ureter. Than udskilte væske dråbe forstørrer, efterhånden som sekretion fortsætter, og dens diameter er målt ved anvendelse af en okulær mikrometer. Et lag af mineralolie forhindrer fordampning af det udskilte væske. Reference- og ion specifikke elektroder måler ion koncentrationen af det udskilte væske. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse dissektion, kalibrering og Assay Retter

Bemærk: I dette trin, er tre petriskåle af plast foret med silikone elastomer fremstillet: én for dissektion, en til udførelse af Ramsay assay ("assay skål"), og én til at udføre kalibrering. Disse retter er genbruges fra eksperiment til eksperiment, og dermed dette trin skal kun gentages, hvis en skål pauser. Et billede af assayet skålen er vist i figur 2.

Figur 2

Figur 2. Assay parabol. Skålen anvendes til Ramsay assayet er vist her. Det er en 10 cm petriskål, der er foret med silikone elastomer. Mellem 20 og 25 brønde skåret ud af elastomer. En Minutien metal pin, skåret i halve, er placeret til højre for hver brønd (eller til venstre, hvis forsøgslederen er venstrehåndet).TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53144/53144fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Brug af handsker, hæld ~ 80 g silikoneelastomer basen i et glasbæger. Tilføj 1/10 vægt (8 g) silikoneelastomer helbredelse. Rør med en metal omrører. Placer på en orbitalryster med en flad top ved en forsigtig hastighed, for eksempel 100 rpm, i flere timer, indtil alle bobler er blevet fjernet.
  2. Hæld siliconeelastomer i ren petriskåle af plast: 100 mm x 15 mm retter til dissektion og assay retter, og 35 x 10 mm til kalibrering fadet. Tykkelsen af ​​elastomeren lag skal være ~ 6 - 7 mm for 100 mm skåle og ~ 5 mm for 35 mm skål.
  3. Placer servicet på bænken ved stuetemperatur (RT) til at helbrede (hærde), ~ 24-48 timer.
  4. Når assayet skålen er hærdet, udarbejde et mindre parti af silikoneelastomer som i trin 1.1, f.eks., 10 g silikoneelastomer med 1 g kur base. Ryst på orbitalshaker som i trin 1.1, indtil luftbobler er ikke længere til stede. Denne elastomer vil blive anvendt i trin 1.5.4 og bør ikke tillades at hærde før dette trin.
  5. Ved hjælp af en kirurgisk skalpel og standard klid forholdsregler, foretage boringer i en af ​​de 100 mm silikone elastomer-belagte petriskåle. Dette vil være assayet skålen.
    1. Gør brønde ~ 1 cm fra hinanden og med en diameter på ~ 3 - 4 mm. 25 brønde kan nemt passe i en 100 mm assay skål. Wells bør være mindst 6 mm fra væggene i skålen. Figur 2 illustrerer afstanden mellem brøndene. Hver brønd indeholder en fluid-secernerende tubulus under eksperimentet. Således vil en skål indeholdende 25 brønde tillader 25 tubuli, der skal analyseres.
    2. Brug en permanent markør til at markere placeringen af ​​brøndene, hvis nødvendigt.
    3. Gør brøndens vægge så glat som muligt ved at placere skalpel i elastomeren, og derefter bruge den anden hånd til at dreje skålen 360 °.
    4. Derefter bruger standard sha rps forholdsregler, dyppe en 30 G nål ind i den ikke-hærdede elastomer fra trin 1.4 og placere en lille dråbe i bunden af ​​hver brønd. Dette udglatter ud i bunden af ​​brønden. Tillad at helbrede (hærde) x 24 - 48 timer.
  6. Forbered Minutien ben.
    1. Placer 0,15 mm sort anodiseret Minutien stifter i træk på et stykke 1 tomme standard lab etikettering tape. Stifterne 'lange akse skal være vinkelret på båndets længdeakse. Skære tapen langs sin længde med henblik på at adskille hver stift i to omtrent lige store halvdele (Figur 3). Brug en halv pin til hver brønd.

Figur 3

Figur 3. Skæring Minutien Pins. Er Stifterne linet op på et stykke mærkning tape parallelt. Derefter saks bruges til at skære benene i halve.ge.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Sæt hver halve stift i silikone elastomer ca. 1 mm til højre for hver brønd (hvis højrehåndet, og hvis venstrehåndet, skal du indsætte stiften til venstre for hver brønd). Dette gøres nemmest ved at visualisere brøndene ved lav effekt under en dissekere stereomikroskop og er hjulpet ved anvendelse af en stump tang. Figur 2 illustrerer placeringen af stifterne.

2. Forberedelse Fin Glass Rods

Bemærk: I dette trin, er en glasstav fremstillet som vil blive anvendt til at overføre tubuli fra dissekere skålen i badning drop. Glasstaven genbruges fra eksperiment til eksperiment, så dette trin udføres kun en gang, medmindre stangen pauser og en ny er nødvendig.

  1. Opnå plader af 3 mm (1/8 tomme) tykt farvet sort glas fra en hobby butik og passende glas-skæring udstyr, såsom et glas cutter og tang. Brug egnet sikkerhedsudstyr (tykke handsker, beskyttelsesbriller).
  2. Skær glasset i strimler ~ 6 mm bred x 10 cm lang
  3. Hold et glas stribe i hver hånd. Blødgør den korte ende af hver strimmel over flammen af ​​en bunsenbrænder, ved anvendelse af passende sikkerhedsforanstaltninger. Derefter skubbe enderne af de to strimler sammen og trække fra hinanden i en jævn bevægelse at skabe en fin glasstang med et håndtag.

3. Fysiologi opsætning

Bemærk: I dette trin, mikroskopet, er elektrometer og elektriske kredsløb oprettet. Andre end periodisk re-chloriding (trin 3.2) i de sølv ledninger og re-kalibrering af elektrometeret (trin 3.8), er dette trin udføres kun én gang. Figur 4 illustrerer opsætningen.

Figur 4

Figur 4. Fysiologi Setup. (A) Oversigt over opsætningen. Stereomikroskop er placeret inde i Faradays bur med mikromanipulatorer på begge sider. En fiberoptisk lys ført gennem et hul i siden af ​​Faradays bur. Elektrometeret placeres uden for Faradays bur. (B) og chlorid coate sølvtråde, er tråden nedsænket i blegemiddel. (C) Nærbillede af opsætningen. Den lige mikroelektrode holder, er vist i dette billede til venstre, er skruet på sonde af elektrometeret. Den ion-specifik elektrode vil derefter blive trækkes over sølvtråd i elektrodeholderen. Til højre er referenceelektroden gevind over sølvtråd på 45 ° mikroelektrode indehaveren. Kredsløbet skal derefter passende jordforbindelse. Assayet skålen er vist som det vil blive placeret, når der foretages målinger. Zoomklik her for at se en større version af dette tal.

  1. Placer stereomicrosope med okulær mikrometer inde i Faradays bur. Jord til det indre af Faradays bur, som derefter jordforbindelse til kabinettet grund af elektrometeret. Placer mikromanipulatorer på hver side af mikroskopet (figur 4A).
  2. Chloride to sølvtråde ved nedsænkning i blegemiddel i mindst 1 time. Forlæng natten over (O / N) om nødvendigt (figur 4B). Gentag dette trin, når sølv ledninger skal re-chlorided, for eksempel hvis de er grå i udseende snarere end sort.
  3. Tråd én chlorided sølvtråd i hver af mikroelektroden indehavere.
  4. Etablere det elektriske kredsløb med passende jordforbindelse. For eksempel, placere udluftet, lige mikroelektrode holder, hvilket vil holde ion-specifik elektrode (ISE), på electrometer probe, som er fastgjort på mikromanipulator (figur 4C).
  5. Fastgør udluftet, 45 ° mikroelektrode holder, hvilket vil holde referenceelektroden, på den anden mikromanipulator (figur 4C). Derefter formalet til kredsløbet jorden ved den electrometer.
  6. Jorde "AB out" udgang BNC af elektrometeret til chassiset jorden af ​​elektrometeret.
  7. Placer fiberoptiske lyskilde uden for Faradays bur, med svanehals rør ført gennem et hul i Faradays bur (figur 4A).
  8. Oprette og kalibrere elektrometeret ifølge producentens anvisninger. Re-kalibrere elektrometeret regelmæssigt (hver 1 - 2 uger). Når du er færdig, og mellem målingerne, lade elektrometeret i "standby" med den holdning skifte indstillet til "IN", måler input sat til "A" og interval indstillet til "200 mV."

4. Forbered de Dissecting og bad Løsninger

  1. Forbered <em> Drosophila saltvand så detaljeret i tabel 1. Til brug i forsøg, hæld ~ 40 ml i en 50 ml konisk rør og holde ved stuetemperatur. Kasseres, hvis der er tegn på bakteriel eller svampevækst.
  2. For at forberede standard badning medium (SBM), bland Drosophila saltvand 1: 1 med Schneiders medium, og passerer gennem et 0,22 um sprøjtefilter. Forbered i små portioner (~ 10 - 15 ml), opbevares ved 4 ° C og smid hvis der er tegn på bakteriel eller svampevækst. Komponenterne i Schneider medium er anført i tabel 2.

5. Gøre Ion-specifikke Elektrode: Silanizing pipetter

Bemærk: I dette trin, er dichlordimethylsilan bruges til let "silanize" ion-specifikke elektrode. Dette tilføjer en hydrofob belægning på indersiden af ​​elektroden, der gør det muligt at bevare den hydrofobe ionophor. Overdreven silanisering undgås for at forhindre optagelse af mineralolie, når de foretager measurements i dråber under olie. Silaniserede elektroder er gode til flere uger. Derfor er dette trin udføres hvert par uger.

  1. Flamme-polish enderne af 5 - 6 unfilamented borosilikatglas kapillarrør (ydre diameter 1,2 mm, indvendig diameter 0,69 mm, længde 10 cm) over en svag flamme, ved hjælp af passende sikkerhedsforanstaltninger.
  2. Placer kapillarrørene i bunden af ​​et 1 L bægerglas.
  3. I en hætte og brug af egnede personlige værnemidler, hæld 70% salpetersyre (ADVARSEL: brandfarlig og ætsende, se sikkerhedsdatablad til sikker opbevaring og håndtering instrukser) over de kapillarrør og suge i 5 min.
  4. Hæld salpetersyre tilbage i en glasflaske. Genbrug til efterfølgende salpetersyre vask.
  5. Tilføj ~ 200 ml deioniseret H2O til bægerglasset. Tomme affald i en dedikeret glasflaske for salpetersyre affald. Gentag med yderligere 200 ml deioniseret H2O Følg de institutionelle retningslinjer for the sikker bortskaffelse af syre affald.
  6. Gøre tre yderligere vaske med rigelige mængder deioniseret vand. Tømmes i vasken.
  7. I hætten, placere kapillarrør på en varmeplade med keramisk top sæt til 200 ° C og tør i mindst 20 minutter, optimalt 1 time. Det kan også stå i længere perioder.
  8. På en pipette aftrækker (figur 5A), træk pipetter til en spids diameter på ~ 1 - 2 ud um.
  9. Placer trukket pipetter tilbage på varmepladen, pas på ikke at bryde tip, i mindst 10 minutter, optimalt 30 minutter, men kan stå i længere tid.
  10. Tilføj 20 ul dichlordimethylsilan (ADVARSEL: Brandfarlig, ætsende, akut toksicitet, se sikkerhedsdatablad til sikker opbevaring og håndtering instruktion) i en 15 cm glas petriskål og vend skålen over pipetter på varmepladen (figur 5B). Efterlad på plads i mindst 20 minutter, optimalt 2 timer. Det samme petriskål kan genbruges i efterfølgende eksperimenter.
    1. Bestem Amou nt af dichlordimethylsilan tilsat ved trial and error. Efter ionophor tilsættes (trin 8.4), at grænsefladen mellem ionophor og opfyldning løsning er flad (figur 5C). Hvis grænsefladen er konkav, indikerer dette over-silanisering, og mindre silan bør anvendes. Hvis grænsefladen er konveks, indikerer dette under-silanisering, og mere silan bør anvendes.
      Bemærk: dichlordimethylsilan tendens til at gå "off" over tid, det vil sige, er mindre effektiv silanisering opnået med den samme mængde silan.. På dette tidspunkt kan enten nye silan bestilles eller størrelsen justeres til opnåelse af tilsvarende silanisering.
  11. Sluk varmeplade og lad det køle af. Fjern glas petriskål og overføre pipetter til opbevaring beholder indeholdende silicagel, som opretholder udtørring. Håndter pipetter omhyggeligt (pincet nyttige) for at forhindre bryde spids.

5. "src =" / files / ftp_upload / 53144 / 53144fig5.jpg "/>

Figur 5. Silanizing pipetter. (A) Eksempel på pipette aftrækker. (B) billede af den trak pipetter på varmepladen. Glasset skål indeholdende en dråbe dichlordimethylsilan er spejlvendt over løftes pipetter. (C) Skematisk illustrerer grænsefladen mellem ionophor cocktail og opfyldning løsning. En flad grænseflade angiver optimal silanisering. Klik her for at se en større version af dette tal.

6. Forberedelse af Negativ Suge Device

Bemærk: I dette trin, er en simpel negativ sugeindretning fremstillet (figur 6), der skal bruges til at fylde ion-specifikke elektrode. Dette trin udføres kun en gang.

  1. Vedhæft en 3 ml sprøjte til en 3-vejs stophane med luer lock. Påden modsatte ende af stophanen, der indeholder den roterende krave og vagt, skrue i en kvindelig låsning luerkonnektor med modhager ende. Derefter lægger silikoneslange, 1/16 inch indre diameter med 1/8 inch yderdiameter, at den med modhager forsynede ende af stikket. Indsæt derefter plastrør med 1/32 tommer indvendig diameter og 3/32 inch udvendig diameter

Figur 6

Figur 6. Den negative Suge Enhed. Billede af komponenterne i den negative suge-enheden (3 ml sprøjte med luer lock, 3-vejs stophane med roterende krave og vagt, Luer låsning stik med pigtråd ende, silikoneslanger, plastrør), og det endelige produkt. Klik her for at se en større version af dette tal.

7. Saml Fluer til Dissektion < / p>

  1. Brug standard flyve opdrætsmetoder 25 at oprette flyve kors og ændre efter behov. Brug f.eks forhøjet temperatur (såsom 28 ° C) i eksperimenter, hvor øget GAL4 aktivitet er ønsket.
    Bemærk: Det er vigtigt, at fluerne ikke opdrættes i overdrevent overfyldt forhold; antallet af mandlige og kvindelige forældre bør nedsættes i dette tilfælde. Hvis der anvendes forskellige genotyper, bør antallet af mandlige og kvindelige forældre blive justeret for at opnå tilnærmelsesvis samme antal afkom.
  2. Saml fluer til dissektion (trin 11) ved hjælp af standard flyve opdrætsmetoder 25 indenfor 1 - 2 dage efter eclosion. Tubuli fra kvindelige fluer lettere dissekeret, men tubuli fra mandlige fluer kan også bruges hvis det er nødvendigt eller ønsket. Sted flyver ind et hætteglas indeholdende flue fødevarer. Placer hætteglas ved den ønskede temperatur i 3 - 5 dage før dissektion.

8. Påfyldning af Ion-specifikke elektrode (ISE)

e_content "> Bemærk:.. I dette trin er ISE tilbagefyldt med en saltopløsning og derefter ionophor indføres i spidsen Den ISE kan genbruges fra dag til dag, så længe det fungerer godt Derfor er dette trin udføres hver par dage efter behov.

  1. For at gøre en K + -specifik elektrode, opfyldning et silaniseret pipette med 0,5 M KCI ved hjælp af en 1 ml sprøjte og microfilament (genbrug mikrofilamenter fra eksperiment til eksperiment). Sørg for, at opfyldning løsning fylder til den meget spids af pipette - ingen luft i tip. Hvis usikker, visualisere under et sammensat mikroskop. Løsne luftbobler ved forsigtigt at zappe den pipette.
    1. For en Na + -specifik elektrode, opfyldning med 150 mM NaCl.
  2. Sæt bagenden af ​​ISE i plastrøret af den negative sugeindretningen fremstillet i trin 6. I hætten, placere ISE på en inverteret plast 3,5 cm petriskål med et stykke modellervoks at sikre på plads.
  3. Generer negativ pressure hjælp af sugeindretningen. Tegn tilbage på sprøjten med "off" af stophane håndtaget peger mod siden porten. Mængden af ​​tegning tilbage vil variere, men er sædvanligvis i intervallet 0,6 - 0,7 ml. Tænd stophane håndtaget så "off" peger mod slangen.
  4. I hætten og bruge egnede personlige værnemidler, dyppe en 1 - 10 pi pipettespids ind ionophoren opløsning (ADVARSEL: giftig Se Materiale data sikkerhedsdatablad til sikker opbevaring og håndtering instruktioner.). Udvise en lille dråbe ved at placere en behandsket finger over større åbning af pipette spids. Derefter skal du trykke på dråbe ionofor til spidsen af ​​ISE, uden at røre ved ISE spidsen med pipette spids for at undgå at bryde ISE spidsen.
    1. Brug kalium ionophor anført i Materialetabel "som de er". For at fremstille natriumsaltet ionofor, at en opløsning af (i% w / w) 10% 4-tert -butylcalix [4] aren-tetraeddikesyre tetraethylester, 89.75% Nitrophenyl octylether, og 0,25% natrium tetraphenylborat (ADVARSEL: Se Materiale data sikkerhedsdatablad til sikker opbevaring og håndtering instruktioner giftige.). Opbevares i et hætteglas pakket i folie for at beskytte mod lys.
  5. Undersøg ISE under 40X forstørrelse med anvendelse af en forbindelse mikroskop for at fastslå, om ionophor var "optaget" i ISE spids og om ionophor / opfyldning opløsning interface er flad (se trin 5.10.1 og figur 5C).
    1. Hvis der ikke ionofor blev taget op, øge mængden af ​​undertryk frembringes af sugeindretningen. Hvis dette ikke lykkes, elektroden kan have været utilstrækkeligt silaniseres. Gentag trin 5 under anvendelse af en større mængde dichlordimethylsilan.
  6. Placer ISE, tippe ned, på væggen i et bæger delvist fyldt med 150 mM KCI. Fastgør ISE ved at placere modellervoks på siden af ​​bægeret. Spidsen ligger inden for 150 mM KCl. Fortsæt med at bruge ISE ovER flere dage, så længe det fungerer godt (se trin 10.6).
    1. For en Na + ISE, opbevare elektroden i 150 mM NaCl.

9. Forbered referenceelektroden

Bemærk: Trin 9.1 - 9.3 kan udføres i forvejen. Trin 9.4 - 9.6 udføres hver forsøgsdag.

  1. Flamme-polish enderne af 10 filamenteret borosilikatglas kapillarrør (ydre diameter 1,2 mm, indvendig diameter 0,69 mm, længde 10 cm) over en svag flamme, ved hjælp af sikkerhedsforanstaltninger.
  2. På en pipette aftrækker, træk pipetter til en spids diameter på ~ 1 - 2 ud um.
  3. Store pipetter i en pipette opbevaring jar indtil anvendelse. Pipetter kan opbevares på ubestemt tid.
  4. På dagen for eksperimentet under anvendelse af en microfilament og sprøjte, fyld spidsen og skaftet på pipette med 1 M natriumacetat. Sikre, at der ikke er nogen luftbobler, og at løsningen går til spidsen. Svirp forsigtigt pipette hvis luftbobler er til stede.
  5. Anvendelse af en andenmicrofilament og sprøjte, pipette efterfylde med 3 M KCI. Igen sikrer luftbobler ikke er til stede.
  6. Opbevar referenceelektrode i et bægerglas indeholdende 150 mM KCI (se trin 8.6).

10. Kalibrering af ISE

Bemærk: Dette trin udføres tre gange på eksperimentet dag: tidligt på dagen for at sikre ISE fungerer, og så før og efter målinger af 20 - 25 udskilte væske dråber (tabel 3).

  1. Til kalibrering af kalium ISE, placere to 0,6 gl dråber hver af de følgende fire koncentrationer af KCI på silicone elastomer-belagt 3,5 cm petriskål (udarbejdet i trin 1): 15 mm, 75 mm, 150 mm og 200 mm. Forsigtigt lag 2 ml mineralolie i dråberne.
    1. For natrium ISE, bruger kalibrering dråber af 15 mM og 150 mM NaCl.
  2. Placer kalibreringen fadet ind på scenen af ​​stereomikroskopet i Faradays bur og belyse.
  3. Threannonce ISE og reference elektrode over sølv ledninger og fastgør i mikroelektrode indehavere.
  4. Brug af mikromanipulatorer, fremme ISE og referenceelektroder i 15 mM KCI drop.
  5. Skift elektrometeret at "operere" mode. Tillad læsning at bosætte sig.
  6. Optag læsning i notesbog. Gentag med 75 mM, 150 mM og 200 mM falder. Beregn hældning at afgøre, om ISE fungerer godt (se trin 13.1 og tabel 3). Hvis ikke, udarbejde en ny ISE.
    Bemærk: Tegn, at en ISE ikke fungerer godt: manglende få en læsning; langsomt at ækvilibrere (flere sekunder eller længere); ustabil læsning; hældning <49 mV / decil ændring i K + eller Na + koncentration.
  7. Mellem den første kalibrering af dagen og de udførte i trin 12 målinger, dvs. under udførelsen af ​​trin 11 (tubulære dissektioner), gemme ISE og reference elektroder i 150 mM KCI (som beskrevet i trin 8.6).

Bemærk: Dette trin udføres på eksperimentet dag.

  1. Portion ud en lille mængde (~ 500-600 ul) i standard badning medium (SBM), fremstillet i trin 4.2, til brug på dagen for eksperimentet og lad det varme op til RT. Dette bør ske mindst 30 minutter før dissektioner, men kan også ske tidligere. Også, har mindst 20 ml RT Drosophila saltvand (trin 4.1) til rådighed før start dissektioner.
  2. Umiddelbart før start dissektioner: se assayet skålen 10x forstørrelse under et stereomikroskop og tilføj nok SBM til næsten fylde hver brønd i assay skålen, typisk mellem 10 og 30 pi. Hvis narkotika eller peptid vil blive tilføjet til SBM medio eksperiment, skal du notere den nøjagtige mængde af SBM til hver brønd. Undgå overfyldning brønden, da dette kan føre til tubulus flydende væk i løbet af eksperimentet.
  3. Lag forsigtigt ~ 12 - 13 ml mineralolie oven, således at brøndene enre omfattet. Dette vil forhindre fordampning af det secernerede væskedråber under eksperimentet.
  4. Sted flyver til dissekeres på CO 2 pad.
  5. Pick up en flue via sin ben eller fløj med en pincet og sted på ryggen (ventrale side op) på silicone elastomer-belagt dissekere fad forberedt i trin 1. Impale brystkassen med en Minutien pin til at sikre fluen på plads.
  6. Tilføj en dråbe RT Drosophila saltvand (trin 4.1) at fordybe fluen i saltvand.
  7. Valgfrit: klip off vinger og ben. I praksis er dette ikke normalt nødvendigt.
  8. Brug ikke-dominerende hånd pincet til "hold" fluen mave på thoraco-abdominale krydset. Brug de dominerende hånd pincet til at skrælle den abdominale neglebånd væk, starter ved thoraco-abdominalt kryds og bevæger sig hen imod enden af ​​fluen. Tarmen, med knyttet Malpighian tubuli, bør udsættes med denne manøvre.
  9. Uden at røre tubuli, dissekerer gratis mellemtarmen /stortarmen og vedhæftede tubuli. Hold tarmen i de ikke-dominerende hånd pincet og bruge en 30 G nål at adskille urinlederen fra tarmen, afmontering tubuli fra tarmen og fri for fly.It er vigtigt, at ingen tårer eller lejemål indføres i tubulus, bortset fra urinlederen.
    Bemærk: Den forreste par tubuli er lettest dissekeret, men de posteriore tubuli kan anvendes.
  10. Brug den fine glasstav (trin 2), afhente tubulus parret og overføre i en brønd af analysen parabol.
  11. Umiddelbart efter tubulus parret er blevet overført i brønden, afhente i slutningen af ​​en af ​​tubuli med glas stang, trække sig ud af badning drop indtil den afskårne ende af ureter er halvvejs mellem stiften og badning slip, og wrap slutningen af ​​tubulus omkring stiften ved hjælp af glasstaven. Ved afslutningen af denne manøvre, er fortsat et tubulus i bade saltvand drop og vil udskille væske fra den afskårne ende af ureter, som illustreret i figur 1 i figur 1, er viklet rundt om stiften. Det forankrer secernerende tubulus på plads, er omgivet af olie og ikke udskiller væske.
  12. Umiddelbart efter trin 11.11, skrive ned i brønden (f.eks, A, B, C), tubulus identificerende information (f.eks., Genotype eller tilstand), og tiden (dette er starttidspunktet, når fluid begynder at blive udskilt af tubulus i dråbe badning saltvand).
  13. Fortsæt med den næste dissektion. Når forsøgslederen er fagmand på denne teknik, tager det typisk 3 - 4 min at dissekere et par tubuli, overføre dem til badning saltvand, og pak ankeret tubulus omkring stiften. Derfor 20 - kan 25 tubuli sættes op i Ramsay analysen inden for 1,5 time. Starttidspunktet for hver tubulus vil derfor være omkring 3 - 4 minutter efter starttidspunktet for den foregående tubulus.

12. at foretage målinger

  1. Kalibrer ISE (trin 10) ca 20 min før den første måling. Dette giver tid til at lave en ny ISE, hvis nødvendigt.
    Bemærk: på det ønskede tidspunkt, for eksempel efter 2 timer for sekretion, det secernerede fluid dråbe af hver tubulus er klar til måling.
  2. Optag måletidspunktet. Mål diameteren af ​​udskilt fluid drop hjælp af okularmikrometer og optage. Bemærk forstørrelsen, f.eks 50X.
  3. Advance ISE og referenceelektroden i væsken dråbe. Skift elektrometeret at "operere." Tillad læsningen at stabilisere sig. Optag værdi.
  4. Gentag for den næste dråbe.
  5. Ved afslutningen af ​​forsøget, gentage kalibreringsmålinger (trin 10).

13. Beregninger

Bemærk: Dette trin kan udføres enten ved slutningen af ​​eksperimentet dag, eller på et senere tidspunkt.

  1. Beregn middelværdienhældning / decil ændring i koncentrationen af ​​kalium. Se tabel 3 for et eksempel.
    Bemærk: For natrium, vil værdierne være forskellen mellem 15 mM og 150 mM NaCl målinger.
  2. Bestem middelværdien af ​​de to målinger (før og efter) af 200 mM KCl (eller 150 mM NaCl).
  3. Beregn mængden af ​​hver dråbe. V = πd 3/6, hvor d er diameteren af dråben målt med okularmikrometer i trin 12.2.
  4. Beregn sekretionshastighed = V / tid (NL / min / tubulus), hvor V er rumfanget af dråben bestemt i trin 13.3, og tiden er den tid, tubulus udskilt væske (= måletidspunktet - cirka trække ureter ud af badning dråbe).
  5. Beregn ionkoncentrationen ved hjælp af formlen [K] = 10e (Av / S) * 200 eller [Na] = 10e (Av / S) * 150, hvor Av = forskellen (i mV) mellem den potentielle målt af det udskilte væske slip, og potentialet af 200 mM kalibrering dråbe (feller kalium; 150 mM drop for natrium). S = hældningen bestemt i trin 13.1.
  6. Beregn ion flux = [ion] x fluid sekretion sats. For Drosophila tubuli, vil dette være pmol / min / tubulus.

14. oprydning

Bemærk: Dette trin udføres ved forsøgets afslutning dag.

  1. Grundig rengøring af brøndene er vigtigt at sikre, at resterende saltkrystaller ikke forbliver i brøndene, ændring ionkoncentrationen og osmolaritet i fremtidige forsøg.
  2. Lad mineralolie til at løbe af.
  3. Skyl brøndene i assayet skålen. En 200 pi pipettespids kan anvendes til forsigtigt at skrabe tilbageværende salt krystal. Brug plastrør knyttet til vandhane, klemme slangen til at skabe en højtryks-stråle af varmt vand til grundigt at skylle ud hver brønd.
  4. Lad det tørre O / N. Alternativt kan en føntørrer benyttes til at tørre ud brøndene.
  5. Skyl pincet med deioniseret H2O ogsuge i ethanol i 15 min til flere timer.
  6. Dræn olie ud af kalibrering fad og vask med varmt vand. Brug sæbe samt længe det er grundigt skyllet væk. Foretage den afsluttende skylning med destilleret H2O
  7. Skyl mikrofilamenter og sprøjter med destilleret H2O

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 7 og 8 viser, at brugen af Ramsay assay med ionspecifikke elektroder til måling af K + og Na + koncentration kan skelne genetisk og farmakologisk særskilte K + og Na + flusmidler, oplysninger, der ikke fanget ved måling fluid sekretionshastigheder alene. Fig 7 viser, at faldet fluid sekretion i tubuli mod fluer bærer en homozygot nul mutation i NKCC drives af et fald i K + flux i mutanterne (Figur 7A), mens Na + flux er uændret (figur 7B). Figur 8 viser at Na + / K + -ATPase-inhibitor, ouabain, har forskellige virkninger på hver af de tre målte parametre: i vildtype-tubuli, fluid sekretion er uændret (figur 8A og 8B), er Na + flux forøget (figur 8A ), og K + flux er deøget (figur 8B). Endvidere ouabain har ingen effekt på transepitel K + flux i NKCC nulmutant tubuli (figur 8B). Sammen indikerer disse data, at Na + / K + -ATPase giver den drivende kraft for K + optagelse gennem NKCC, mens Na + recirkuleres gennem Na + / K + -ATPase 14. Mellem 13 og 18 tubuli blev analyseret i hver genotype / tilstand; observerede forskelle var statistisk signifikant med p <0,01 (eller mindre) af uparret, tohalet t-test. Da ~ 15-20 tubuli nemt kan analyseres på en enkelt dag eksperiment, de resultater, der er vist her repræsenterer ~ 10 dage eksperimenter.

Figur 7
Figur 7. Fluid sekretionshastighed og transepitel K + Flux er Nedsat i tubuli Regnskabsmæssig en homozygot Null Mutation i NKCC, mens Na + Flux er Uændret. (A) Flydende sekretion sats (nl / min / tubulus) og K + flux (pmol / min / tubulus) blev målt i tubuli fra kontrol fluer (wBerlin) eller fra fluer bærer en homozygot nul mutation i fluen NKCC (w; Ncc69 r2 / Ncc69 r2). n = 18 tubuli / genotype. (B) Fluid sekretionshastighed (nl / min / tubulus) og Na + flux (pmol / min / tubulus) blev målt fra kontrol fluer (wBerlin, n = 13 tubuli) eller fra fluer bærer en homozygot nul mutation i fluen NKCC ( w; Ncc69 r2 / Ncc69 R2, n = 14 tubuli). De viste værdier er middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). NS, ikke signifikant; **, P <0,01;***, P <0,001; ****, P <0,0001. Dette tal blev tilpasset fra Rodan et. al. 14 Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8. Na + / K + -ATPase Genbruger Na + Ind gennem NKCC. (A) Fluid sekretionshastighed (nl / min / tubulus) og Na + flux (pmol / min / tubulus) blev målt i tubuli fra kontrol fluer (wBerlin) i fravær (n = 13 tubuli) eller nærvær (n = 15 tubuli) på 100 pM ouabain, en inhibitor af Na + / K + -ATPase. (B) Fluid sekretionshastighed (nl / min / tubulus) og K + (wBerlin) i fravær (n = 17 tubuli) eller nærvær (n = 17 tubuli) på 100 pM ouabain. K + flux blev også målt i NKCC null tubuli i fravær eller nærvær af ouabain (vægt; Ncc69 r2 / Ncc69 R2, n = 16 - 17 tubuli / tilstand). De viste værdier er middelværdi ± SEM. NS, ikke signifikant; **, P <0,01; ***, P <0,001. Dette tal blev tilpasset fra Rodan et. al. 14 Klik her for at se en større version af dette tal.

Drosophila saltvand
Til 1L:
Afvejes 3,6 g glukose og anbringes i et bægerglas; endelige concentration = 20 mM
Derefter tilsættes:
Komponent Volumen (ml) Slutkoncentration (mM)
H2O ~ 800
2,5 M NaCl 47 117,5
1 M KCI 20 20
1 M CaCl2 2 2
1 M MgCl2 8.5 8.5
1 M NaHCO3 10.2 10.2
1 M HEPES 15 15
1 M NaH 2 PO 4 4.3 4.3
Rør, justere pH til 7,0
Tilføj H2O til slutvolumen på 1 liter
Filtersteriliser; undgå autoklavering (glucose vil caramelize)
Opbevares ved 4 ° C
Kasseres, hvis tegn på bakteriel eller svampevækst

Tabel 1. Gør Drosophila Saline.

Schneiders medium
Komponent Koncentration (mM)
glycin 3.33
L-arginin 2.3
L-asparaginsyre 3.01
L-cystein 0,496
L-cystin 0,417
L-glutaminsyre 5.44
L-glutamin 12.33
L-histidin 2,58
L-isoleucin 1.15
L-leucin 1.15
L-lysinhydrochlorid 9,02
L-methionin 5,37
L-phenylalanin 0,909
L-prolin 14,78
L-serin 2,38
L-threonin 2,94
L-tryptophan 0,49
L-tyrosin 2,76
L-valin 2,56
β-alanin 5.62
CaCl2 5.41
MgSO4 15.06
KCI 21,33 </ td>
KH 2 PO 4 3,31
NaCl 36.21
NaHCO3 4,76
Na 2 HPO 4 4,94
a-ketoglutarsyre 1,37
D-glucose 11.11
fumarsyre 0,862
æblesyre 0,746
ravsyre 0,847
trehalose 5,85
yeastolat 2.000 mg / l

Tabel 2. Sammensætning af Schneiders Medium.

Pre Stolpe Interval Hældning / decil
mM mV mM mV 15 - 150 (præ) 52,8
15 -28,4 15 -29,4 15-150 (post) 54,4
75 9.1 75 9.4 75-150 (præ) 51
150 24.4 150 25 75-150 (post) 52
200 30.6 200 31,9 150-200 (præ) 49,6
150-200 (post) 55,2
Betyde 52.5

Tabel 3. Kalibrering af K + ISE K + ISE er kalibreret i opløsninger indeholdende 15, 75, 150 og 200 mM KCI før og efter måling af eksperimentel udskilt væske.; et eksempel på faktiske målinger er vist i denne tabel. Beregning af hældningen / decil ændring i K + -koncentrationen er vist. For 15-150 mV interval, hældning / decil = mV for 150 mM kalibrering drop - mV for 15 mM kalibrering dråbe. For 75-150 interval, er forskellen divideret med 0,3 [log (150/75)]. For 150-200 interval, er forskellen divideret med 0,125 [log (200/150)]. De seks skråninger (tre pre-eksperiment, tre post-eksperiment) midles sammen for at få den gennemsnitlig hældning / decil. Denne tabel blev tilpasset fra Rodan et. al. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Brugen af ​​Ramsay assay sammen med ionspecifikke elektroder, tillader måling af væske sekretionshastigheder og ionstrømme i isoleret insekt Malpighian (nyre) tubuli. Tyve eller flere tubuli kan analyseres ad gangen, giver højere gennemløb i forhold til assayet individuelle in vitro microperfused tubuli. Desuden ionspecifikke elektroder tillader bestemmelse af ionkoncentrationer i den udskilte væske i situ, begrænse fejl, der kan indføres i overførsel af små volumener af væske til en anden apparat. Kritiske skridt i protokollen omfatter at sikre, at tubuli er dissekeret uden leje eller tårer (hvilket vil forårsage væske, der skal udskilles fra tåre, snarere end den afskårne ende af ureter), og sikre, at ISE fungerer godt ved at bestemme dens hældning før at starte eksperimentet. Selv med omhyggelige dissektioner, er det ikke usædvanligt, at lejlighedsvise tubuli undlader at udskille (op til ~ 10% af tubulidissekeret), men hvis en stor del af tubuli ikke udskiller dette kan være af biologiske årsager (dvs.., meget lave sekretionshastigheder i henhold til denne særlige betingelse). Nogle faldgruber, der kan føre til en ISE ikke fungerer godt, omfatter: ionophor siver ud (som kan skyldes elektrodespidsen bryde eller utilstrækkelig silanisering), eller indførelse af en luftboble ind i spidsen. Disse problemer kan konstateres ved visualisering af elektroden under et sammensat mikroskop og kræver normalt fylde en ny ISE med ionofor, før du fortsætter. Derudover kan en ISE fungere godt i flere dage, eller endda uger, men i sidste ende vil mislykkes, igen mandateringsprocedurer opførelsen af ​​et nyt ISE. Det er også kritisk, at assayet skålen grundigt vaskes ved afslutningen af ​​forsøget, da restsaltene vil ændre den ioniske og osmotiske sammensætning af badning saltvand i efterfølgende eksperimenter.

Det er vores erfaring, Na + ISE beskrevet i denne protokol er less stabil end K + ISE, ofte udviser forværring af dens hældning i løbet af forsøget. Faktisk Jayakannan et al. Beskrives en forbedret Na + ISE baseret på samme ionofor med bedre selektivitet og stabilitet. Deres cocktail inkluderet 3,5% 4-tert -butylcalix [4] aren-tetraeddikesyre tetraethylester, 95,9% 2-nitrophenyl octylether, og 0,6% kalium tetrakis (4-chlorphenyl) borat 26.

Når forsøgslederen er behageligt at udføre dette assay kan indføres mange permutationer til at undersøge den underliggende biologi epitelial iontransport. For eksempel kan tubuli med forskellige genotyper undersøges for at bestemme den rolle, som en specifik transportør eller ionkanal på væske og iontransport 14 eller af ekstracellulære eller intracellulære signalveje regulerer disse transportører eller kanaler 14,27 transepitelial. Badning dråber præparat kan modificeres til at se pårolle af dens særlige komponenter, såsom ioner, glucose eller aminosyrer 9 eller osmolaritet 27,28. Eller hæmolymfe selv kommer fra dyr, der er opdrættet under forskellige betingelser kan anvendes i stedet for badning saltvand 16. Lægemidler, hormoner (eller deres sekundære budbringere) eller peptider kan tilsættes for at fastslå deres virkninger 2,9,14,23,29. I den nuværende protokol, er flydende og ionstrømme i hovedsegmentet undersøgt, siden den oprindelige segment ikke udskiller væske 2, og den nedre segment er uden for badning drop. Dog kan protokollen ændres for at undersøge aktiviteten af de oprindelige eller lavere segmenter 30. Transgene reportere, såsom calcium-sensing aequorin transgen 5 eller pH- og klorid-sensing ChlopHensor transgen 12, kan tillade korrelation af intracellulære ion koncentrationer med transepitel flux. Tilsvarende Efetova et. al. påvist cellespecifik manipulation af cAMP-niveauer under anvendelse af optogenetic kontrol af en fotoaktivt adenylylcyclase, demonstrere forskellige virkninger af cAMP på stjerneformet og vigtigste celler 31.

Mens den nuværende protokol er fokuseret på de Malpighian tubuli af voksne Drosophila melanogaster, har de anvendte teknikker blevet anvendt i andre insekter, herunder Rhodnius prolixus 21, Hemideina maori 24, og flere myg arter 17, samt på larvernes Drosophila tubuli 16. Tilsvarende kan andre ioner udover Na + og K +, såsom H +, Ca2 + eller tetraethylammonium analyseres 30,32, samt toksiner, såsom salicylat 33. Endelig kan ionspecifikke elektrode teknik også bruges til at måle ion koncentrationer i microperfused pattedyr tubuli, hvorved behovet for radiomærkede ioner 34,35.

Sammenfattende anvendelse af Ramsay somsige med ionspecifikke elektroder tillader måling af transepitel væske og ionstrømme fra isolerede Drosophila melanogaster nyretubuli. Sammen med de kraftfulde Drosophila genetiske værktøjer til rådighed, kan molekylære mekanismer for epitelial iontransport blive belyst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/ May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm Fisher FB0875712 Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm Corning Life Sciences Fisher 08-757-100A Specific brand is not important
Scalpel Handle #3 Fine Science Tools 10003-12 Specific brand is not important
Scalpel Blades #1 Fine Science Tools 10011-00 Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30 G x 1/2 Becton Dickinson 305106 Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm Fine Science Tools 26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer Nikon SMZ800 Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick Hobby shop Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers) Hobby shop Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm Warner Instruments 30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm Warner Instruments 30-0044
Nitric acid, 70% Sigma 438073 CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate Fisher 11675911Q Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane Sigma 40136-1ML CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller Narishige PC-10 Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height Fisher 08-748E Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar Fisher 50-821-852 May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh Fisher S161-500 Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G Fisher 50-821-914 May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock Becton Dickinson 309659 May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock Becton Dickinson 309657 May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard Cole-Parmer UX-30600-02 Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector 4 Medical Solutions ADC 9873-10 Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm) Fisher 14-179-110 Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in Fisher 14171208 Specific brand is not important
Modeling clay Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B Sigma 99373 CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X Sigma 71747 Sodium ionophore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether Sigma 73732
Selectophore sodium tetraphenylborate Sigma 72018 CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Schneider's Drosophila medium Life Technologies 21720024
High impedance electrometer World Precision Instruments FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle Warner Instruments 64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented Warner Instruments 64-1007
Silver wire Warner Instruments 64-1318
Micromanipulators, pair Leitz Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage Technical Manufacturing Corporation 81-334-03 This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light Nikon Specific brand is not important
mineral oil Fisher BP-2629 Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip Fine Science Tool 11295-10 May be available from other distributors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramsay, J. A. Active Transport of Water by the Malpighian Tubules of the Stick Insect, Dixippus-Morosus (Orthoptera, Phasmidae). J Exp Biol. 31, 104-113 (1954).
  2. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  3. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  4. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 5207-5212 (1997).
  5. Rosay, P., et al. Cell-type specific calcium signalling in a Drosophila epithelium. J Cell Sci. 110 (15), 1683-1692 (1997).
  6. Dow, J. T., Davies, S. A. Integrative physiology and functional genomics of epithelial function in a genetic model organism. Physiol Rev. 83, 687-729 (2003).
  7. Beyenbach, K. W., Skaer, H., Dow, J. A. The developmental, molecular, and transport biology of Malpighian tubules. Annu Rev Entomol. 55, 351-374 (2010).
  8. Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274, 1039-1049 (1998).
  9. Linton, S. M., O'Donnell, M. J. Contributions of K+:Cl- cotransport and Na+/K+-ATPase to basolateral ion transport in malpighian tubules of Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 202, 1561-1570 (1999).
  10. Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Analysis of epithelial K(+) transport in Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for spatial and temporal heterogeneity. J Exp Biol. 204, 2289-2299 (2001).
  11. Donnell, M. J., Dow, J. A., Huesmann, G. R., Tublitz, N. J., Maddrell, S. H. Separate control of anion and cation transport in malpighian tubules of Drosophila Melanogaster. J Exp Biol. 199, 1163-1175 (1996).
  12. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 14301-14306 (2014).
  13. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 13689-13693 (2004).
  14. Rodan, A. R., Baum, M., Huang, C. L. The Drosophila NKCC Ncc69 is required for normal renal tubule function. Am J Physiol Cell Physiol. 303, 883-894 (2012).
  15. Ianowski, J. P., Christensen, R. J., O'Donnell, M. J. Na+ competes with K+ in bumetanide-sensitive transport by Malpighian tubules of Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 207, 3707-3716 (2004).
  16. Naikkhwah, W., O'Donnell, M. J. Salt stress alters fluid and ion transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: evidence for phenotypic plasticity. J Exp Biol. 214, 3443-3454 (2011).
  17. Donini, A., et al. Secretion of water and ions by malpighian tubules of larval mosquitoes: effects of diuretic factors, second messengers, and salinity. Physiol Biochem Zool. 79, 645-655 (2006).
  18. Maddrell, S. H. Secretion by Malpighian Tubules of Rhodnius movements of Ions and Water. J Exp Biol. 51, 71-97 (1969).
  19. Maddrell, S. H., Overton, J. A. Stimulation of sodium transport and fluid secretion by ouabain in an insect malpighian tubule. J Exp Biol. 137, 265-276 (1988).
  20. Williams, J. C., Beyenbach, K. W. Differential effects of secretagogues on Na and K secretion in the Malpighian tubules of Aedes Aegypti (L). J Comp Physiol. 149, 511-517 (1983).
  21. Maddrell, S. H., O'Donnell, M. J., Caffrey, R. The regulation of haemolymph potassium activity during initiation and maintenance of diuresis in fed Rhodnius prolixus. J Exp Biol. 177, 273-285 (1993).
  22. Messerli, M. A., Kurtz, I., Smith, P. J. Characterization of optimized Na+ and Cl- liquid membranes for use with extracellular, self-referencing microelectrodes. Anal Bioanal Chem. 390, 1355-1359 (2008).
  23. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207, 2599-2609 (2004).
  24. Neufeld, D. S., Leader, J. P. Electrochemical characteristics of ion secretion in malpighian tubules of the New Zealand alpine weta (Hemideina maori). J Insect Physiol. 44, 39-48 (1997).
  25. Greenspan, R. J. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  26. Jayakannan, M., Babourina, O., Rengel, Z. Improved measurements of Na+ fluxes in plants using calixarene-based microelectrodes. J Plant Physiol. 168, 1045-1051 (2011).
  27. Wu, Y., Schellinger, J. N., Huang, C. L., Rodan, A. R. Hypotonicity Stimulates Potassium Flux through the WNK-SPAK/OSR1 Kinase Cascade and the Ncc69 Sodium-Potassium-2-Chloride Cotransporter in the Drosophila Renal Tubule. J Biol Chem. 289, 26131-26142 (2014).
  28. Blumenthal, E. M. Modulation of tyramine signaling by osmolality in an insect secretory epithelium. Am J Physiol Cell Physiol. 289, 1261-1267 (2005).
  29. Dow, J. A., Maddrell, S. H., Davies, S. A., Skaer, N. J., Kaiser, K. A novel role for the nitric oxide-cGMP signaling pathway: the control of epithelial function in Drosophila. Am J Physiol. 266, 1716-1719 (1994).
  30. Dube, K., McDonald, D. G., O'Donnell, M. J. Calcium transport by isolated anterior and posterior Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: roles of sequestration and secretion. J Insect Physiol. 46, 1449-1460 (2000).
  31. Efetova, M., et al. Separate roles of PKA and EPAC in renal function unraveled by the optogenetic control of cAMP levels in vivo. J Cell Sci. 126, 778-788 (2013).
  32. Rheault, M. R., O'Donnell, M. J. Organic cation transport by Malpighian tubules of Drosophila melanogaster: application of two novel electrophysiological methods. J Exp Biol. 207, 2173-2184 (2004).
  33. Donnell, M. J. Too much of a good thing: how insects cope with excess ions or toxins in the diet. J Exp Biol. 212, 363-372 (2009).
  34. Cheng, C. J., Truong, T., Baum, M., Huang, C. L. Kidney-specific WNK1 inhibits sodium reabsorption in the cortical thick ascending limb. Am J Physiol Renal Physiol. 303, 667-673 (2012).
  35. Cheng, C. J., Yoon, J., Baum, M., Huang, C. L. STE20/SPS1-related Proline/alanine-rich Kinase (SPAK) is Critical for Sodium Reabsorption in Isolated Perfused Thick Ascending Limb. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).

Tags

Cellular Biology Ramsay assay ion-specifikke elektrode renal tubulus Malpighian tubulus, Fluid sekretion kalium flux natrium flux epithelial ion transport renal fysiologi
Anvendelse af Ramsay-analysen til at måle Fluid sekretion og Ion Flux priser i<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Malpighian tubulus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use … More

Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J. Vis. Exp. (105), e53144, doi:10.3791/53144 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter