Introduction
الهدف من هذا الإجراء هو تطوير الكسور الميتوكوندريا المخصب التي تحقق ما يكفي من نواتج الأيض الميتوكوندريا لالايض الدراسات باستخدام ذبابة الفاكهة السوداء البطن. في تجربتنا، والايض التحليل باستخدام أساليب الاستخراج الخلوية كلها غير قادرة على اكتشاف التغيرات الطفيفة الأيض الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة. ومع ذلك، تجزئة الميتوكوندريا قبل التحليل الايض يزيد من حساسية لتحديد التحولات الأيض الميتوكوندريا.
الميتوكوندريا هي العضيات الخلوية مسؤولة عن توفير 90٪ من الطاقة التي الخلايا بحاجة لوظيفة عادية 1. في السنوات الأخيرة تم الاعتراف بأن الميتوكوندريا تلعب دورا أكثر نشاطا في وظيفة الخلوية والعضوي من مجرد إنتاج أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، ويتم الاعتراف الآن كمراكز لتنظيم التمثيل الغذائي التوازن 2،3. الميتوكوندريا هي نتيجة لعملية endosymbiotic التي ديساندمجت الأنساب الميكروبية صبغة ~ 1.5 مليار سنة مضت 4. كما الميتوكوندريا تطورت إلى العضيات الحقيقية، وأدرجت الجينات من معايش جواني في الجينوم النووي الناشئة. في الحيوانات اليوم، ما يقرب من 1500 بروتينات الميتوكوندريا هي المشفرة النووية، بينما لا تزال 37 الجينات في الحمض النووي المتقدري، 13 منها ترميز البروتينات الميتوكوندريا التي هي مفارز من المجمعات انزيم الفسفرة التأكسدية 5. هناك حاجة إلى التنسيق بين الميتوكوندريا ومقصورات النووية للحفاظ على وظيفة الميتوكوندريا سليمة.
باستخدام الأساليب المذكورة هنا كنا قادرين على اكتشاف التغيرات الأيضية الميتوكوندريا في ذبابة الفاكهة التي تنتج عن التلاعب في التنسيق بين جينوم الميتوكوندريا والنووية. كنا سلالة من ذبابة الفاكهة التي و mtDNA من الأنواع الشقيقة D. وضعت simulans على D. واحد البطن خلفية النووية 6. هذا mitonuclear 'عطلت'ومقارنة التركيب الوراثي إلى التركيب الوراثي mitonuclear "الأصلي"، أو تطورت المشارك لD. البطن تحمل نفس الجينوم النووي مع D. شعبه الأصيل البطن و mtDNA. وD. البطن وD. simulans mtDNAs تختلف باختلاف ~ 100 الأحماض الأمينية و> 500 بدائل مرادفة التي تؤثر mitonuclear 7،8 الاتصالات. ولدت لنا مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات المخصب الميتوكوندريا لدراسة التحولات الأيض ردا على الإجهاد الدوائي. نحن هنا تظهر أنه عند استخدام الميتوكوندريا المخصب الكسور نكتشف التحولات وضوحا في الأيض الميتوكوندريا بين الأصلي،-تطورت شارك الوراثي تحمل D. mtDNAs البطن وراثى تعطلت تحمل D. simulans و mtDNA. في المقابل، فإن التغييرات الأيض بين هذه الأنماط الجينية هما خفية باستخدام أساليب العادية التي تستخدم كله استخراج الطاير. ولذلك، قدمت هذه الطريقة مسار لفهم كيفية mtDNAs توسط التغييرات في الميتوكوندريااستجابة إلى أدوية مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الكواشف وحلول
- إعداد الطعام ذبابة وسائل الإعلام
- حرارة المكونات الذبابة 11٪ سكر، 2٪ الخميرة autolyzed، 5.2٪ دقيق الذرة، أجار 0.79٪ ث / ت في الماء في موقد وضعت في 90 ° C. اثارة بانتظام حتى يتم الحصول على خليط متجانس كثيف قليلا. إعداد الحجم النهائي من 550 مل من ذبابة الغذائية لما مجموعه 100 قارورة مع 5 مل يطير الطعام في كل منهما.
- إزالة من مصدر التدفئة، وإثارة أحيانا حتى الطعام يبرد إلى 80 درجة مئوية وإضافة 0.2٪ tegosept ميثيل 4-hydroxybenzoate الذائبة في الايثانول 95٪.
- تقسيم الطعام في مجلدين على قدم المساواة. إضافة 1.1 مل من 50 ملي rapamycin يذوب في الإيثانول إلى مجلد واحد و 1.1 مل من الايثانول لحجم الآخر. تحريك rapamycin والحلول الإيثانول إلى الطعام. مما لا شك فيه أن درجة الحرارة تنخفض إلى 50 درجة مئوية قبل إضافة المخدرات.
- العزلة العازلة
- إعداد 500 مل من العزلة العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 مم 3- (N </ م> -morpholino) حمض propanesulfonic (اجتماعات الأطراف) و1 ملم ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 2.5 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA)] في الماء.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية.
- استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- غسل العازلة
- إعداد 500 مل من غسل العازلة [225 ملي المانيتول، 75 ملي السكروز، 10 ملي بوكل، 10 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك و 5 ملي KH 2 PO 4] في الماء.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. إن الأس الهيدروجيني الأولية يكون الحمضية.
- استخدام معقم زجاجات تخزين التصفية مع حجم المسام 0.22 ميكرون لتعقيم الحل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. تربية من سلالات ذبابة الفاكهة
- للسيطرة على كثافة اليرقات خلال التنمية، وضع 25 زوجا من الآباء والأمهات في لزجاجة الثقافة والسماح لهم لوضع البيض لمدة 48 ساعة. <لى> إزالة أولياء الأمور بعد 48 ساعة لتنظيم كثافة البيض.
- كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 باستخدام ذرية F1 الناشئة، حتى يتم تحقيق جيلين من هذه السيطرة الكثافة.
- لجمع الكبار، تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO 2) ومنفصلة حسب الجنس.
- استخدام مرحلة منظم واحد لتسليم CO النقي 2 من خزان ضغوط عالية في تدفق مستمر من 5 رطل. لتجنب الكهرباء الساكنة، واستخدام أنابيب بلاستيكية لتحفيز CO 2 إلى 500 مل تصفية قارورة بالماء.
- استخدام سدادة مطاطية مع فتحة واحدة لاغلاق القارورة. استخدام أنابيب بلاستيكية لتوصيل الفتحة الجانبية للقارورة لوحة CO 2.
- وضع الذباب في لوحة لمدة لا تتجاوز 10-15 دقيقة. السماح للتعافي من التخدير لمدة 24 ساعة قبل وضعها في ظروف تجريبية.
- لتوليد ما يكفي من نواتج الأيض لكسور المخصب الميتوكوندريا، استخدم 300 الذباب في العينة. هنا، استخدام الإناث، ولكن gendeص قد تختلف في تجارب أخرى. نقل 150 الذباب إلى محلية الصنع 1 L الديموغرافيا القفص. السماح بالوصول إلى 5 مل من ذبابة الطعام في قارورة.
- نقل 150 الذباب المتبقية إلى 1 L قفص آخر. لا overpopulate أقفاص مع أكثر من 150 الذباب.
- استخدام ست عينات تكرار في حالة تجريبية. منذ مقتطفات الحيوانية كلها تسفر عن مزيد من نواتج الأيض، لتوليد العزلات 1 عينة من الحيوان كله، ونقل 50 أنثى الذباب في قفص واحد. أما بالنسبة للعزلة الميتوكوندريا، استخدم ست عينات تكرار في حالة تجريبية.
- مكان أقفاص عند 25 درجة مئوية مع دورة 12 ساعة ضوء و 12 ساعة الظلام.
- توفير المواد الغذائية الطازجة كل 2 أو 3 أيام في قارورة مع 5 مل من المواد الغذائية للمحافظة على جودة الطعام.
- الحفاظ على الذباب على الطعام لمدة 10 يوما. هناك حاجة إلى هذه الخطوة لعلاج rapamycin 7. والعلاج أو غيره من الظروف تختلف.
3. عزل الميتوكوندريا الكسور
- تفريغ الذباب من قفص واحد (150 الذباب) إلىالزجاج تفلون dounce الخالط مليئة 1 مل من العازلة عزل المبردة.
- التجانس من خلال نقل ما يصل مدقة وهبوطا لمدة 15 السكتات الدماغية. إبقاء هاون على الجليد للحفاظ على الميتوكوندريا سليمة.
- نقل جناسة لأنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
- اتخاذ طاف والطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية إلى إثراء للالميتوكوندريا.
- كما يحتوي على طاف الكسر عصاري خلوي، تجاهل طاف أو استخدامه لاجراء تجارب بديلة. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من غسل العازلة.
- كرر الخطوات من 3،1-3،5 لالقفص الثاني. الجمع بين الكريات معلق على حد سواء أقفاص في أنبوب microcentrifuge المبردة.
- الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف وفلاش تجميد بيليه في النيتروجين السائل.
- تخزين الكسور المخصب الميتوكوندريا في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة.
- بدلا من ذلك، لمرحلة ما قبل الحيوان كلهparation، ضع البالغين في أنبوب microcentrifuge المبردة. فلاش تجميد القارورة في النيتروجين السائل ومخزن البالغين في -80 ° C أو انخفاض درجة الحرارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عن طريق شرح بروتوكول أعلاه، أجرينا تحليل metabolomic على الكسور المخصب الميتوكوندريا ومقتطفات الحيوانية كلها لاختبار تأثير المخدرات rapamycin على mtDNAs المتباينة 7. لقد نجينا 200 ميكرومتر من rapamycin عن طريق إذابة الدواء في الغذاء الطاير. تعرضت الذباب إلى rapamycin لمدة 10 يوما. وقد تم الحصول على نواتج من مقتطفات ذبابة كاملة ومقتطفات من الميتوكوندريا باستخدام اللوني للغاز مطياف الكتلة (GC / MS) والسائل اللوني، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي (LC / MS / MS) باستخدام أساليب الاستخلاص بالمذيبات القياسية.
ويبين الشكل 1 إغناء للبروتين النقل غشاء PORIN كمؤشر لتخصيب الميتوكوندريا في الكسور الميتوكوندريا. كان البروتين PORIN لا يمكن الكشف عنها في الكسور عصاري خلوي. على العكس، لم يتم الكشف عن البروتين تويولين في جزء الميتوكوندريا، سوggesting التلوث القليل من البروتينات عصاري خلوي الشكل 2 والشكل 3 عرض تحليل مكونات المبدأ (PCA) من لمحات الأيض كاملة من 'الأصلي' D. سلالة البطن (OreR) وسلالة "عطلت" من الذباب إيواء و mtDNA من D. simulans وDNA النووي من D. البطن سلالة OreR (sm21). تعرضت كل من السلالات إلى rapamycin المخدرات. يتم عرض البيانات على مؤامرة ثنائية العنصر الرئيسي محاور 1 و 2 لتصور تأثير العلاج وmtDNAs 7،9. يتم عرض الأيض تم الحصول عليها باستخدام معيار كله استخراج ذبابة في الشكل 2A. ويبين الشكل 2B مؤامرة PCA مماثلة لنواتج الأيض في مقتطفات المخصب الميتوكوندريا. لمقتطفات ذبابة كاملة (الشكل 2A)، والعلاج rapamycin تنخل العينات إلى قيم أقل بكثير من PC2. ومع ذلك، والتغيرات في الأيض بسبب و mtDNA جنرالotype خفية، منذ OreR وsm21 mtDNAs تتعرض لrapamycin أو مركبة السيطرة هي المجاورة عن كثب أو التداخل في PCA الفضاء. ومع ذلك، عند استخدام مقتطفات الميتوكوندريا المخصب، تظهر mtDNAs الآثار rapamycin واضحة على ملامح الأيض الميتوكوندريا. على وجه الخصوص، rapamycin له تأثير قوي على ملامح المستقلب من سلالة OreR، كما هو موضح من قبل النزوح على طول محور PC1. ولكن، على 'تعطيل' sm21 و mtDNA الوراثي، وتشريد ملف الأيض لحالة مراقبة الغذاء من أن سلالة OreR الأصلي (المضلعات الأحمر والأسود، على التوالي، في الشكل 2B). ونتيجة لذلك، فإن العلاج rapamycin لديها بشكل ملحوظ أقل من تأثير على التحول من المناظر الطبيعية الأيض في التركيب الوراثي و mtDNA تعطلت، sm21 (قارن المضلعات الحمراء والزرقاء في الشكل 2B).
ويبين الشكل 3 PCA صالكثير من المركبات تشارك في توازن الطاقة (مجموعة فرعية من كافة الأيض، تقتصر على العوامل المساعدة والفيتامينات وكريبس سيطة دورة)، وغالبا ما تقع داخل الميتوكوندريا. هنا مرة أخرى، والتحولات المستقلب من الكسور الميتوكوندريا المخصب تظهر سلوك مختلفة من تلك التي من مقتطفات الحيوانية كلها.
وتوضح هذه النتائج مدى المعلومات التي حصلت عليها استخراج المخصب الميتوكوندريا ومقتطفات الحيوانية كلها الأيض تختلف ولكن يكمل بعضها بعضا، مع استخراج المخصب الميتوكوندريا يجري أكثر حساسية للتغيرات التمثيل الغذائي في الميتوكوندريا.
الشكل 1. تحليل الغربية وصمة عار يظهر الفصل الفعال من الميتوكوندريا في الكسور الميتوكوندريا. كانت الأجسام المضادة المستخدمة ضد PORIN (بروتين الغشاء الخارجي الميتوكوندريا) وتويولين (بروتين عصاري خلوي). بروتين وتم قياس كمية وفرة من الكسور الميتوكوندريا وعصاري خلوي باستخدام حمض bicinchoninic (BCA) فحص. تم تحميل 30 ميكروغرام من البروتين الكلي في كل حارة. تم تنفيذ اثنين من قلع مستقلة.
الشكل 2. تحليل المبدأ المكون (PCA) من المركبات التي تم الحصول عليها باستخدام عينات الحيوانات كلها مقابل مقتطفات المخصب الميتوكوندريا على الذباب يحمل OreR وsm21 النسخ المتنوعة الميتوكوندريا. (A) PCA 210 الأيضية التي تم تحديدها في العينات الحيوانية كلها. (B) PCA 230 الأيض الكشف على مقتطفات الميتوكوندريا. وتهدف المضلعات النقاط المحيطة بها للمساعدة في التصور من العينات تكرار ستة لكل معاملة.ك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التحليل الأساسي المكون من نواتج الأيض تشارك في توازن الطاقة على الذباب يحمل OreR وsm21 النسخ المتنوعة الميتوكوندريا. (A) PCA من 12 نواتج الطاقة من مقتطفات ذبابة كاملة و 13 نواتج الطاقة من مقتطفات الميتوكوندريا. ويقصد (B) المضلعات النقاط المحيطة بها للمساعدة في التصور من العينات تكرار ستة لكل معاملة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي: 1) تربية كافية الذباب في الفضاء وفيرة. من المهم جدا أن لا overpopulate الأقفاص الديموغرافيا مع أكثر من 150 الذباب لكل منهما؛ 2) تغيير الغذائي للأقفاص في كثير من الأحيان لتجنب المنافسة المواد الغذائية والنقص الغذائي. و3) الحفاظ على جميع العينات عند 4 درجة مئوية لضمان سلامة خلال عزل جزء الميتوكوندريا. ويوصى أيضا أن يبرد عازلة العزلة، وغسل العازلة، والزجاج تفلون dounce الخالط قبل الاستخدام. للحد من التلوث عصاري خلوي من الفصائل الميتوكوندريا المخصب، بيليه الميتوكوندريا من الخطوة 3.5 يمكن غسلها غسل العازلة.
استخراج الأيض من الكسور الميتوكوندريا المخصب يتطلب عددا كبيرا من العينات تكرار (6 مكررات / حالة تجريبية). في المجموع، وتستخدم 24 أقفاص للأرقام 1 و 2. ونحن نوصي أداء استخراج جميع لياليamples نفس اليوم لخفض التباين التجريبية. على الرغم من أن ذلك ممكنا، هذا البروتوكول ينطوي التخطيط الدقيق وإعداد المواد اللازمة في وقت مبكر. هناك حاجة إلى وضع العلامات من الأنابيب في وقت مبكر، وتصميم خطة لضمان اتساق فترات الانتظار بين العينات للحفاظ على جودة العينة وتقليل التباين بين مكررات.
المخازن المؤقتة التي تستخدم عادة لاستخراج الميتوكوندريا تحتوي على السكريات 10،11. وبالتالي، فإن تحليل معينة الأيض السكر قد تتأثر طريقة الاستخراج. على الرغم من أننا لم استخدمها في تحليلنا، قد تكون مخازن استخراج بوكل بديلا للمخازن عزل الميتوكوندريا التي تحتوي على السكريات 12.
ونظرا لطبيعة التماثل الساكن شبكات الأيضية ونظام معقد من الإشارات الخلوية التي تتوسط هذه الاستجابة، قد يتم الكشف عن التغييرات في استقلاب الميتوكوندريا تحولات في كامل حمامات أيض الخلية. في حالة mitochondتنظيم الريال لهذه النظم، قد أعاق تحولات الأيض خفية ما لم يتم استخراج ما يكفي من نواتج الأيض من الكسور المخصب الميتوكوندريا. في النظم نموذج حيث الكثير من الميتوكوندريا يمكن عزلها عن الأنسجة، كشف الايض عالية الدقة بنجاح التغيرات في الظواهر الميتوكوندريا 13. ومع ذلك، في ذبابة الفاكهة السوداء البطن أو إيواء الأيض نوعية كافية لتكوين جيد للعينة قد يشكل تحديا. باستخدام هذا البروتوكول حصلنا على كمية عالية، وجودة وتنوع الأيض لإثبات أن البروتوكولات استخراج مختلفة تكشف عن تحولات الأيض متميزة عن الكسور الميتوكوندريا كلها ذبابة مقابل. على الرغم من أن لطخة غربية للبروتينات الميتوكوندريا وعصاري خلوي تشير التلوث القليل من البروتينات في الكسور اثنين، لتأكيد القياسات الكمية مفصلة الأيض الميتوكوندريا، خطوات إضافية للحد من التلوث من المركبات عصاري خلوي في جزء الميتوكوندريا يمكن أن يكون تطبيق ورقةالعبوات الناسفة. قياس نواتج قبل تجميد العينة ومقارنة هذه المركبات لتلك التي حصلت بعد خطوة / الذوبان تجميد يمكن أن يوفر تقدير أكثر دقة من نواتج محددة الميتوكوندريا. ومع ذلك، في هذا النموذج حيث أننا التلاعب في جينوم الميتوكوندريا، والإجراءات قمنا تستخدم لإعداد العينات بالمعلومات بشكل خاص، وربما تشير إلى مسارات جديدة للبرمجة التمثيل الغذائي تتم من خلال الميتوكوندريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
