Introduction
이 절차의 목적은 초파리를 이용하여 대사 체학 연구에 대한 충분한 미토콘드리아 대사 산물을 산출 풍부한 미토콘드리아 분획을 개발하는 것입니다. 우리의 경험에 의하면, 전체 세포 추출 방법을 사용하여 대사 체학 분석은 초파리의 미묘한 미토콘드리아 대사 산물의 변화를 감지 할 수 없습니다. 그러나, 종래 대사 체학 분석 미토콘드리아 분별은 미토콘드리아 대사 변화를 식별하기 위해 감도를 증가시킨다.
미토콘드리아는 세포가 정상적인 기능 (1)에 필요한 에너지의 90 %를 제공 할 책임이 세포 소기관이다. 최근 몇 년 동안 그것은 미토콘드리아 단지 아데노신 삼인산 (ATP)를 생산하는 것보다 세포 및 유기체 기능에 훨씬 더 역동적 인 역할을하고, 지금 대사 항상성의 2,3의 규제를위한 허브로 인식되는 것을 인식하고있다. 미토콘드리아는 DIS되는 endosymbiotic 프로세스의 결과tinct 미생물 계통 1.5 억년 전에 4 ~ 합병했다. 미토콘드리아에 해당하는 세포 기관으로 발전으로, endosymbiont에서 유전자 신흥 핵 게놈에 통합되었다. 37 유전자가 산화 적 인산화 (5)의 효소 복합체의 서브 유닛이다 미토콘드리아 단백질을 인코딩 13있는 미토콘드리아 DNA에 남아있는 동안 동물 오늘날, 약 1,500 미토콘드리아 단백질은 핵 인코딩됩니다. 미토콘드리아 및 핵 구획 간의 조정은 미토콘드리아 적절한 기능을 유지하는데 필요하다.
여기에 설명 된 방법을 이용하여, 우리는 미토콘드리아 게놈과 핵 사이의 조정 조작의 결과 초파리 미토콘드리아 대사의 변화를 감지 할 수 있었다. 우리는 미토콘드리아 DNA 라 자매 종에서 초파리의 변형을 사용 simulans는 단일 D. 위에 놓는다 핵 배경 6 melanogaster의. 이 '중단'mitonuclear유전자형은 D의 '기본', 또는 공동 발전 mitonuclear 유전자형을 비교 하였다 네이티브 (D)와 같은 핵 게놈을 들고 melanogaster의 미토콘드리아 DNA를 melanogaster의. D. melanogaster의 및 D simulans mtDNAs 100 ~에 의해 아미노산과 mitonuclear 통신 7,8에 영향을 미칠> 500 동의어로 대체를 다릅니다. 우리는 약리학 적 스트레스에 반응하여 대사 산물의 변화를 연구하기 위해 전체 비행 추출물과 미토콘드리아 농축 추출물을 생성합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아 농축 분수를 사용하는 경우 우리는 (D)를 운반하는 네이티브, 공동 발전 유전자형 사이의 미토콘드리아 대사에 뚜렷한 변화를 감지 것을 보여 melanogaster의의 mtDNAs와 D를 들고 혼란 유전자형 simulans 미토콘드리아 DNA. 반면, 이들 두 유전자형 간의 대사 변화는 전체 플라이 추출물을 이용하는 통상의 방법을 사용하여 미묘. 따라서,이 방법은 mtDNAs이의 미토콘드리아 변화를 중재 방법을 이해하는 경로를 제공다른 약물에 반응.
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Protocol
1. 시약 및 솔루션
- 플라이 음식과 미디어의 준비
- 열 플라이 재료를 90 ℃로 설정 열판에서 물에 V / W 0.79 % 한천 11 % 설탕, 2 % 자기 분해 된 효모, 5.2 %의 옥수수 가루,. 균질 혼합물을 약간 조밀 얻어 질 때까지 정기적으로 교반한다. 각각의 음식을 비행 5 ㎖와 100 병의 총 비행 음식의 550 ML의 최종 부피를 준비합니다.
- , 열원으로부터 제거 음식 아래 80 ° C로 냉각 될 때까지 때때로 교반하고, 95 % 에탄올에 녹인 0.2 % tegosept 메틸 -4- 히드 록시 벤조 에이트를 추가한다.
- 두 개의 동일한 볼륨에서 음식을 분할합니다. 다른 볼륨에 에탄올 50 mm의 하나의 볼륨에 에탄올 라파 마이신의 1.1 ml의 1.1 ML을 추가합니다. 라파 마이신과 음식에 에탄올 솔루션을 저어. 온도가 약을 추가하기 전에 50 ° C로 감소 있는지 확인하십시오.
- 절연 버퍼
- 절연 버퍼 [225 mM의 만니톨, 75 mM의 자당, 10 mM의 3- (N <500 ml의 준비/ EM> -morpholino) 프로판 술폰산 (MOPS) 및 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 2.5 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민 (BSA)] 물.
- 수산화 나트륨을 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. 초기 pH는 산성이 될 것입니다.
- 용액을 멸균하고 4 ℃에서 보관하는 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 멸균 필터 저장 병을 사용.
- 세척 버퍼
- 세척 버퍼 [225 mM의 만니톨, 75 mM의 자당, 10 mM의 KCl을 10 mM 트리스 염산, 5 mM의 KH 2 PO 4] 물 500 mL로 준비합니다.
- 수산화 나트륨을 사용하여 7.2로 pH를 조정한다. 초기 pH는 산성이 될 것입니다.
- 용액을 멸균하고 4 ℃에서 보관하는 0.22 ㎛의 공극 크기를 갖는 멸균 필터 저장 병을 사용.
초파리 균주 2. 양육
- , 개발 과정에서 유충 밀도를 제어 할 문화 병에 부모 25 쌍을 배치하고 48 시간 동안 알을 낳기 할 수 있도록합니다. <리> 달걀의 밀도를 조절하기 위해 48 시간 후 부모를 제거합니다.
- 반복 신흥 F1 자손을 사용하여 2.1 및 2.2 단계, 그래서이 밀도 제어의 두 세대가 달성된다.
- 성인을 수집, 이산화탄소 (CO 2)와 성을 분리하여 파리 마취.
- 5 PSI의 연속적인 흐름에 높은 압력을 탱크로부터 전달되는 순수 CO 2 싱글 스테이지 조정기를 사용한다. 정전기를 방지하려면 물에 플라스크를 필터링 500 ml의에 이산화탄소를 촉진하기 위해 플라스틱 튜브를 사용합니다.
- 플라스크를 밀봉 한 구멍이있는 고무 마개를 사용합니다. CO 2 패드에 플라스크의 측면 구멍을 연결하는 플라스틱 튜브를 사용합니다.
- 10 ~ 15 분 이상 더 이상 패드에 파리를 놓습니다. 실험 조건에 배치하기 전에 24 시간 동안 마취에서 복구 할 수 있습니다.
- 미토콘드리아 풍부한 분수에 충분한 대사 산물을 생성 샘플 당 300 파리를 사용합니다. 여기에, 여성을 사용하지만, gendeR은 다른 실험에서 다를 수 있습니다. 집에서 만든 1 패 인구 통계학 케이지 (150) 파리를 전송합니다. 유리 병에 플라이 음식을 5 ml에 액세스 할 수 있습니다.
- 또 다른 1 패 케이지에 남아있는 150 파리를 전송합니다. 150 개 이상의 파리와 케이지에 너무 많이하지 마십시오.
- 실험 조건에 따라 여섯 복제 샘플을 사용합니다. 전체 동물 추출물보다 대사 산물을 얻을 수 있기 때문에, 전체 동물의 1 샘플이 분리 생성 (50) 여성 한 케이지 (으)로 운항하는 항공사 전송합니다. 미토콘드리아 분리에 관해서는, 실험 조건에 따라 여섯 복제 샘플을 사용합니다.
- 12 시간 빛과 12 시간의 어둠의주기와 25 ° C에서 장소 케이지.
- 음식 품질을 유지하기 위해 음식의 5 ml의 바이알에서 매 2, 3 일 신선 식품을 제공한다.
- 십일 음식에 파리를 유지한다. 이 단계는 라파 마이신 치료 7 필요합니다. 다른 치료 또는 조건이 다를 수 있습니다.
미토콘드리아 분획 3. 분리
- 덤프로 한 케이지 (150 파리)에서 운항하는 항공사유리 테플론 다운스 균질는 냉장 분리 버퍼 1ml를 가득.
- 아래 15 스트로크 유봉 위를 이동하여 균질화. 그대로 미토콘드리아를 유지하기 위해 얼음에 박격포를 유지합니다.
- 4 ℃에서 5 분 300 XG에 1.5 ML 튜브와 원심 분리기로 전송 균질.
- 미토콘드리아에 대해 풍부하게 4 ℃에서 10 분 동안 6,000 XG에 뜨는 원심 분리기를 가져 가라.
- 상층 액은 세포질 부분을 포함 바와 같이, 상층 액을 제거 또는 대체 실험을 위해 사용합니다. 세척 완충액 300 μL에 펠렛을 재현 탁.
- 두 번째 케이지 3.5 - 반복 3.1 단계를 반복합니다. 극저온 microcentrifuge 관에서 모두 케이지의 재현 탁 알약을 결합합니다.
- 4 ℃에서 10 분 동안 6,000 XG에 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 액체 질소에 펠렛을 플래시 동결.
- -80 ° C 이하의 온도에서 미토콘드리아 풍부한 분수를 저장합니다.
- 또한, 전체 동물 사전에 대한paration, 극저온 microcentrifuge 관에서 성인을 놓습니다. C 이하의 온도 ° -80에서 액체 질소 저장 성인 병을 플래시 동결.
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Representative Results
프로토콜은 위에서 설명 된 사용하여, 우리는 발산 mtDNAs 7 라파 마이신 약물의 효과를 시험하기 위해 미토콘드리아 분획을 농축 및 전체 동물 추출물에 대사 체 분석을 수행 하였다. 우리는 플라이 음식에 약물을 용해하여 라파 마이신의 200 μM을 전달했다. 파리 10 일 라파 마이신에 노출되었다. 전체 비행 추출물로부터 미토콘드리아 대사 추출물로부터 용매 추출은 표준 방법을 사용하여 가스 크로마토 그래피 질량 분석 (GC / MS) 및 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC / MS / MS)를 사용하여 수득 하였다.
도 1은 미토콘드리아 분획에서 농축 미토콘드리아의 지표로 막 수송 단백질의 포린 농축을 나타낸다. 포린 단백질은 세포질 분획 탐지했다. 반대로, 튜 불린 단백질을 미토콘드리아 분획, SU 검출되지 않았다세포질 단백질의 작은 오염을 ggesting. '네이티브'(D)에서 전체 대사 프로파일 2와 그림 3은 원칙 구성 요소 분석 (PCA)를 그림 melanogaster의 변형 (ORER)와 D에서 미토콘드리아 DNA를 품고 파리의 '파괴'변형 simulans와 D에서 핵 DNA melanogaster의 변형 ORER (SM21). 두 균주를 약물 라파 마이신에 노출시켰다. 주성분의 바이 그래프 1 및 2와 mtDNAs 7,9 치료의 효과를 가시화하기 위해 축으로 데이터가 표시되어있다. 표준 온 플라이 추출물을 사용하여 수득 대사는도 2a에 도시되어있다.도 2b는 미토콘드리아 대사 농축 추출물위한 PCA 유사한 플롯을 도시한다. 전체 비행 추출물 (도 2a)를 들어, 라파 마이신 처리 샘플 PC2의 상당히 낮은 값을 가려. 그러나, 미토콘드리아 DNA 세대에 의한 대사 산물의 변화라파 마이신 또는 제어 차량에 노출 ORER와 SM21 mtDNAs는 PCA 공간에 밀접하게 인접 또는 중복 때문에, 미묘한 otype 있습니다. 풍부한 미토콘드리아 추출물을 사용하는 경우 그러나, mtDNAs는 미토콘드리아 대사 프로파일에 고유 한 라파 마이신의 효과를 보여줍니다. 특히, 라파 마이신은 PC1 축 방향 변위에 의해 도시 ORER 균주의 대사 프로파일에 강한 영향을 미친다. 그러나, '파쇄'SM21 미토콘드리아 유전자형에, 제어 음식 조건 대사 프로파일은 (도 2b에 각각 빨간색과 검은 색 다각형) 네이티브 ORER 균주의 변위된다. 그 결과, 라파 마이신 처리는 중단 미토콘드리아 유전자형, SM21에서 대사 풍경 시프트 (도 2b에 적색 및 청색과 비교 다각형)의 효과를 현저하게 적게 갖는다.
그림 3은 PCA의 페이지를 보여줍니다에너지 항상성에 관여하는 대사 산물을 많이 자주 미토콘드리아의 내부에 위치, (모든 대사 산물의 일부는 보조 인자, 비타민, 크렙스 회로 중간에 한함). 여기서 다시, 농축 된 미토콘드리아 분획에서 대사 변화는 전체 동물 추출물에서보다 다른 동작을 나타낸다.
이러한 결과는 다를 수 있지만, 미토콘드리아 농축 추출물이 미토콘드리아의 대사 변화에 더 민감하여, 서로를 보완하는 방법 대사 미토콘드리아 농축 추출물 및 전체 동물 추출하여 얻은 정보를 보여줍니다.
그림 1. 웨스턴 블롯의 미토콘드리아 분획에서 미토콘드리아의 효율적인 분리를 보여주는 분석. 사용 된 항체는 포린 반대했다 (미토콘드리아 외막 단백질)와 튜 불린 (세포질 단백질). 단백질 미토콘드리아와 세포질 분획의 풍요 로움은 bicinchoninic 산 (BCA) 분석법을 이용하여 정량 하였다. 총 단백질의 30 μg의 각 레인에로드되었다. 두 개의 독립적 인 추출을 실시 하였다.
전체 동물 샘플 대 ORER를 들고 파리에 미토콘드리아 농축 추출물과 미토콘드리아의 일배 체형을 SM21을 사용하여 얻은 대사의 그림 2. 주성분 분석 (PCA). 전체 동물의 샘플에서 발견 (210) 대사의 (A) PCA. 미토콘드리아 추출물에서 발견 (230) 대사의 (B) PCA. 점을 둘러싸는 다각형 각 치료 여섯 복제 샘플의 시각화를 돕기 위해 의도된다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
ORER를 들고 파리와 SM21 미토콘드리아 일배 체형에 에너지 항상성에 관여하는 대사 산물의 그림 3. 주성분 분석. 전체 비행 추출물 12 에너지 대사 및 미토콘드리아 추출물 13 에너지 대사의 (A) PCA. 포인트 주변 (B) 다각형 각 치료를위한 여섯 개의 복제 샘플의 시각화를 지원하기위한 목적으로 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 1) 풍부한 공간에서 충분히 파리를 양육. 그것은 150 개 이상의 파리 각각 인구 통계학 새장에 너무 많이하지 않는 매우 중요하다; 2) 자주 식품 영양 학적 스트레스 및 경쟁을 방지하기 케이지 음식을 변경하는 단계; 3) 4 ° C에서 모든 샘플을 유지하는 것은 미토콘드리아 부분의 분리시 무결성을 보장합니다. 또한 분리 완충액 세척 완충액, 및 사용 전에 유리 - 테플론 다운스 균질기를 진정 권장한다. 풍부한 미토콘드리아 파벌의 세포질 오염을 줄이기 위해, 단계 3.5에서 미토콘드리아 펠릿을 세척 완충액으로 세척 할 수있다.
풍부한 미토콘드리아 분획에서 대사 산물의 추출은 복제 샘플 (6 복제 / 실험 조건)의 높은 숫자를 필요로한다. 총, 24 케이지는도 1 및 2에 사용된다. 우리는 (S)의 추출을 행하는 것을 권장실험적인 변동성을 감소시키기 위해 같은 날 불가능한 명령어. 가능하지만,이 프로토콜은 신중한 계획과 사전에 필요한 재료의 준비를 수반한다. 미리 튜브 라벨, 및 샘플들 사이의 대기 시간의 일관성을 확보하기위한 계획을 설계는 샘플 품질을 유지하기 위해 그리고 복제 사이의 변화를 감소시킬 필요가있다.
일반적으로 미토콘드리아를 추출하는 데 사용되는 버퍼는 설탕 (10, 11)를 포함; 따라서, 특히 당 대사 분석 추출법에 의해 영향을받을 수있다. 우리의 분석에 이들을 사용하지 않았지만, KCl을 추출 버퍼 (12)를 포함하는 당 미토콘드리아 절연 버퍼에 대한 대안 일 수있다.
때문에 신진 대사 네트워크의 항상성 자연이 응답을 매개 세포 신호 복잡한 시스템으로, 미토콘드리아 대사의 변화는 전체 세포의 대사 산물 풀의 변화에 의해 감지 될 수있다. mitochond의 경우충분히 대사는 미토콘드리아 농축 분수에서 추출되지 않는 이러한 시스템의 리얼 규제, 미묘한 대사 변화는 방해 할 수있다. 미토콘드리아 많이 조직으로부터 단리 할 수 모델 시스템에서, 고해상도 대사 체학은 미토콘드리아 13 표현형의 변화를 검출 성공했다. 그러나, 초파리에서, 샘플의 좋은 구성에 대한 충분한 품질의 대사를 은닉하는 도전을 제시 할 수있다. 우리는 높은 수량, 품질 및 대사 산물의 다양한 얻을이 프로토콜을 사용하면 다른 추출 프로토콜 전체 비행 대 미토콘드리아 분획에 대한 별개의 대사 변화를 밝힐 것을 증명합니다. 미토콘드리아와 세포질 단백질의 웨스턴 블롯 두 분수에서 단백질의 작은 오염을 제안했지만, APPL 수 미토콘드리아 분획에서 세포질 대사 산물의 오염을 제한하는 미토콘드리아 대사, 추가 단계의 상세한 정량적 측정을 확인합니다IED. 샘플 및 동결 / 해동 공정 후에 얻은 이러한 대사 비교 동결 전에 대사의 측정은 특정의 미토콘드리아 대사보다 정확한 정량을 제공 할 수있다. 그러나, 우리는 미토콘드리아 게놈을 조작하는이 모델에서, 절차는 우리는 샘플 특히 유익하며, 미토콘드리아를 통해 매개되는 프로그래밍의 신규 한 대사 경로를 가리킬 수도 제조하는데 사용 하였다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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