Introduction
O objetivo deste procedimento é desenvolver frações mitocondriais enriquecidos que produzem metabólitos mitocondriais suficientes para metabolômica estudos utilizando Drosophila melanogaster. Em nossa experiência, metabolômica análise usando métodos de extração celular inteiras são incapazes de detectar mudanças sutis metabólitos mitocondriais em Drosophila. No entanto, fracionamento mitocondrial antes da análise metabolômicas aumenta a sensibilidade para identificar mudanças de metabolitos mitocondriais.
As mitocôndrias são organelas celulares responsáveis pelo fornecimento de 90% da energia que as células precisam para a função normal 1. Nos últimos anos, tem sido reconhecido que as mitocôndrias desempenhar um papel muito mais dinâmico na função celular e do organismo do que simplesmente produzir trifosfato de adenosina (ATP), e são agora reconhecidos como hubs para a regulação da homeostase metabólica 2,3. As mitocôndrias são o resultado de um processo em que endosymbiotic dislinhagens microbianas tinct fundiu ~ 1,5 bilhões de anos atrás 4. Como as mitocôndrias evoluíram para verdadeiras organelas, genes da endosymbiont foram incorporados no genoma nuclear emergente. Em animais, hoje, cerca de 1.500 proteínas mitocondriais são codificados nuclear enquanto 37 genes permanecem na mtDNA, 13 dos quais codificam proteínas mitocondriais que são subunidades dos complexos de enzimas de fosforilação oxidativa 5. A coordenação entre as mitocôndrias e compartimentos nucleares é necessária para manter a função mitocondrial adequada.
Usando os métodos descritos aqui, fomos capazes de detectar alterações metabólicas mitocondriais em Drosophila que resultam da manipulação da coordenação entre os genomas mitocondriais e nucleares. Nós usamos uma linhagem de Drosophila em que mtDNA de suas espécies irmãs D. simulans foi colocada sobre um único D. melanogaster fundo nuclear 6. Este mitonuclear 'interrompido'genótipo foi comparado com o genótipo mitonuclear "nativo", ou co-evoluiu de D. melanogaster transportando a mesma com o seu genoma nuclear nativa D. melanogaster mtDNA. O D. melanogaster e D. simulans mtDNAs diferem por ~ 100 aminoácidos e> 500 substituições sinônimas que afetam mitonuclear 7,8 comunicação. Geramos extratos mosca integrais e extratos enriquecidos mitocondriais para estudar mudanças de metabolitos em resposta ao estresse farmacológico. Aqui nós mostramos que, ao usar frações mitocondriais enriquecido detectamos mudanças acentuadas em metabólitos mitocondriais entre o genótipo nativa, co-evoluído levando a D. mtDNAs melanogaster e as genótipo rompidas transportando D. simulans mtDNA. Em contraste, as modificações do metabolito entre estes dois genótipos são subtis usando métodos normais que utilizam extracto mosca todo. Por conseguinte, este método forneceu um caminho para entender como mtDNAs mediar alterações mitocondriais emresposta a diferentes drogas.
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Protocol
1. Reagentes e Soluções
- Preparação do alimento mosca e mídia
- Mosca calor ingredientes de açúcar 11%, 2% de levedura autolisada, 5,2% de farinha de milho, agar de 0.79% w / v em água em uma placa fixada em 90 ° C. Agita-se regularmente até uma mistura ligeiramente densa homogénea. Preparar um volume final de 550 ml de alimento mosca para um total de 100 tubos de ensaio com 5 ml em cada mosca alimentos.
- Remover a partir da fonte de calor, agita-se ocasionalmente até que o alimento tiver arrefecido até 80 ° C e adicionar 0,2% tegosept-metil 4-hidroxibenzoato de metilo Dissolveu-se em etanol a 95%.
- Dividir a comida em dois volumes iguais. Adicionar 1,1 ml de 50 mM de rapamicina dissolvidos em etanol para um volume e 1,1 ml de etanol para o outro volume. Agita-se a rapamicina e as soluções de etanol para a comida. Certifique-se de que a temperatura cai para 50 ° C antes da adição de drogas.
- Tampão de isolamento
- Preparar 500 ml de tampão de isolamento [Manitol 225 mM, sacarose 75 mM, 10 mM de ácido 3- (N </ em>-morfolino) propanossulf único (MOPS) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), 2,5 mg / ml de albumina de soro bovino (BSA)] em água.
- Ajustar o pH para 7,2 utilizando hidróxido de sódio. O pH inicial irá ser ácido.
- Use garrafas de armazenamento filtro estéril com poros de 0,22 um para esterilização da solução e armazená-lo a 4 ° C.
- Tampão de Lavagem
- Preparar 500 ml de tampão de lavagem [Manitol 225 mM, sacarose 75 mM, KCl 10 mM, Tris HCl 10 mM e 5 mM de KH 2 PO 4] em água.
- Ajustar o pH para 7,2 utilizando hidróxido de sódio. O pH inicial irá ser ácido.
- Use garrafas de armazenamento filtro estéril com poros de 0,22 um para esterilização da solução e armazená-lo a 4 ° C.
2. Criação de as estirpes de Drosophila
- Para controlar a densidade larval durante o desenvolvimento, coloque 25 pares de pais em um frasco de cultura e permitir-lhes a pôr ovos durante 48 horas. <li> Remova os pais depois de 48 horas para regular a densidade dos ovos.
- Repita os passos 2.1 e 2.2 utilizando a prole F1 emergentes, de modo duas gerações deste controle de densidade é atingida.
- Para a coleta de adultos, anestesiar as moscas que utilizam o dióxido de carbono (CO 2) e separados por sexo.
- Usar um único regulador de fase pura para entrega de CO 2 a partir de um tanque de alta pressão com um fluxo contínuo de 5 psi. Para evitar a electricidade estática, utilizar um tubo de plástico para catalisar a CO 2 em um frasco de 500 ml com água de filtragem.
- Usar uma rolha de borracha com um orifício para selar o frasco. Utilize tubos de plástico para ligar a abertura lateral do balão a uma almofada de CO 2.
- Coloque as moscas na almofada para não mais de 10-15 min. Deixa-se recuperar da anestesia durante 24 h antes de colocá-los em condições experimentais.
- Para gerar metabólitos suficientes para fracções enriquecidas mitocondriais, use 300 moscas por amostra. Aqui, use as fêmeas, mas gendeR pode ser diferente em outras experiências. Transferir 150 moscas caseiras 1 L gaiola demografia. Permitir o acesso a 5 ml de alimentos num frasco de mosca.
- Transferir os restantes 150 moscas para outro 1 L gaiola. Não overpopulate gaiolas com mais de 150 moscas.
- Use seis amostras idênticas, por condição experimental. Desde extratos de animais inteiros render mais metabolitos, para gerar uma amostra de toda animais isolados, transferir 50 fêmea voa para uma gaiola. Como para os isolados mitocondriais, utilize seis amostras idênticas, por condição experimental.
- Coloque gaiolas a 25 ° C, com ciclo de 12 horas de luz e 12 horas escuro.
- Fornecer fresco a cada 2 ou 3 dias num frasco com 5 ml de alimento para manter a qualidade dos alimentos.
- Manter moscas em comida para 10 dias. Este passo é necessário para o tratamento de rapamicina 7. Outros tratamentos ou condições serão diferentes.
3. Isolamento de fracções mitocondriais
- Dump voa de uma gaiola (150 moscas) em umvidro-Teflon homogeneizador Dounce cheio com 1 ml de tampão de isolamento arrefecido.
- Homogeneizar movendo o pilão cima e para baixo por 15 tacadas. Mantenha a argamassa em gelo para manter mitocôndrias intactas.
- Transferência homogeneizado para um tubo de 1,5 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Tome-se o sobrenadante e centrifuga-se a 6000 xg durante 10 min a 4 ° C para enriquecer para mitocôndrias.
- Como o sobrenadante contém a fracção citosólica, desprezar o sobrenadante ou usá-la para experiências alternativas. Ressuspender o sedimento em 300 ul de tampão de lavagem.
- Repita os passos de 3,1-3,5 para a segunda gaiola. Combinam-se as peletes ressuspensas de duas gaiolas num tubo de microcentrífuga criogénico.
- Centrifugar a 6.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Descartar o sobrenadante e congelar o Flash-o sedimento em azoto líquido.
- Armazenar as fracções enriquecidas mitocondriais a -80 ° C ou temperatura inferior.
- Como alternativa, para animais pré inteiroparation, colocar os adultos em um tubo de microcentrífuga criogénico. Flash congelar o frasco em azoto líquido e armazenar adultos a -80 ° C ou temperatura inferior.
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Representative Results
Usando o protocolo acima referido, foi realizada a análise fracções enriquecidas em metabolômico mitocondriais e extractos de animais inteiros para testar o efeito do fármaco rapamicina em mtDNAs divergentes 7. Obtivemos 200 uM de rapamicina por dissolução da droga no alimento mosca. As moscas foram expostos a rapamicina durante 10 dias. Os metabolitos de extractos de mosca inteiras e extractos de mitocondriais foram obtidos utilizando um espectrómetro de massa de cromatografia em fase gasosa (GC / MS) e espectrometria de massa em tandem com cromatograf ia líquida (LC / MS / MS), utilizando métodos convencionais de extracção com solventes.
A Figura 1 mostra um enriquecimento da proteína porina transporte de membrana como indicador de enriquecimento mitocondrial nas fracções mitocondriais. Proteína porina era indetectável nas fracções citosólicas. Por outro lado, a proteína tubulina não foi detectada na fracção mitocondrial, suggesting pouca contaminação de proteínas citosólicas. Figura 2 e Figura 3 mostra a análise dos componentes principais (PCA) dos perfis de metabólitos completas do "nativo" D. estirpe melanogaster (orer) e da estirpe 'interrompido' de moscas que abrigam mtDNA de D. simulans e o DNA nuclear de D. melanogaster estirpe orer (SM21). Ambas as estirpes foram expostas ao fármaco rapamicina. Os dados são apresentados como um bi-componente trama de princípio eixos 1 e 2 para visualizar o efeito do tratamento e mtDNAs 7,9. Os metabolitos obtidos utilizando toda uma mosca extracto padrão são mostrados na Figura 2A. A Figura 2B mostra um gráfico semelhante para a APC metabolitos nos extractos enriquecidos mitocondriais. Para extractos de mosca inteiros (Figura 2A), o tratamento com rapamicina Peneire as amostras para valores significativamente menores de PC2. No entanto, as mudanças nos metabólitos, devido ao mtDNA genotype são sutis, pois orer e SM21 mtDNAs expostos a rapamicina ou veículo de controle estão intimamente adjacentes ou sobreposição no espaço PCA. No entanto, quando se utilizam extractos mitocondriais enriquecidos, mtDNAs mostrar efeitos rapamicina distintos sobre perfis de metabólitos mitocondriais. Em particular, a rapamicina tem um forte efeito sobre os perfis de metabolitos da estirpe orer, mostrado pelo deslocamento ao longo do eixo PC1. Mas, no genótipo mtDNA SM21 'interrompido', o perfil dos metabolitos para a condição alimentar controlo é deslocada a partir da estirpe de orer nativa (polígonos vermelho e preto, respectivamente, na Figura 2B). Como resultado, o tratamento de rapamicina tem sensivelmente menos de um efeito sobre o deslocamento das paisagens metabolito na genótipo mtDNA interrompido, SM21 (comparar polígonos vermelhas e azuis na Figura 2B).
A Figura 3 mostra APC plotes de metabolitos envolvidas na homeostase de energia (um subconjunto de todos os metabolitos, limitando a co-factores, vitaminas e intermediários do ciclo de Krebs), muitas vezes localizados dentro das mitocôndrias. Aqui, novamente, os desvios de metabolitos a partir de fracções mitocondriais enriquecidos mostram um comportamento diferente do que aqueles a partir de extractos de animais inteiros.
Estes resultados ilustram como as informações obtidas por extracto enriquecido mitocondrial e extractos de animais inteiros metabólico diferente mas complementar entre si, com o extracto enriquecido mitocondrial sendo mais sensível a mudanças metabólicas nas mitocôndrias.
Figura 1. A análise de transferência de Western que mostra a separação efectiva das mitocôndrias em fracções mitocondriais. Os anticorpos utilizados foram contra porina (uma proteína da membrana exterior mitocondrial) e tubulina (uma proteína citosólica). Proteína abundância de frações mitocondriais e citossólicos foram quantificados usando ácido bicinconínico (BCA) de ensaio. 30 ug de proteína total foram carregados em cada pista. Duas extracções independentes foram executadas.
Figura 2. Análise Princípio componente (PCA) de metabólitos obtidos com amostras de animais inteiros vs. extratos enriquecidos mitocondriais em moscas que transportam orer e SM21 haplótipos mitocondriais. (A) PCA de 210 metabólitos identificados em amostras de animais inteiros. (B) de PCA 230 metabolitos detectados nos extractos mitocondriais. Polígonos circundantes pontos destinam-se a ajudar a visualização das seis amostras replicadas para cada tratamento.k "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de componentes principais de metabólitos envolvidos na homeostase energética em moscas que transportam orer e SM21 haplótipos mitocondriais. (A) PCA de 12 metabólitos de energia a partir de extractos de mosca integrais e 13 metabolitos de energia a partir de extractos mitocondriais. (B) Polígonos pontos circundantes são destinados a auxiliar a visualização das seis amostras idênticas para cada tratamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os passos mais críticos neste protocolo são: 1) criação de moscas suficientes no espaço abundante. É muito importante para as gaiolas não overpopulate demografia com mais de 150 moscas cada; 2) mudando a comida das gaiolas com freqüência para evitar a concorrência alimentar e estresse nutricional; e 3) a manutenção de todas as amostras a 4 ° C para assegurar a integridade durante o isolamento da fracção mitocondrial. Também é recomendado para relaxar o tampão de isolamento, o tampão de lavagem, e o homogeneizador de Dounce vidro-Teflon antes da utilização. Para reduzir a contaminação cytosolic das facções mitocondriais enriquecidos, o sedimento mitocondrial do passo 3.5 pode ser lavado com tampão de lavagem.
A extracção de metabolitos a partir de fracções enriquecidas mitocondriais requer um elevado número de amostras replicadas (6 réplicas / condição experimental). No total, 24 gaiolas são utilizados para as Figuras 1 e 2. Recomendamos que você faça a extração de todos os samples no mesmo dia para diminuir a variabilidade experimental. Embora viável, este protocolo implica um planejamento cuidadoso e preparação de materiais necessários antes do tempo. Rotulagem dos tubos antes do tempo, e projetar um plano para garantir a consistência dos tempos de espera entre as amostras é necessária para preservar a qualidade da amostra e para diminuir a variação entre repetições.
Os tampões normalmente utilizados para extrair as mitocôndrias contêm açúcares 10,11; Assim, a análise de metabolitos particulares de açúcar podem ser afectadas pelo método de extracção. Apesar de não tê-los usado em nossa análise, tampões de extração KCl pode ser uma alternativa para buffers de isolamento mitocondriais que contêm açúcares 12.
Devido à natureza das redes metabólicas homeostáticas e um sistema complexo de sinais celulares mediadas que esta resposta, alterações no metabolismo mitocondrial pôde ser detectado por turnos, em conjuntos de metabolitos de células inteiras. No caso de mitochondregulação rial de tais sistemas, mudanças sutis metabolito pode ser impedida a menos metabólitos suficientes são extraídos de fracções enriquecidas mitocondriais. Em sistemas modelo onde a abundância de mitocôndrias podem ser isoladas a partir de tecido, metaboloma de alta resolução com êxito detectou alterações em fenótipos mitocondriais 13. No entanto, em Drosophila melanogaster, abrigando metabólitos de qualidade suficientes para uma boa composição de uma amostra pode apresentar um desafio. Usando este protocolo obtivemos alta quantidade, qualidade e variedade de metabólitos para demonstrar que diferentes protocolos de extração de metabólitos revelar turnos distintos para frações mitocondriais inteiros-fly vs.. Embora o Western blot de proteínas mitocondriais e citosólicas sugere pouca contaminação de proteínas nas duas fracções, para confirmar as medições quantitativas detalhadas de metabolitos mitocondriais, passos adicionais para limitar a contaminação de metabolitos citosólicas na fracção mitocondrial pode ser ApplIED. Medição de metabolitos antes de congelar a amostra e comparação destes metabolitos aos obtidos após o passo de congelação / descongelação pode fornecer uma quantificação mais precisa de metabolitos específicos mitocondriais. No entanto, neste modelo de onde se manipular o genoma mitocondrial, os procedimentos que foram utilizados para preparar amostras são particularmente informativo e podem apontar-se a novos caminhos de reprogramação metabólicas mediadas por mitocôndrias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
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