Introduction
Цель этой процедуры заключается в разработке обогащенных фракций митохондрий, которые дают достаточно митохондриальных метаболитов для метаболомики исследований с использованием дрозофилы. По нашему опыту, метаболомика анализа, используя весь методы извлечения сотовой неспособны обнаружить тонкие изменения митохондрий метаболитов в дрозофилы. Тем не менее, митохондриальная дробление до анализа Метаболомика повышает чувствительность для выявления митохондриальных метаболитов сдвиги.
Митохондрии клеточные органеллы, ответственные за обеспечение 90% энергии, что клетки необходимо для нормальной функции 1. В последние годы было признано, что митохондрии играют гораздо более активную роль в клеточном и организменном функции, чем просто производство аденозинтрифосфата (АТФ), и в настоящее время признается в качестве центров для регуляции метаболического гомеостаза 2,3. Митохондрии являются результатом процесса, в котором эндосимбиотических DISдалась отчетливая микробные клоны объединены ~ 1,5 млрд лет назад 4. Как митохондрии превратилась в истинных органелл, гены от эндосимбионта были включены в формирующемся ядерного генома. У животных сегодня, примерно в 1500 митохондриальные белки кодируются ядерным, а 37 генов остаются в мтДНК, 13 из которых кодирует митохондриальные белки, которые субъединицы ферментных комплексов окислительного фосфорилирования 5. Координация между митохондриями и ядерных отсеков необходим для поддержания надлежащего функции митохондрий.
Используя методы, описанные здесь, мы были в состоянии обнаружить митохондриальных метаболические изменения в дрозофилы, которые являются результатом манипуляции координации между митохондриальных геномов и ядерных. Мы использовали штамм дрозофилы, в котором мтДНК от своих побратимов видов Д. simulans был сделан на одном D. MELANOGASTER ядерной фон 6. Это "нарушается" mitonuclearгенотип по сравнению с "родной", или совместно эволюционировали mitonuclear генотипа D. MELANOGASTER неся же ядерный геном с его родной D. MELANOGASTER мтДНК. Д. MELANOGASTER и D. simulans мтДНК отличается от ~ 100 аминокислоты и> 500 синонимичные замены, которые влияют mitonuclear 7,8 связи. Мы создали целые лету экстракты и митохондриальных обогащенных экстрактов для изучения метаболитов сдвиги в ответ на фармакологическое стресса. Здесь мы показываем, что при использовании обогащенного митохондриальные фракции мы обнаруживаем выраженные сдвиги в митохондриальных метаболитов между родной, со развивались генотипа несущей D. MELANOGASTER мтДНК и разрушенные генотип, несущие D. simulans мтДНК. В противоположность этому, изменения метаболитов между этими двумя генотипами являются тонкими, используя обычные методы, которые используют весь экстракт лету. Таким образом, этот метод обеспечил путь понять, как мтДНК посредником митохондриальные измененияОтвет на разных препаратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Реагенты и растворы
- Подготовка летучей пищи и СМИ
- Тепловые мух ингредиенты 11% сахара, 2% автолизированных дрожжи, 5,2% кукурузной муки, агар 0,79% вес / об в воде в плите, установленной при 90 ° С. Движение регулярно, пока не будет получена однородная смесь слегка плотным. Подготовьте конечный объем 550 мл летучей пищи в общей сложности 100 флаконов по 5 мл летать еду в каждом.
- Удалить из источника тепла, помешивать, пока продукты не остынет до 80 ° С и добавляют 0,2% tegosept-метил-4-гидроксибензоата, растворенный в 95% этанола.
- Сплит пищу в двух равных объемах. Добавить 1.1 мл 50 мМ рапамицин растворяют в этаноле к одному объему и 1,1 мл этанола, с другой объем. Движение рапамицина и этанола решения в пищу. Будьте уверены, что температура снижается до 50 ° C перед добавлением лекарства.
- Выделение буфера
- Подготовьте 500 мл буфера изоляции [225 мм маннита, 75 мМ сахарозы, 10 мМ 3- (N </ EM> -morpholino) пропансульфоновой кислоты (МОПС) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 2,5 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА)] в воде.
- Доводят рН до 7,2 с помощью гидроксида натрия. Начальный рН будет кислой.
- Использование стерильные флаконы для хранения фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации раствора и хранить его при температуре 4 ° С.
- Промывочный буфер
- Подготовьте 500 мл промывочного буфера [225 мм маннита, 75 мМ сахарозы, 10 мМ KCl, 10 мМ Трис HCl и 5 мм KH 2 PO 4] в воде.
- Доводят рН до 7,2 с помощью гидроксида натрия. Начальный рН будет кислой.
- Использование стерильные флаконы для хранения фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации раствора и хранить его при температуре 4 ° С.
2. Разведение дрозофилы штаммов
- Для управления личиночной плотности в процессе разработки, разместить 25 пар родителей к бутылке культуры и позволить им, чтобы отложить яйца в течение 48 часов. <LI> Удалить родителей после 48 часов, чтобы регулировать плотность яиц.
- Повторите шаги 2.1 и 2.2, используя складывающуюся потомство F1, так что два поколения этого контроля плотности достигается.
- Для сбора взрослых, обезболить мух, используя углекислый газ (CO 2) и отдельный от пола.
- Использование единого регулятора стадии к поставленной чистого СО 2 с высокой оказывают давление на резервуар непрерывного потока 5 фунтов на квадратный дюйм. Чтобы избежать статического электричества, использовать пластиковые трубы, чтобы катализировать CO 2 в 500 мл колбу фильтрации водой.
- Использование резиновой пробкой с одним отверстием для герметизации колбы. Использование пластиковых труб для подключения боковое отверстие колбы с СО 2 подушки.
- Поместите мух в площадку не более чем на 10-15 мин. Разрешить, чтобы оправиться от наркоза в течение 24 часов, прежде чем поместить их в экспериментальных условиях.
- Для создания достаточно метаболитов митохондриальных обогащенных фракций, используйте 300 мух в образце. Вот, используйте самок, но gendeR может отличаться в других экспериментах. Перевести 150 мух самодельной 1 л демографии клетке. Разрешение доступа к 5 мл летучей пищи во флаконе.
- Перенесите оставшиеся 150 мушек в другую 1 л клетке. Не перенаселять клетки с более чем 150 мух.
- Используйте шесть одинаковых образцов за экспериментальных условиях. Так целые экстракты животного принесет больше метаболитов, чтобы произвести 1 образец целого животного изолирует, трансфер 50 женщина летит в одной клетке. Что касается митохондриальных изолятов, использовать шесть одинаковых образцов за экспериментальных условиях.
- Место клеток при 25 ° С с циклом 12 ч света и 12 ч темноты.
- Обеспечить свежие продукты каждые 2 или 3 дня в пробирке 5 мл пищи для поддержания качества продуктов питания.
- Поддерживать мух на еде в течение 10 дней. Этот шаг необходим для лечения рапамицина 7. Другие методы лечения или условия будут отличаться.
3. Выделение митохондриальных фракций
- Самосвал летит из одной клетки (150) мух встекло-тефлоновый гомогенизатор Даунса заполнены 1 мл охлажденного буфера изоляции.
- Перемешать, перемещая пестик вверх и вниз в течение 15 ударов. Держите раствор на льду, чтобы сохранить нетронутыми митохондрии.
- Передача гомогената в 1,5 мл пробирку и центрифугируют при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
- Возьмем супернатант и центрифуги при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для обогащения митохондрий.
- Как супернатант содержит цитозольную фракцию, отбросить супернатант или использовать его для альтернативных экспериментов. Ресуспендируют осадок в 300 мкл промывочного буфера.
- Повторите шаги 3.1 - 3.5 для второй клетке. Объедините ресуспендировали гранул обоих клетках в криогенной трубки микроцентрифужных.
- Центрифуга при 6000 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Жидкость над осадком сливают и флэш-заморозить гранул в жидком азоте.
- Хранить митохондриальных обогащенных фракций при -80 ° С или более низкой температуре.
- Кроме того, для всей животной предварительноторных, поместите взрослых в криогенной трубки микроцентрифужных. Вспышка заморозить флакон в жидком азоте и хранить взрослых при -80 ° С или более низкой температуре.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование протокола объяснено выше, мы провели анализ на метаболомики митохондриальных обогащенных фракций и целых экстрактов животных, чтобы проверить действие препарата рапамицина на расходящихся мтДНК 7. Мы поставили 200 мкм рапамицина путем растворения препарата в летучей пищи. Мухи подвергались рапамицина в течение 10 дней. Метаболиты из целых мух экстрактов и экстрактов из митохондрий, получены при использовании масс-спектрометрии газовой хроматографии (ГХ / МС) и жидкостную хроматографию-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ / МС / МС) с использованием стандартных методов экстракции растворителем.
На рисунке 1 показан обогащение белка порина мембранного транспорта; в качестве индикатора митохондриальной обогащения в митохондриальных фракций. Porin белок не был обнаружен в цитозольного фракции. С другой стороны, белок тубулин не был обнаружен в митохондриальной фракции, Суggesting немного загрязнения цитозольными белков. Рисунок 2 и 3 показывают анализ компонентов принцип (PCA) из полных профилей метаболитов из «родной» D. MELANOGASTER штамм (Орер) и "нарушается" штамм мух, несущих мтДНК D. simulans и ядерной ДНК из D. MELANOGASTER штамм Орер (SM21). Оба штамма подвергали воздействию рапамицина наркотиков. Данные представлены в виде би-участок основного компонента осей 1 и 2, чтобы визуализировать эффект лечения и мтДНК 7,9. Метаболиты, полученные с использованием стандартного весь экстракт летучей показаны на фиг.2А. 2В показан аналогичный PCA участок для метаболитов в митохондриальной обогащенных экстрактов. Для целых лету экстрактов (Рис 2А), лечение рапамицин просеивает образцы к значительно более низкие значения PC2. Тем не менее, изменения в метаболитов вследствие мтДНК генotype тонкие, так и Орер SM21 мтДНК воздействию рапамицина или управления автомобиля тесно примыкает или перекрытия в PCA пространстве. Тем не менее, при использовании обогащенного митохондриальных экстрактов, мтДНК отчетливые рапамицина воздействие на митохондриальных профилей метаболитов. В частности, рапамицин имеет сильное влияние на метаболита профилей штамма Орер, показанных перемещения вдоль оси PC1. Но, на "нарушается" SM21 мтДНК генотипа, профиль метаболита за состояние контрольно-пищевой смещается от родного деформации Орер (красные и черные полигонов, соответственно, на рис 2B). В результате лечение рапамицина значительно меньшее влияние на сдвиг метаболита ландшафтов в нарушенного мтДНК генотипа, SM21 (сравните красный и синий многоугольники на фиг.2В).
Рисунок 3 показывает, PCA рмножество метаболитов, участвующих в гомеостазе (энергии подмножества всех метаболитов, ограничивается кофакторы, витамины и промежуточных цикла Кребса), часто расположенных внутри митохондрий. Здесь снова, метаболит смещается от обогащенных фракций митохондрий показать другое поведение, чем те, из цельного экстрактов животных.
Эти результаты показывают, как метаболический информация, полученная митохондриальной обогащенного экстракта и целых экстрактов животных отличаются, но дополняют друг друга, с митохондриальной обогащенный экстракт будучи более чувствительны к изменениям в обменных митохондрий.
Рисунок 1. Вестерн-блоттинга, показывающий эффективное разделение митохондрий в митохондриальных фракций. Антитела были использованы против порина (митохондриальная наружной мембраны белок) и тубулина (цитозольным белок). Белок Обилие митохондриальных и цитозольных фракций количественно, используя бицинхониновой кислоты (BCA) анализа. 30 мкг общего белка были загружены на каждой дорожке. Было проведено два независимых экстракций.
Рисунок 2. Принцип компонентного анализа (РСА) метаболитов, полученных с использованием образцов цельной животных vs. митохондриальных обогащенных экстрактов на мух, несущих Орер и SM21 митохондриальных гаплотипов. (А) СПС 210 метаболитов, выявленных в образцах цельной животных. (B), СПС 230 метаболитов, обнаруженных на митохондриальных экстрактов. Полигоны окружающие точки предназначены для оказания помощи визуализации шести повторных выборок для каждого лечения.К "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Анализ основных компонент метаболитов, участвующих в гомеостазе энергии на мух, несущих Орер и SM21 митохондриальных гаплотипов. (А) СПС 12 энергетических метаболитов из цельного лету экстрактов и 13 энергетических метаболитов из митохондриальных экстрактов. (B) Полигоны окружающие точки предназначены для оказания помощи визуализации шести повторных выборок для каждого лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги в этом протоколе, являются: 1) воспитание достаточно мух в изобилии пространства. Это очень важно, чтобы не перенаселять демография клетки с более чем 150 мух каждый; 2) изменение пищу клеток часто, чтобы избежать пищевой конкуренции и питания стресс; и 3) поддержание всех образцов при 4 ° С, чтобы обеспечить целостность в процессе выделения митохондриальной фракции. Рекомендуется также, чтобы охладить буфер изоляции, промывочный буфер, и стекло-тефлоновый гомогенизатор Даунса перед использованием. Чтобы уменьшить загрязнение цитозольного обогащенных фракций митохондрий, митохондрий гранул со стадии 3.5 можно промывали промывочным буфером.
Экстракция метаболитов из обогащенных фракций митохондрий требуется большое количество повторных проб (6 дубликатов / экспериментальное условие). В общей сложности 24 клетки используются для фигурах 1 и 2. Мы рекомендуем выполнять извлечение всех сamples в тот же день, чтобы уменьшить экспериментальную изменчивость. Хотя возможно, этот протокол предусматривает тщательное планирование и подготовка материалов, необходимых заранее. Маркировка труб впереди времени, и разработка плана по обеспечило согласованность времени ожидания между образцами необходимо сохранить образец качества и снизить вариацию между повторами.
Буферы, обычно используемые для извлечения митохондрии содержат сахара 10,11; Следовательно, анализ конкретных метаболитов сахара может зависеть от способа экстракции. Хотя мы не использовали их в нашем анализе, добыча буферы KCl может быть альтернативой митохондриальных буферов изоляции, которые содержат сахара 12.
Из-за гомеостатического характера метаболических сетей и комплексной системы сотовой сигналов, опосредованных этот ответ, изменения в метаболизма митохондрий могут быть обнаружены сдвиги в целых бассейнах клеток метаболитов. В случае mitochondриала регулирование таких систем, тонкие сдвиги метаболит может быть затруднено, если достаточно метаболиты не будут извлечены из митохондриальных обогащенных фракций. В модельных системах, где множество митохондрий может быть выделен из ткани, высокие метаболомика разрешения успешно обнаружен изменения в митохондриальных фенотипов 13. Тем не менее, в дрозофилы, укрывательство достаточно качественные метаболитов для хорошего состава образца может представлять проблему. Используя этот протокол, мы получили высокие качества, количества и разнообразие метаболитов чтобы продемонстрировать, что различные протоколы извлечения выявить различные метаболитов сдвиги для целых лету против митохондриальных фракций. Несмотря на то, Вестерн-блот митохондриальных белков и цитозольных предполагает небольшое загрязнение белков в двух фракций, чтобы подтвердить подробные количественные измерения митохондриальных метаболитов дополнительные шаги, чтобы ограничить загрязнение цитозольных метаболитов в митохондриальной фракции может быть ApplСВУ. Измерение метаболитов перед замораживанием образца и сравнение этих метаболитов, приведенными после замораживания / оттаивания стадии может обеспечить более точное количественное определение специфических метаболитов митохондриальных. Тем не менее, в этой модели, где мы манипулировать митохондриального генома, процедуры мы использовали для приготовления образцов особенно информативными и могут указывать на новых путей метаболизма перепрограммирования опосредованных митохондрий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
