Introduction
Bu prosedürün amacı, Drosophila melanogaster'in kullanılmasının metabolomiks çalışmalar için yeterli mitokondriyal metabolitleri elde zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlar geliştirmektir. Bizim tecrübelerimize göre, tüm hücresel çıkarma yöntemlerini kullanarak metabolomik analiz Drosophila ince mitokondriyal metabolit değişikliklerini tespit edemiyoruz. Ancak önceki metabolomik analiz mitokondriyal fraksiyon mitokondriyal metabolit vardiya tanımlamak için hassasiyetini artırır.
Mitokondri hücreleri normal fonksiyon 1 için gereken enerjinin% 90 sağlanmasından sorumlu hücresel organellerdir. Son yıllarda bu mitokondrinin sadece adenozin trifosfat (ATP) üretmek daha hücresel ve organizma işlevi çok daha dinamik bir rol oynayabilir ve şimdi metabolik homeostazı 2,3 düzenlenmesi için hub olarak tanınan kabul edilmiştir. Mitokondri dis olan bir endosimbiyotik işleminin sonucudurTinct mikrobik soy 1,5 milyar yıl önce 4 ~ birleşti. Mitokondri gerçek organellere haline gibi, endosymbiont gelen genler ortaya çıkan nükleer genomu dahil edildi. 37 gen oksidatif fosforilasyon 5 enzim komplekslerinin alt birimleri olan mitokondriyal proteinleri kodlayan 13 olan mtDNA, kalırken hayvanlarda bugün yaklaşık 1.500 mitokondriyal proteinlerin, nükleer kodlanmış bulunmaktadır. Mitokondri ve nükleer bölmeleri arasında koordinasyon düzgün mitokondriyal fonksiyonunu korumak için gereklidir.
Burada açıklanan yöntemleri kullanarak mitokondriyal ve nükleer genomlarındaki arasındaki koordinasyon manipülasyon sonucu Drosophila mitokondriyal metabolik değişiklikleri tespit etmek mümkün. Biz hangi mtDNA D. kardeş türünden Drosophila bir yük kullanılan simulans tek D. yerleştirildi Nükleer arka plan 6 melanogaster. Bu "kesintiye 'mitonuclearGenotip D. 'doğal', ya da ko-evrimleşmiş mitonuclear genotip ile karşılaştırılmıştır kendi doğal D. ile aynı nükleer genomu taşıyan melanogaster mtDNA melanogaster. D. melanogaster ve D simulans mtDNAs 100 ~ tarafından amino asitler ve mitonuclear iletişim 7,8 etkileyen> 500 eşanlamlı değiştirmelerin farklıdır. Biz farmakolojik strese yanıt olarak metabolit vardiya çalışmak için tüm sinek özleri ve mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri üretti. Burada mitokondrial zenginleştirilmiş kesirler kullanırken biz D. taşıyan yerli, eş-evrim genotip arasındaki mitokondriyal metabolitleri belirgin değişimler tespit olduğunu göstermektedir melanogaster mtDNAs ve D. taşıyan kesintiye genotip simulans mtDNA. Buna karşılık, bu iki genotipleri arasındaki metabolit değişiklikleri tüm sinek özü kullanan, normal yöntemlerle ince olur. Bu nedenle, bu yöntem mtDNAs mitokondriyal değişiklikler arabuluculuk nasıl anlamak için bir yol sağladıFarklı ilaçlara yanıt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktifler ve Çözümleri
- Sinek gıda ve medya hazırlanması
- Isı uçucu bileşenler 90 ° C 'ye ayarlanmış bir ocak su içinde ağırlık / hacim olarak% 0.79 agar% 11 şeker,% 2 otolize uğramış mayası,% 5.2 mısır unu. Homojen biraz yoğun karışım elde edilinceye kadar düzenli olarak karıştırın. Her bir yiyecek kalkan 5 ml ile 100 şişelerde bir toplam uçucu gıda 550 ml'lik bir nihai hacim hazırlayın.
- Isıtma cihazından çıkar Gıda aşağı 80 ° C'ye gelene kadar zaman karışması ve% 95 etanol,% 0.2 tegosept-metil 4-hidroksibenzoat ekleyin.
- Iki eşit hacimlerde gıda bölün. Diğer hacim etanol, 50 mM bir hacme kadar etanol rapamisinin 1,1 ml 1,1 ml ilave edilir. Rapamisini ve gıda içine etanol çözümleri karıştırın. Sıcaklık ilaçlar eklemeden önce 50 ° C'ye düşer emin olun.
- İzolasyon Tampon
- İzolasyon Tamponu [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM 3- (N <500 ml hazırlayın/ em> morfolino) propansülfonik asit (MOPS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), 2.5 mg / ml sığır serumu albümini (BSA)] su içinde.
- Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç pH'ı asidik olacaktır.
- Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.
- Yıkama Tamponu
- Yıkama tampon maddesi [225 mM Mannitol, 75 mM sakaroz, 10 mM KCI, 10 mM Tris HCI ve 5 mM KH 2 PO 4] su içinde 500 ml hazırlayın.
- Sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Başlangıç pH'ı asidik olacaktır.
- Solüsyonu sterilize etmek ve 4 ° C de saklamak için 0.22 um gözenek boyutuna sahip olan steril filtre depolama şişeler kullanın.
Drosophila SUŞLARINDA 2. Yetiştirme
- , Gelişim sırasında larva yoğunluğu kontrol bir kültür şişe ebeveynlerin 25 çift yerleştirmek ve onları 48 saat boyunca yumurtalarını bırakmak için izin vermek için. <li> Yumurta yoğunluğunu düzenlemek için 48 saat sonra anne çıkarın.
- Yineleyin ortaya çıkan F1 yavru kullanarak 2.1 ve 2.2 adımları, bu nedenle bu yoğunluk kontrolü iki kuşak elde edilir.
- Yetişkin toplamak için, karbondioksit (CO2) ve cinsiyete göre ayrı kullanarak sinekler uyutmak.
- 5 psi sürekli bir akış bir yüksek basınçlı tanktan teslim saf CO 2 tek aşamalı regülatör kullanın. Statik elektriği önlemek için, su ile balonun filtreleme 500 ml CO 2 katalize etmek için plastik boru kullanılır.
- Şişeyi kapatmak için tek delikle bir lastik tıpa kullanın. CO2 pede şişenin yanal açıklığı bağlamak için plastik boru kullanın.
- 10-15 dk daha fazlası için ped sinek yerleştirin. Deneysel koşullar koymadan önce 24 saat anestezi kurtarmak için izin verin.
- Mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler için yeterli metabolitleri oluşturmak numune başına 300 sinekler kullanın. Burada, kadın kullanın, ancak gender, diğer deneylerde farklı olabilir. Bir ev yapımı 1 L demografi kafesine 150 sinekler aktarın. Bir şişe içinde uçucu gıda 5 ml erişimine izin verir.
- Başka bir 1 L kafesine geri kalan 150 sinekler aktarın. 150'den fazla sinekler kafeslere overpopulate etmeyin.
- Deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın. Bütün hayvan ekstreleri fazla metabolitleri verim yana, bütün hayvan 1 örnek izolatlarının oluşturmak 50 kadın, bir kafes uçar aktarmak için. Mitokondriyal izolatların gelince, deneysel koşul başına altı çoğaltma örnekleri kullanın.
- 12 saat ışık ve 12 saat karanlık çevrimi ile 25 ° C 'de yer kafesleri.
- Gıda kalitesini korumak için gıda 5 ml bir şişe içinde her 2 ya da 3 gün taze yiyecek sağlamak.
- 10 gün boyunca gıda sinekler koruyun. Bu adım, rapamisin tedavisi 7 için gereklidir. Diğer tedaviler veya şartlar farklı olacaktır.
Mitokondriyal Kesirler 3. İzolasyonu
- Damperli bir içine bir kafes (150 sinekler) çıkışlı uçarCam-Teflon Dounce homojenleştirici soğutulmuş yalıtım 1 ml tampon ile doldurulmuştur.
- Aşağı 15 vuruş için havaneli yukarı ve hareket ettirerek homojenleştirin. Sağlam mitokondri tutmak için buz üzerinde harç tutmak.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de, 1.5 ml tüp ve santrifüj transfer homojenat.
- Mitokondri için zenginleştirmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüj süpernatan ve al.
- Süpernatant sitozolik fraksiyonu içerdiğinden, süpernatant atın veya alternatif deneyler için kullanabilirsiniz. Yıkama tamponu 300 ul pelletini.
- İkinci kafes için 3,5 - 3,1 tekrarlayın adımları. Bir kriyojenik mikrosantrifüj tüpü içinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş, her iki kafesleri pelet birleştirin.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 6000 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı atın ve sıvı azot içinde pelet flash dondurma.
- -80 ° C veya daha düşük bir sıcaklıkta mitokondriyal zenginleştirilmiş kısımlar saklayın.
- Alternatif olarak, bütün hayvan öncesi içinTerkip, bir kriyojenik mikrosantrifüj tüp içinde yetişkin yerleştirin. C veya daha düşük sıcaklıkta -80 ° sıvı azot ve mağaza erişkinlerde şişeyi Flash dondurma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol Yukarıda açıklandığı kullanarak, farklı mtDNAs 7 rapamisin ilacın etkisini test etmek için, mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları ve bütün hayvansal özler üzerine metabolomic analizi yapıldı. Biz sinek gıda ilaç çözerek rapamisinin 200 mcM teslim etti. Sinekler için 10 gün rapamisin maruz bırakılmıştır. Bütün uçucu ekstrelerinden ve mitokondriyal ekstrelerinden metabolitleri standart çözücü çıkarma yöntemleri kullanarak gaz kromatografisiyle kütle spektrometrisi (GC / MS) ve sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LC / MS / MS) kullanılarak elde edilmiştir.
Şekil 1 mitokondriyal kesirler mitokondriyal zenginleşme göstergesi olarak membran transport proteini porini bir zenginleşme göstermektedir. Porin proteini sitosolik fraksiyonlar de tespit edilememiştir. Tersine, Tübülin protein mitokondrial fraksiyonu, su saptanmadısitozolik proteinlerin küçük kirlenmesini ggesting. 'doğal' D. komple metabolit profilleri 2 ve Şekil 3 gösteri temel bileşenler analizi (PCA) Şekil melanogaster suşu (Örer) ve D. mtDNA barındıran sinekler 'bozulur' suşu simulans ve D nükleer DNA melanogaster zorlanma Örer (sm21). Her iki suş da ilaç rapamisin maruz bırakılmıştır. Prensip bileşenin iki arsa 1 ve 2 tedavi ve mtDNAs 7,9 etkisini görselleştirmek için eksenleri gibi veri sunulmuştur. Standart tam uçucu ekstraktı kullanılarak elde edilen Metabolitler Şekil 2A'da gösterilmiştir. Şekil 2B, mitokondriyal zenginleştirilmiş özütlerinde metabolitler için de benzer bir PCA grafiğini göstermektedir. Bütün sinek ekstreleri (Şekil 2A) için, rapamisin tedavi örnekleri PC2 belirgin düşük değerler için sifts. Yine de, mtDNA gen nedeniyle metabolitleri değişikliklerrapamycin veya kontrol araca maruz Örer ve sm21 mtDNAs PCA uzayda yakından bitişik veya üst üste olduğundan, ince karyotip vardır. Zenginleştirilmiş mitokondriyal özler kullanılarak Ancak, mtDNAs mitokondriyal metabolit profillerinde belirgin rapamisin etkilerini göstermektedir. Özellikle, rapamisin PC1 ekseni boyunca yer değiştirme ile gösterilen örer soyunun metabolit profilleri üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir. Ancak, 'kesintiye' sm21 mtDNA genotipine kontrol gıda durum için metabolit profili (Şekil 2B sırasıyla kırmızı ve siyah çokgenler) yerel örer mutajeneziyle yer değiştirir. Bunun bir sonucu olarak, rapamisin tedavisi kesintiye mtDNA genotip, sm21 metabolit manzara kayması (Şekil 2B, kırmızı ve mavi çokgenler karşılaştırın) üzerindeki bir etkinin fark daha az bulunur.
Şekil 3 PCA p gösterirEnerji homeostazının katılan metabolitlerin çok sık mitokondri içinde bulunan, (bütün metabolitlerin bir alt, kofaktörler, vitaminler ve Krebs döngüsü ara sınırlıdır). Burada da yine, zenginleştirilmiş mitokondriyal fraksiyonlardan metabolit kaymalar bütün hayvan ekstrelerinden daha farklı bir davranış göstermektedir.
Bu sonuçlar farklılık ancak mitokondriyal zenginleştirilmiş ekstre mitokondri metabolik değişimlere daha duyarlı olmak, birbirini tamamlayan nasıl metabolik mitokondriyal zenginleştirilmiş özü ve bütün hayvansal özler tarafından elde edilen bilgiler göstermektedir.
Şekil 1. Western Blot mitokondriyal fraksiyonlardaki mitokondri etkin ayrılmasını gösteren analizi. Kullanılan antikorlar porini karşı olan (mitokondriyal dış membran proteini) ve tubulin (sitozolik protein). Protein mitokondrial ve sitosolik fraksiyonlar bolluğu bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanılarak ölçüldü. Toplam proteinin 30 ug her bir şeride yüklendi. İki bağımsız ekstraksiyon yapılmıştır.
Bütün hayvan örnekleri vs Örer taşıyan sinekler üzerinde mitokondriyal zenginleştirilmiş özleri ve mitokondriyal haplotipleri sm21 kullanılarak elde edilen metabolitlerin Şekil 2. Temel bileşenler analizi (PCA). Bütün hayvan örneklerinde belirlenen 210 metabolitlerin (A) PCA. Mitokondriyal özler tespit 230 metabolitlerin (B) PCA. Noktaları çevresinde Çokgenler her bir muamele için, altı kopya numuneler görselleştirme yardım etmek için tasarlanmıştır.k "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Örer taşıyan sinekler ve sm21 mitokondrial haplotypes enerji homeostazda katılan metabolitlerin Şekil 3. Temel bileşenler analizi. Bütün sinek ekstreleri 12 enerji metabolitleri ve mitokondriyal ekstrelerinden 13 enerji metabolitleri (A) PCA. Noktaları çevreleyen (B) Çokgenler her tedavi için altı çoğaltma örneklerin görselleştirme yardımcı olmak için tasarlanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokolde en kritik adımlar şunlardır: 1) bol uzayda yeterli sinekler yetiştirme. 150'den fazla sinekler her biri demografi kafesleri overpopulate değil çok önemlidir; 2) sık sık gıda rekabeti ve beslenme stresi önlemek için kafes gıda değişen; ve 3), 4 ° C 'de, tüm numuneler muhafaza mitokondriyal fraksiyonunun izolasyonu sırasında bütünlüğünü sağlamak için. Ayrıca yalıtım tamponu, yıkama tamponu ve kullanımdan önce kullanılan cam teflon homojenleştirici soğuk Dounce tavsiye edilir. Zenginleştirilmiş mitokondriyal gruplar sitosolik azaltılması için, aşama 3,5 mitokondriyal Tane madde yıkama tampon maddesi ile yıkanmış olabilir.
Zenginleştirilmiş mitokondriyal kesirler metabolitleri çıkarma çoğaltmak örneklerinde (6 çoğaltır / deneysel durumu) yüksek sayıda gerektirir. Toplam olarak, 24 kafes Şekiller 1 ve 2 için kullanılmıştır. Hepimiz s çıkarma yapılmasını öneriyoruzDeneysel değişkenliği azaltmak için aynı gün amples. Mümkün olsa da, bu protokol dikkatli planlama ve vaktinden gerekli malzemelerin hazırlanmasını gerektirir. Vaktinden tüplerin Etiketleme ve örnekler arasındaki bekleme süreleri kıvamına sağlamış bir plan tasarımı örnek kalitesini korumak ve çoğaltır arasındaki varyasyonu azaltmak için gereklidir.
Normalde mitokondri ayıklamak için kullanılan tamponlar şeker 10,11 içerirler; bu nedenle, özellikle de şeker metabolitlerin analizi ekstraksiyon yöntemiyle etkilenebilir. Bizim analizde onları kullanmış olmasına rağmen, KCl çıkarma tamponlar şeker 12 ihtiva mitokondriyal izolasyon tamponları bir alternatif olabilir.
Nedeniyle metabolik ağların homeostatik doğası ve bu yanıtı aracılık hücresel sinyallerin karmaşık bir sistem, mitokondriyal metabolizmada değişiklikler tüm hücre metabolit havuzlarında vardiya ile tespit edilebilir. Mitochond halindeYeterince metabolitler mitokondriyal zenginleştirilmiş kesirler elde sürece bu tür sistemlerin riyali düzenlenmesi, ince metabolit kaymalar engellenmiş olabilir. Mitokondri bol dokusundan izole edilebilir modeli sistemlerinde, yüksek çözünürlüklü metabolomiks mitokondriyal fenotipleri 13 değişiklikleri tespit başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, Drosophila melanogaster, bir numunenin iyi bir bileşim için yeterince kaliteli metabolitlerinin barındıran bir sorun olarak ortaya çıkmaktadır. Yüksek miktar, kalite ve metabolitleri çeşitli elde bu protokolü kullanarak farklı ekstraksiyon protokolleri tam sinek vs mitokondriyal kesirler için farklı metabolit vardiya ortaya göstermek için. Mitokondrial ve sitosolik proteinler Western blot, iki fraksiyonda proteinin küçük bir kontaminasyonu gösteriyorsa da, başvuru no olabilir mitokondrial fraksiyonu sitozolik metabolitlerin kirlenme mitokondriyal metabolitler, ek adımlar ayrıntılı niceliksel ölçümlerini teyit etmek içinied. Örnek ve donma / çözülme aşamasından sonra elde edilen bu metabolitlerin karşılaştırmasını dondurmadan önce metabolitlerinin ölçümü mitokondriyal Belirli metabolitlerin daha doğru bir ölçümünü temin edebilir. Ancak, biz mitokondriyal genomu manipüle bu modelde, prosedürleri biz örnekleri özellikle bilgilendirici ve mitokondri aracılık metabolik yeniden programlama yeni yollara işaret edebilir hazırlamak için kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2% tegosept-methyl 4-hydroxybenzoate | VWR | AAA14289 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792799 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 38057 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 5470 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T-B7 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1551139 | |
| CO2 pads to anesthetize flies | Tritech Research | MINJ-DROS-FP | |
| 1 L cage | Web Restaurant Store | 999RD32 | |
| 1 L cage lid | Web Restaurant Store | 999LRD | |
| a glass-teflon dounce homogenizer | Fisher Scientific | NC9661231 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| rapamycin | LC Laboratories | R-5000 | |
| anti-porin | MitoSciences | MSA03 | |
| anti-alpha tubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | 12G10 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| CO2 pad | Tritech Research, Inc | MINJ-DROS-FP | |
| filter flask | enasco | SB08184M | |
| rubber stopper | enasco | S08512M |
References
- Scheffler, I. E. Mitochondria (Scheffler, Mitochondria). , Wiley-Liss. 484 (2007).
- Guarente, L. Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins. Cell. 132 (2), 171-176 (2008).
- Raimundo, N. Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory. Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).
- Embley, T. M., Martin, W. Eukaryotic evolution, changes and challenges. Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).
- Lane, N., , Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life. 368, Oxford University Press. USA. (2006).
- Montooth, K. L., Meiklejohn, C. D., Abt, D. N., Rand, D. M. Mitochondrial-nuclear epistasis affects fitness within species but does not contribute to fixed incompatibilities between species of Drosophila. Evolution; international journal of organic evolution. 64 (12), 3364-3379 (2010).
- Villa-Cuesta, E., Holmbeck, M. A., Rand, D. M. Rapamycin increases mitochondrial efficiency by mtDNA-dependent reprogramming of mitochondrial metabolism in Drosophila. Journal of cell science. 127 (Pt 10), 2282-2290 (2014).
- Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity. PLoS genetics. 10 (5), e1004354 (2014).
- Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells. SpringerPlus. 3, 254 (2014).
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material. Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology. Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).
- Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics. PloS one. 7 (3), e33020 (2012).
