Summary
Manuskriptet här ger en enkel uppsättning av metoder för att analysera sekretion och spridning av fluorescerande taggade ligander i Xenopus. Detta ger ett sammanhang för att testa förmågan hos andra proteiner för att modifiera ligand distribution och tillåta experiment som kan ge insikt i mekanismer som reglerar morfogen gradienter.
Abstract
Detta protokoll beskriver en metod för att visualisera ligander fördelade över ett fält av celler. Den lätthet att uttrycka exogena proteiner, tillsammans med den stora storleken hos deras celler i tidiga embryon, gör Xenopus laevis en användbar modell för att visualisera GFP-märkta ligander. Syntetiska mRNA effektivt översätts efter injektion i tidig skede Xenopus embryon, och injektioner kan riktas till en enda cell. I kombination med en härstamning spårämne såsom membran bundna RFP, kan den injicerade cellen (och dess ättlingar) som producerar det överuttryckta proteinet lätt följas. Detta protokoll beskriver ett förfarande för framställning av fluorescerande taggade Wnt och Shh-ligander från injicerade mRNA. Metoderna involverar micro dissektion av ektodermal explants (skalltak) och analys av ligand diffusion i flera prover. Genom att använda konfokal avbildning, kan information om ligand sekretion och diffusion över ett fält av celler erhållas. Statistiska analyser av konfokala bilder ger kvantitativa data om formen av ligand gradienter. Dessa metoder kan vara till nytta för forskare som vill testa effekterna av faktorer som kan reglera formen av morfogen gradienter.
Introduction
Under tidig fosterutveckling, celler successivt åtagit sig att följa vissa linjer av differentiering: det innebär en grupp av totipotenta (eller pluripotenta) celler blir successivt begränsat till upprättandet populationer av stamceller fast beslutna att ge upphov till en celltyp. Cell-cellsignalering är av central betydelse för regleringen av härstamning specifikation under fosterutvecklingen. Manipulering av dessa signaler kommer att krävas för att rikta stamceller mot särskilda öden för att stödja nya medicinska behandlingar.
Ett relativt litet antal signalvägar som upprepade under utveckling, bland annat vägar svarar mot TGF familjen (nodals och BMP) 1-2, FGF 3, Wnts 4, och Igelkottar 5. Dessa utsöndrade proteiner binder receptorer närvarande på cellmembranet för att aktivera signaltransduktion därigenom ändra genexpression och / eller cellbeteende. Den snäva reglering av cell teckenAlling är väsentlig för cellhärstamning specifikation och normal utveckling. Medan överhörning mellan dessa vägar är viktiga för att bestämma cell öde, kan en enda ligand sig framkalla distinkta svar på olika koncentrationer. Morfogen gradienter beskrevs mer än 100 år sedan som en teori för att förklara hur olika celltyper kan härröra från ett fält av celler 6. Signalerings molekyler som produceras av en grupp av celler kan diffundera över ett visst intervall, minskar i koncentration med ett större avstånd från källan. Celler som utsätts för signalen kommer att svara på den lokala koncentrationen på sin position inom celler, med celler vid distinkta lägen svarar olika på olika nivåer av signalen. Bevis för existensen av morfogener kommer från studier av det tidiga Drosophila embryo 7 och vingen skivan 8, samt ryggradsdjuret lemmen 9 och neuralröret 10.
Metoder behövs för att itesta själva hur morfogen gradienter är etablerade och att identifiera andra molekyler som är viktiga för att reglera dessa gradienter. Eleganta experiment med användning av immunohistokemi att visualisera endogena proteiner in vivo i samband med olika genetisk bakgrund har använts för att undersöka morfogen gradienter 11-12. Men bra antikroppar och specifika mutanter är inte alltid tillgängliga, så vi beskriver här ett protokoll med användning av överexpression av fluorescerande ligander i Xenopus, att tillhandahålla ett alternativt, enkelt förfarande för att dissekera hur exogena genprodukter kan påverka fördelningen av ligander över ett fält av celler. Xenopus laevis ger ett utmärkt system för att utföra dessa typer av experiment som deras embryon utvecklas externt så att de finns tillgängliga på de tidigaste stadierna. Deras stora storlek (1-1.5mm i diameter) förenklar mikroinjektion och kirurgisk manipulation och genom blastula stegen cellerna är lätta att bilden som de fortfarande är förhållandevis stora (ca 2081; M över). Överuttryck studier i Xenopus är enkla att göra: mRNA injiceras i det tidiga embryot kan riktas till särskilda celler och effektivt översätts.
De fluorescerande taggade Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP konstruktioner genererades med hjälp av pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 och EGFP. HA-peptiden är viktigt att inkludera, inte bara för att ge en ytterligare molekylär tag, men också eftersom det är tänkt att fungera som en distans separera Wnt och EGFP proteiner som gör det möjligt både genprodukter att fungera. Konstruktet används för visualisering av Shh användes tidigare för att generera en transgen mus som uttrycker en Shh-EGFP-fusionsprotein 15; detta tillhandahölls vänligen av Andy McMahon. Viktigt är GFP tagg för alla konstruktionerna klonade 3 'till signalsekvensen så att den hålls kvar efter bearbetning. Det är också viktigt att se till att den slutliga protein innehåller sekvenser som krävs för ändringar, till exempel den Addition av lipider som är fallet för Shh och Wnt ligands.The cDNA subklonades in i pCS2 + expressionsvektor som är optimerad för produktionsdjur av syntetisk mRNA; det innehåller en SP6-promotorn och polyadenyleringssignalen (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Det arbete som beskrivs här ger ett enkelt protokoll för att jämföra sekretion och spridning av fluorescerande taggade Wnt och Shh taggade ligander. Genom att injicera definierade mängder av syntetisk mRNA, circumnavigates protokoll eventuella problem i samband med variabel expression från olika vektorer med användning av olika promotorer. Dessa metoder har nyligen använts för att undersöka effekterna av heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-EGFP och Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP sekretion och diffusion i Xenopus 16-17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Djurförsök utfördes enligt en brittisk Hemmakontor licens att ledamot av Europaparlamentet och de experiment som utförts godkändes av University of York etisk kommitté i enlighet med anländer (Animal Research: Rapportering av experiment in vivo) riktlinjer. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).
1. Strategi för att generera fluorescerande taggade ligander
Nedan är ett exempel protokoll för subkloning Wnt8a-HA och EGFP i pCS2, i syfte att producera i ram fusion konstruera Wnta-HA-EGFP:
- Ställ upp och köra PCR-reaktioner för Wnt8a-HA och EGFP. Använd primer information som visas i tabell 1 och exempel PCR-reaktionen och exempel PCR-betingelser som visas i tabell 2. Notera: Mall-DNA kommer att variera beroende på konstruktionen som produceras, i detta exempel, är Wnt8a-HA användes som mall-DNA.
- Städa upp PCR-reaktioner med hjälp av en gelextraktionskit utför slutlig eluering i 30μl av molekylärbiologisk kvalitet vatten.
- Kontrollera 2 pl av PCR-produkten på en 1% agarosgel framställd i TAE.
- Digest Wnt8a-HA och EGFP PCR-produkter och pCS2 användning av lämpliga restriktionsenzymer (se tabell 1), som inrättades reaktioner som beskrivs i tabell 2 (exempel PCR-produkten sammandrag).
- Inkubera reaktioner för 3 h vid 37 ° C och sedan lagra Wnt8a-HA och GFP PCR-produkter på is.
- Lägg 1 pl kalv alkaliskt intestinalt fosfatas (CAIP) till pCS2 digere och inkubera i 6 min vid 37 ° C.
- Värme inaktivera CAIP genom inkubation under 15 min vid 65 ° C.
- Kör pCS2 och PCR smälter på ett 1% ultrarent agaros gel framställd i TAE.
- Gel extrakt och städa upp pCS2 och PCR-produkter med hjälp av en gelextraktionskit utför slutlig eluering i 30 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten.
- Konfigurera ligering såsom beskrivs i tabell 2 (exempel T4-ligering) och inkubera vid 12 ° C under 16 timmar.
2. mRNA-syntes: Generera Template
- Producera mallar med restriktionsenzymdigerering av följande plasmider (alla i expressionsvektom pCS2): membran Cerulean (memCerulean), membran-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP.
- Ställ in restriktionsuppslutningar som beskrivs i tabell 2 (exempel mall smälta).
- Blanda försiktigt och inkubera reaktionerna för 2 timmar vid 37 ° C.
- Kör 2,5 pl av klippta plasmid på en 1% agarosgel (TAE) för att kontrollera att reaktionen har skurit till fullbordan.
- Städa upp digere med hjälp av en gelextraktionskit utför slutlig eluering i 50 fil av molekylärbiologisk kvalitet vatten.
3. mRNA-syntes: In Vitro Transkription
- Syntetisera funktionella mRNA med användning av SP6-mRNA-transkription kit. Montera reaktionerna i 1,5 ml DNAse / RNas-fritt mikrocentrifugrör.
- Ställ in mRNA-transkriptionsreaktioner som beskrivs i tabell 2 (exempel mRNA-syntes).
- Blandareaktioner försiktigt med en pipett och sedan inkubera vid 37 ° C under 4 timmar.
- Kontrollera 1 ul av reaktions på en 2% agarosgel (TAE).
- Tillsätt 1 pl av DNAs till reaktionen, blanda försiktigt med en P20 och inkubera reaktionen under ytterligare 15 min vid 37 ° C.
- Lägg 340 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten, 40 pl ammoniumacetat och 400 fil fenol-kloroform till reaktionsblandningen. Vortexa reaktionerna för 30 sek.
- Snurra mRNA för 5 min, 14 tusen xg, 4 ° C.
- Pipet toppen (vattenhaltig) skiktet från varje reaktion flytta den till en färsk 1,5 ml skruvlock mikrocentrifugrör.
- Tillsätt en lika stor volym kloroform till var och en av de dekanterade reaktioner. Vortexa proverna för 30 sek.
- Snurra mRNA för 5 min, 14 tusen xg, 4 ° C
- Pipettera övre vattenskiktet från varje reaktion flytta den till ett färskt 1,5 ml skruvkork mikrocentrifugrör.
- Tillsätt en lika stor volym isopropanol till var och en av reaktionerna och utfälla mRNA vid -80 ° C under 30 minuter.
- Snurra vardera av reaktionerna för 15 min vid 14 tusen xg, 4 ° C för att pelle mRNA
- Avlägsna supernatanten noga med att inte störa det pelleterade mRNA
- Tillsätt 200 | il 70% etanol för att var och en av reaktionerna, blanda reaktionerna och sedan snurra under 10 min vid 14 tusen xg, 4 ° C.
- Avlägsna etanolen till att inte störa det mRNA, torka pelleten vid rumstemperatur med användning av en vakuumtorkapparat eller Speed-Vac.
- Åter avbryta mRNA i 10-20 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten. Spin kort och hålla proverna på is. Notera: uppvärmning av provet till 80 ° C under 1 min kan hjälpa det lösas upp.
- Kör 1 pl av mRNA på en 2% agarosgel (TAE) och analysera 1,2 ul på en spektrofotometer för att få en korrekt avläsning av koncentrationen.
Kritiska steget: En koncentration av 400 ng / ul av syntetiskt mRNA krävs för att utföra följande experiment.
Kritiskt steg: Om 260/280 förhållandet ärutanför intervallet 2,00-2,20, eller den totala mängden mRNA överstiger 12 mikrogram, genomföra en litiumklorid fällning. - Butiks mRNA i 1 | il alikvoter vid -80 ° C. Använd portioner och sedan kasta bort; inte frysas mRNA.
4. Generera Xenopus laevis Embryon
- Prime Xenopus laevis honor genom subkutan injektion med 50 enheter humant koriongonadotropin hormon (HCG, Chorulon) en vecka före försöket.
- Framkalla Xenopus laevis honor natten före experimentet genom att injicera 250 enheter av HCG och inkubera dem i mörkret, O / N vid 19 ° C.
- Dissekera ut testiklar från avlivas manliga groda och förvara i 1xNAM vid 4 ° C. Obs: Man groda avlivas av terminal anestesi i enlighet med schema 1 av djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
- Massage kvinnliga Xenopus laevis att framkalla ägglossning, samla laid ägg i en 55 mm diameter runt petriskål.
- Producera en spermie suspension genom att krossa ¼ av en Xenopus laevis testiklar i 1 ml avjoniserat vatten.
- Borste Xenopus-oocyter med den krossade spermiesuspensionen med användning av en Pasteur-pipett och pipet glödlampa kritiskt steg:. Utför gödslings reaktioner vid ungefär 04:30 på dagen för experimentet.
- Kultur embryon vid 21 ° C i NAM / 10 (se tabell 3 för lösningar) i 55 mm petriskålar belagda med en% agaros utspädd i vatten (vatten).
- De-gelé embryon efter 45 min med användning av cystein / HCl (tabell 3). Anmärkning: Vid 21 ° C, kommer embryon nå två cellstadiet efter 90 min och klyva varje 20 minuter efter detta.
5. Microinjecting Xenopus embryon
- Använda ett X 90mm glaskapillärer och Narishige PC-10 tvåstegs glasmikropipett avdragare, dra mikropipetter för injektionsvätskor. Justera inställningar empiriskt för att uppnå en fin spets (mindre än en mikron Diameter).
- Sätt en mikropipett (nål) till en gas microinjector (exempelvis Harvard Appartaus PLI-100 PICO-injektor) för att upprepade gånger leverera exakta volymer av vätska genom att anbringa ett reglerat tryck för en digitalt inställt tidsperiod. Justera pneumatiska press att leverera en volym på 1,25 till 10 nanoliter som bestämdes med en riktmedel eller kalibrerings bild.
- Coat en 55 mm petriskål med 5 ml 1% agaros (vatten). Skär en 35-35 mm kvadrat med agaros ur skålen, kommer detta att ge ett stabilt underlag för att mikroinjicera embryon.
- Överför embryon till NAM / 3 + Ficoll (tabell 3) och flytta injektion maträtt.
- Injicera embryon i djurets halvklotet när de når den erforderliga stadiet för experimentet.
- För att analysera fördelningen av GFP märkta ligander på cellytan, injicera embryona bi-lateralt på två cellstadiet, 10nl per cell. Exempel mRNA utspädning enligt nedan för Wnt8a-HA-EGFP. Avgörande steg: Se till att alla mRNA koncentrationer stkonst på 400 ng / l.
Obs: Mängden mRNA som skall injiceras behöver bestämmas empiriskt genom att testa koncentrationer och hitta den minsta mängd som behövs för att visualisera den fluorescenta liganden. Western blotting med användning av en anti-HA-antikropp är ett viktigt steg för att fastställa att de mRNA omräknas till liknande nivåer för att möjliggöra en jämförelse av två olika fluorescensetiketterade ligander; Vi har gjort detta för Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP i Fellgett et al., 2015.
Obs: Vid bedömningen av effekten av en injicerad mRNA (t.ex. en kodar för en kandidat regulator), är en typisk kontroll för att injicera en icke-aktiv RNA, såsom LacZ, till syskon embryon för att kontrollera för eventuella effekter av ytterligare transkript i embryot.- Späd memRFP mRNA 1 av 4 (1 pl + 3 pl dH 2 O) med molekylärbiologisk kvalitet vatten för att minska koncentrationen till 100 ng / l.
- Späd Wnt8a-HA-EGFP mRNA 1 av 4 (1 pl + 3 pl dH2 O) med molekylärbiologisk kvalitet vatten för att reducera koncentrationen till 100 ng / ul.
- Blanda memRFP mRNA i en 1: 1-förhållande med Wnt8a-HA-EGFP mRNA.
- Blanda mRNA från 5.5.1.3 i en 1: 1-förhållande med antingen kontrollen mRNA-LacZ eller en modulator såsom Sulf1.
- Injicera embryon bilateralt i två cellstadiet med 10nl av mRNA per cell (totalt 20nl). Obs: Detta resulterar i 250 pg m em RFP, 250 pg Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg Wnt11b-HA- e GFP och 2 ng LacZ eller Sulf1 mRNA injiceras i varje cell.
- För att analysera spridningen av GFP taggade ligander, injicera mRNA som kodar för ligand-GFP tillsammans med en härstamning markör såsom memRFP vid 16-32 cellstadiet, 1,25 nl per cell.
- För att analysera effekterna av eventuella modulator av ligand diffusion, co-injicera mRNA som kodar för modulatorn tillsammans med liganden och härstamning spårämne. Alternativt, injicera angränsande celler: en med mRNA som kodar för GFP-märkta ligand och en härstamning spårämne (memRFP) och den andra med mRNA som kodar för modulatorn och en annan härstamning spårämne (memCerulean).
- För att analysera fördelningen av GFP märkta ligander på cellytan, injicera embryona bi-lateralt på två cellstadiet, 10nl per cell. Exempel mRNA utspädning enligt nedan för Wnt8a-HA-EGFP. Avgörande steg: Se till att alla mRNA koncentrationer stkonst på 400 ng / l.
- Överför embryon till en 12,5 ° C inkubator och kultur till nästa dag, Nieuwkoop och Faber (NF) etapp 8.
6. excising Animal Cap Explantat
- Överför embryon till en 55 mm petriskålar belagda med 5 ml 1% agaros (vatten). Fyll skålen med NAM / 2 (tabell 3).
- Ta cirkulära skalltak använder Volfram nålar avgörande steg. Ta storbolag i detta skede eftersom de kommer att läka bättre och vara lättare att bilden, hålla styr caps att säkerställa att ingen konvergent förlängning sker.
- Överför djur explantaten till 55 mm petriskålar belagda med en% agaros (vatten) och kultur embryon vid 21 ° C under 4 h kritiskt steg:. Den 4 timmars inkubering krävs för att tillåta fluorescerande proteiner att mogna.
- Skapa lättnad glider genom att hålla ned två skikt av PVC insulation tejp på objektglas. Skär en 14 mm x 10 mm rektangel av bandet för att lämna en kammare för montering skalltak avgörande steg. Platta båda lagren av bandet ordentligt på objektglaset innan du skär rektangeln.
- Pipett 2 separata droppar av NAM / 2 (tabell 3) till befrielse slide, ca 30 l per droppe.
- Överför djur explants till hjälp bilderna med hjälp av en avskuren P20 spets och orientera så att den apikala sidan är vänd uppåt. Obs: Varje diabild kan hålla 10-15 skalltak avgörande steg. I detta skede skalltak borde ha delvis läkt, innebär detta att de är mindre känsliga och kan vara orienterad med pincett.
- Sänk försiktigt en glaskupa halka på lättnad bilden och låta locket glida torka i 20 min avgörande steg: Storleken på djuret locket är av avgörande betydelse,. säkerställa locket är stor nog att när glastäck sänks ned på avlastnings sliden det komprimerar den apikala skiktet av animaliska cap celler tillräckligt för att produce en plan yta för att avbilda. Om skalltak är för små fortfarande då minska PVC tejp till ett skikt.
- Täta bilden med hjälp av nagellack avgörande steg. Använd inte för mycket nagellack för att täta lättnads glider för om PVC-tejp blir för fuktigt det kommer att höja upp och förstöra bilden.
- Torra lättnad bilder för 20 minuter i mörker och de är redo att bilden, vanligtvis skalltak förblir hälsosamt för 4-6 timmar en gång förseglas i bilden.
7. Imaging
Obs: Bildåtergivning utfördes med användning av ett inverterat konfokalmikroskop. Lambda-läge valdes för avbildning eftersom det tillät flera fluoroforer med överlappande signaturer som skall användas, och bort problemet med potentiella prov rörelse mellan skanningar.
- Hitta explants med hjälp av en låg förstoring mål växla sedan till 63x / 1.4 olja mål för högre upplösning.
- Slå på nödvändiga lasrar; för detta exempel 405laser användes för att excitera memCerulean ades 488 laser som används för att excitera GFP och den 561 laser för att excitera memRFP användning 405 och 488/561 dikroiska speglar.
- Använd lambda läget (I Zen 2011, väljer lambda-läge - 32 fack).
- Välj 405nm, 488nm och 561nm lasers.To möjliggöra en bredare synfält, zooma ut bilden (till 0.6x).
- Ställ in bildstorleken till önskad bildstorleken (1024 x 1024 med pixelstorlekar av 220 nm användes för denna datauppsättning).
- Ställ averaging till typiskt 4 till åtta för att öka signalbrusförhållandet.
- Optimera hål (1 luftiga enhet enligt 561nm laser användes för denna datauppsättning).
- Optimera lasereffekter kritiskt steg:. Balans 405nm, 488nm och 561nm laser sådana att alla fluoroforer kan detekteras med användning av 32 detektorgruppen samtidigt som man minimerar den mängd av spänning och förstärkningen som krävs.
- Samla ljusvarelse som avges från memCerulean, GFP och memRFP. För detta arbete ljus samlades varje ~10 nm från 415-720nm, även om större uppsamlingsintervall är också möjliga (t ex. Varje ~ 20 nm).
8. Bildanalys
- Undersöka effekterna av modulatorer på cellytan uttryck av GFP-märkta ligander
OBS! Följande steg är en detaljerad guide om hur analysen genomfördes i vårt laboratorium. Slutanvändaren kanske vill effektivisera processen genom att skriva en ImageJ eller FIJI skript för att avlägsna en del av de manuella steg.
Avgörande steg: Det är viktigt slutanvändar samplar spektra av någon fluoroforer som används i samma villkor som den slutliga experimentet utförs i syfte att Perf orm effektiv spektral unmixing av de multipla fluoroforer som används i den slutliga försöket.
Två huvudtyper av analyser utförs i detta avsnitt:- Beräkna det totala antalet Wnt-HA-EGFP pixlar co-lokaliserings med cellmembranet.
- Unmix det gröna,röda och cerulean kanaler med spektra samplade från enstaka injektioner av dessa fluoroforer i ZEN programvara. Spara dessa bilder som separata LSM dokument att använda i alla följande steg.
- Öppna LSM filer direkt i ett bildbehandlingsprogram. Obs: Följande instruktioner är för FIJI Image J.
- Spara LSM bilder som bildsekvens dokument, detta kommer automatiskt att dela bilderna i separata kanaler.
- Spara bildsekvensen i samma mapp som skript för skriptet analysprogram som kommer att användas för att analysera data (se kompletterande kodfiler för själva script). Obs: Följande instruktioner är för Matlab.
- Öppna upp manus analysprogrammet och öppna den katalog där manus skrivs.
- Ange filnamnet under Plats analys, kommer programmet att ta filnamnet och utföra analysen.
Obs! Filnamn kommer att läsa ImageA0000 och ImageA0001 för varje IMAGE. Programvaran script analysen kommer att använda bilden märkt 0001 som mask och analysera andelen pixlar i bild 0000 som samar lokalisera med denna mask. - Ta den procentuella samlokalisering nummer (kommenterad som cellmembran befolkade) och kopiera det till ett kalkylblad. Obs: Följande instruktioner är för Excel.
- Rita den procentuella samlokalisering nummer på ett stapeldiagram antingen som en absolut eller relativt värde.
- Analysera antalet, storleken och formen på Wnt-HA-EGFP puncta.
- Öppna oblandad LSM filer direkt i ett bildbehandlingsprogram. Obs: Följande instruktioner gäller FIJI Image J.
- Split varje bild i sina separata kanaler (Bild> Färg> Split kanaler).
- Tröskel både Wnt-HA-EGFP och membranmarkeringskanalerna (Bild> Justera> Auto-tröskel) avgörande steg. Prova ett antal trösklar för att se vilket som ger en representativ bild, utan att överexponerakanalen.
- Konvertera membranmarkeringskanal till en mask (Process> Binary> Gör mask).
- Vänd denna mask (Redigera> Invertera).
- Konvertera Wnt-HA-EGFP puncta till en mask som ovan.
- Subtrahera membranmarkeringsmasken från ligand-GFP mask (Process> Bild kalkylator> Wnt mask i top box, membran mask i nedre rutan).
- Använd analysera partikelfunktionen. Härifrån väljer de parametrar som krävs och analysera data (Analysera> Analysera partiklar).
- Kopiera antalet partiklar, genomsnittlig partikelstorlek och cirkularitet data i ett kalkylblad och sedan rita grafer från dessa uppgifter. Obs! För denna analys partiklar endast mellan 0.1-10μm 2 storlek analyserades gjordes inga begränsningar placerades på partikel cirkularitet. Denna instruktion är för Excel.
- Beräkna det totala antalet Wnt-HA-EGFP pixlar co-lokaliserings med cellmembranet.
- Analysera de olika ligand diffusion
- Öppna alla oblandade bilder i konfokal imåldrande programvara och sedan exportera filer i en TIF-format, som rådata och som en RGB-bild Obs:.. Denna instruktion är för Zen lite 2011 kritiskt steg: Inkludera en skala bar på åtminstone en av bilderna så att avståndet kan vara beräknas under analysen.
- Öppna de bilder som ska analyseras inom bildanalys mjukvara. Obs: Följande instruktioner är för Photoshop 8.2.3) Högerklicka på bakgrunden på bilden och välj "lagret från bakgrunds", för att skapa ett nytt lager..
- Ställ in membranmarkerings kanalerna till 0, så att endast ligand-GFP kanalen visas (Lager> Nytt justeringslager> Blanda kanaler) avgörande steg. Fäst nya justeringslagret i bilden som analyseras, för att alternativet klippa det nya lagret till den här bilden är tillgänglig som en kryssruta när du klickar på kanalmixer alternativet.
- Öppna en ny arbetsyta. Ställ in upplösningen till 300 pixlar per tum och färgläget till RGB (Arkiv>Ny> Urklipp).
- Kopiera alla bilder som analyseras i den inre arbetsytan (Klicka på bilden och det är klippt kanalmixer genom att hålla kontroll håll kontroll och Alt och dra bilden i arbetsytan).
- Orientera alla bilder så att den maximala längden för diffusion för varje bild kan mätas längs den horisontella axeln, med celler som uttrycker Wnt-HA-EGFP orienterade till vänster.
- Spara arbetsutrymme som TIF och sedan öppna i bildanalysmjukvara. Obs: Följande instruktioner är för FIJI Image J.
- Öppna ROI manager fönstret (Analysera> Verktyg> ROI manager).
- Rita en rektangel på den första bilden, kan den exakta storleken på rektangeln anges (Välj rektangelverktyget och dra några rektangel> Redigera> Val> Ange). Anmärkning: En storlek av 650 x 100 pixlar längd x bredd användes i denna studie.
- Placera rektangel på yttersta kanten av domänen uttrycker Wnt-HA-EGFP. Placera rektangeln över regionen med det maximala avståndet Wnt-HA-EGFP diffusion. Avgörande steg: Även utan membranmarkör regionerna uttrycker Wnt-HA e GFP ska vara synlig på grund av bakgrundsfluorescens; om inte så kontakta råbilder.
- Shift lådan 10 iM till höger. Bestäm antalet mikrometer genom att mäta längden av skalan bar ingår i en av bilderna (Rita en linje spåra skal> Analyse> inställd skala). Obs: Detta ger ett värde under 10 iM i pixlar.
- Lägg rutan till ROI manager genom att trycka på knappen Lägg till i ROI manager fönstret.
- Flytta rektangeln till nästa bild som ska mätas genom att klicka tillbaka på rektangelverktyget för att flytta rektangeln. Upprepa steg 8.2.10-11.
- När alla paneler har mätts, väljer multiplot från ROI manager menyn (ROI manager> Mer> Multiplot> List).
Obs: data representerar Wnt pixel Intensity (Y) med ökande avstånd längs den horisontella axeln (X, mätt i bildpunkter). Värdet för Y är den genomsnittliga signalintensiteten av ligand-GFP vid punkten X och medelvärdet beräknas utifrån samtliga bildelement i Y-axeln för varje X-värde. Följaktligen högre rutan, desto fler pixlar analyseras för att producera detta genomsnitt. En liten låda (i Y-axeln) blir bullrigare; en lång låda kommer att ha mycket låg genomsnittlig pixelintensiteten. - Kopiera data från multiplot rutan i ett kalkylblad och åter etikett i enlighet med detta. Obs: Följande instruktioner är för Excel.
- Kasta den första 10-20μm av data från varje analys eftersom det representerar bakgrundsfluorescens från ligand-GFP-uttryckande celler och snedvrider diagrammen.
- Öppna upp vetenskaplig analys och grafer programvara och skapa en ny bärbar dator. Obs: Följande instruktioner är för Sigmaplot 13.
- Märk erforderligt antal kolumner för data genom att dubbelklicka på de horisontella tal on kalkylbladet och märka dem avstånd um, Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP.
- Kopiera data från kalkylbladet i de relevanta kolumnerna i den vetenskapliga analysen och grafiska program.
- Skapa en punktdiagram (Skapa diagram> Scatter> Flera scatter> Välj X många Y> Markera avståndet kolumnen för X> Välj Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP för Y-värden> Slutför).
- Utför regressionsanalys på Wnt8a-HA-EGFP kurva genom att vänsterklicka på en Wnt8a-HA-EGFP punkt på punktdiagram. Alla punkter bör belysa. Klicka på Analys> Regression guiden.
- Välj kurvan ekvationen kategori (exponentiell förfall) och ekvationen namn (Singel, 3 parameter) och tryck sedan på nästa.
- Välj x- och y-värden som kurvan ska monteras (om uppgifterna tidigare markerat bör detta ske automatiskt) och tryck sedan på nästa.
- Fortsätt genom guiden tills den numeriska Output alternativs sida, se till att "skapa rapporten är ikryssad och tryck på nästa. Obs: Parametrarna för den anpassade kurvan kommer att visas i Rapport 1 *.
- På sidan Graf alternativ säkerställa "lägga ekvation för att rita titel" är ikryssad och tryck sedan på finish. Obs: Guiden kommer att ha skapat Rapport 1 * och Diagram 1 * flikarna högst upp på anteckningsbok. Dessutom kurvan kommer att ha lagts till grafen som producerats i (8.2.20).
- Upprepa steg 8.2.21-8.2.25 att passa en kurva för Wnt11b-HA-EGFP kritiskt steg:. Prova montering multipla ekvations kategorier och ekvationsnamn till data. Obs: Kurvan med bäst anpassade ska ge värdet högsta R2 med den lägsta rest summan av kvadraterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocal analys av animaliska cap explantat som uttrycker fluorescerande taggade proteiner ger ett effektivt system för att visualisera ligand fördelning under olika experimentella betingelser. I ett exempel, fördelningen av GFP-märkt Shh visas (figur 1). Vid två-cellstadiet, är Xenopus embryon injiceras i båda cellerna med antingen med en kontroll mRNA eller med mRNA som kodar för Sulf1, ett enzym som modifierar cellytan heparansulfat och påverkar Shh morfogenen gradienten 16. Dessa embryon odlas tills 32-cellstadiet och en enda cell är co-injicerade med mRNA som kodar för Shh-GFP och memRFP (som en härstamning spårämne). Detta skapar en klon av celler som uttrycker Shh-GFP som är markerad med cellmembranet bundna RFP. Vid blastula skede djur cap explantat togs för analys med konfokalmikroskopi. Figur 1 visar att under kontrollbetingelser, är Shh-GFP utsöndras och diffunderar utanför region som uttrycker de injicerade mRNA. Men i närvaro av Sulf1 är Shh-GFP mer begränsad i sin distribution och, i detta prov, inte upptäcks utanför klon av celler som producerar det. Effekterna av Sulf1 på Shh-GFP distributionen har analyserats mer fullständigt 16.
När den uttrycks i Xenopus embryon, fluorescensmärkta Wnt-ligander utsöndras, ackumuleras på cellmembranet, och diffundera över fältet av celler. I fig 2, vi karaktärisera quantitaive och kvalitativa egenskaper hos två olika fluorecently taggade Wnt-ligander i celler som injicerats och uttrycka proteinerna. Figur 2A-H visar exempel på hur Wnt8a och Wnt11b-HA-EGFP ackumuleras på membranet av animaliska cap celler . Genom att jämföra paneler 2B och 2F är det tydligt att Wnt8a-HA-EGFP ackumuleras mer effektivt på cellmembranet än Wnt11b-HA-EGFP. Kvantitativ information har hämtats från den konfokala bilder med hjälp av en comkombination av bild och skript analysmjukvara (kompletterande kod fil). Figur 2I visar den relativa ackumuleringen av Wnt8a-HA-EGFP på cellmembranet jämfört med Wnt11b-HA-EGFP. Data erhölls genom att använda en dator skript som avgör det totala antalet Wnt-HA-EGFP pixlar co-lokaliserings med cellmembran pixels i varje bild. I ett annat tillvägagångssätt, är det totala antalet Wnt-HA-EGFP puncta som samar lokalisera med cellmembranet räknade med hjälp av bildanalys programvara (Figur 2J). Kvalitativ information om storleken och formen på enskilda puncta kan också extraheras från data med hjälp av bildanalysmjukvara. Förutom färre Wnt11b-HA-EGFP puncta samtidig lokalisera med cellmembranet (figur 2J) dessa puncta också har en mindre genomsnittlig storlek än Wnt8a-HA-EGFP puncta (fig 2K). Dessutom Wnt11b-HA-EGFP puncta har en reducerad cirkularitet jämfört med Wnt8a-HA-EGFP puncta (Figur 2L). Circularity är ett mått på hur nära ett objekt liknar en perfekt cirkel, med en representerar en perfekt cirkel och 0,1 en långsträckt icke-cirkulär form. Denna metod kan användas för att testa någon kandidat regulator av Wnt ligand diffusion. För att göra detta bör kontrollceller injiceras med ett styr mRNA som kodar för en inaktiv form av kandidat regulator eller ett irrelevant protein såsom p-galaktosidas (lacZ); Detta ger en mer giltig kontroll än helt enkelt inte injicerar regulatorn. Data i dessa exempel analyserades med användning av icke-parametriskt test Mann-Whitney U 18-19. Ett program statistisk analys användes för att genomföra testet.
I figur 3 undersöker vi Wnt ligand diffusion. En enda blastomer injicerades vid 4-cellstadiet, så att djur cap explantaten representera ett fält av celler i vilka endast vissa celler uttrycker antingen Wnt8a-HA-EGFP eller Wnt11b-HA-EGFP. Genom att inkludera en cell härstamning spårämne, kan vi identifiera expressing kontra icke-uttryckande celler och detta gör utbudet av Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP ligand diffusion från käll celler som skall analyseras (figur 3B och 3C). På grund av krökningen av djur cap explants, det maximala avståndet som kan mätas på ett tillförlitligt med denna analys var 160μm, vilket inte var tillräckligt för att mäta det absoluta avståndet ligand diffusion. Men genom att använda en kombination av konfokal analys, bildanalys och vetenskaplig analys och plottning programvara den övergripande formen av Wnt-HA-EGFP morfogen gradient kunde analyseras (Figur 3D). Dessa data kan användas för att undersöka om överuttryck annat protein tillsammans med de märkta ligander i samma celler kan påverka Wnt sekretion eller diffusion. Vid en annan typ av experiment (figur 3E-3J) effekterna av en potentiell regulator i mottagande celler kan mätas genom överuttrycker kandidatprotein i kloner av celler intill celler extrycka Wnt8a eller Wnt11b-HA-EGFP. Detta gör att alla icke-cell-autonoma effekter regulatorn på Wnt-HA-EGFP ligand diffusion som skall undersökas. I överensstämmelse med figur 2, kan mer Wnt8a-HA-EGFP detekteras diffundera bort från celler än Wnt11b-HA-EGFP både diffusion experiment.
De typer av experiment som beskrivs i detta dokument har använts för att analysera effekten av Sulf1 på Shh och Wnt signalering 16,17.
Figur 1. Modulering av Shh-GFP fördelning kan detekteras genom konfokal analys av Xenopus skalltak. (A) En tecknad film som visar experimentella analys där embryona först injiceras med mRNA som kodar för Sulf1 eller en kontroll mRNA samma embryona senare injiceras vid 32-cellstadiet med mRNA som kodar för Shh-GFP till en enda cell. (BC) Djurlock explantats togs vid steget 8 och avbildas efter 4 timmar. Bilderna visas vid kanten av en Shh-GFP + memRFP uttryck klon av celler. I kontrollembryon (B), är Shh-GFP fördelas bort från memRFP märkt klon av signalproducerande celler. I embryon uttrycker Sulf1 (C), är Shh-GFP mer begränsad i sin distribution, se 16. memRFP visas i magenta och Shh-GFP i grönt. Skalstrecken representerar 20 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kvantitativ och kvalitativ analys av Wnt8a och Wnt11b-HA-EGFP puncta på cellmembranet. (AH) Embryon mikroinjicerades bi-lateralt med mRNA som kodar memRFP (500 pg) i djuret halvklotet vid två cellstadiet. Dessutom embryon injicerades med mR NA-kodning (AD) Wnt8a-HA-EGFP (500 pg) eller [EH] Wnt11b-HA-EGFP (1 ng). Embryona injicerades också med mRNA som kodar för LacZ att tillhandahålla en kontroll för ytterligare mRNA / protein när man analyserar effekterna av eventuella regulator. De vita rutorna i (C) och (G) markerar de områden förstorade i paneler (D) och (H) resp. Det totala beloppet Wnt-HA-EGFP fluorescens co-lokalisera med cellmembranet beräknades med hjälp av bild och manus analys programvara och sedan normaliseras (I). Kvalitativ information extraherades med användning av bildanalysmjukvara. Wnt8a och Wnt11b-HA-EGFP punctae analyserades för partikelantal (J), partikelstorlek (K) och partikel cirkularitet (L). Mann-Whitney U (** P <0,01), N = antal embryon. memRFP visas i magenta och Wnt8a / 11b-HA-GFP visas i grönt, skal staplar representerar 20 pm.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Mätning av utbudet av diffusion av fluorescensmärkta Wnt-ligander. (A) Diagram som visar analysen används för att mäta Wnt8a och Wnt11b-HA-EGFP sekretion och diffusion från uttryckande celler. (BC) mRNA kodning (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) och Wnt8a-HA-EGFP (2 ng) eller (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) och Wnt11b-HA-EGFP (2 ng ) injicerades i djuret hemisfär av en blastomer i fyra cellstadiet. (D) Området för diffusion av Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP mättes genom en kontrollbakgrund. (E) schema som avbildar analysen används att mäta Wnt8a och Wnt11b-HA-EGFP diffusion genom en bakgrund uttrycker LacZ, se metod for det plågar. (FG) mRNA som kodar memCerulean (600 pg) och (F och H) Wnt8a-HA-EGFP (2 ng) eller (G och I) Wnt11b-HA-EGFP injicerades i djuret hemisfär av en blastomer vid fyra cellstadiet. En intilliggande blastomere injicerades med mRNA som kodar memRFP (600 pg) och LacZ (4 ng) se Key för mer information. (J) Utbudet av Wnt8a-HA-EGFP och Wnt11b-HA-EGFP diffusion mättes genom en bakgrund uttrycker LacZ. Data kvantifierades och ritas med hjälp av konfokal analys, bildanalys och vetenskaplig analys och grafiska program. memCerulean (blå (CD) och gul (F och H)), Wnt-HA-EGFP (grön), memRFP (magenta), skal staplar representerar 20 pm. Klicka här för att ladda ner en större version av denna fil.
filer / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>
Tabell 1. Primrar som används för att subklona Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP och Shh-GFP in pCS2.
| Reaktion | Komponenter | |
| Exempel CS2 + digere | 1,5 ^ g av pCS2 + | |
| 2 pl av restriktionsenzymet 1 | ||
| 2 pl av restriktionsenzymet 2 | ||
| 5 il restriktionsenzymbuffert (10X) | ||
| Består till 50 pl med molekylärbiologisk kvalitet vatten | ||
| Exempel mRNA-syntes | 2 pl linjäriserad mall | |
| 2 ul 10x Megascript TRX blandning | ||
| 2 fil 50 mM ATP | ||
| 2 | il 50 mM CTP | ||
| 2 | il 50 mM UTP | ||
| 2 ^ 5 mM GTP | ||
| 2,5 pl 40 mM Cap Analog (m7G (5 ') | ||
| 2 pl SP6 enzymblandning | ||
| 3,5 pl Molecular grade vatten | ||
| Exempel PCR-reaktion | 0,5 ^ High fidelity-DNA-polymeras (2.000 enheter / ml) | |
| 2 ng mall-DNA | ||
| 2,5 il framåt och bakåt primers (10 um) | ||
| 0,5il dNTP | ||
| 5 | il DNA-ploymerase buffert (10X) | ||
| Består till 50 pl med molekylärbiologisk kvalitet vatten | ||
| Exempel PCR-betingelser | Intial denaturering 2 min vid 98 ° C | |
| 15 sek 98 ° C | ||
| 15 sek 65 ° C | 30 cykler | |
| 40 sek 72 ° C | ||
| Slutlig förlängning 10 min vid 72 ° C | ||
| Exempel PCR-produkten digere | 28 il PCR-produkt | |
| 2 il begränsning enzyme 1 | ||
| 2 pl av restriktionsenzymet 2 | ||
| 5 il restriktionsenzymbuffert (10X) | ||
| 13 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten | ||
| Exempel T4 ligering | 1 pl Cut CS2 + | |
| 3 pl Cut PCR-produkten ett | ||
| 3 pl Cut PCR-produkt 2 | ||
| 1 fil T4-DNA-ligas | ||
| 1 | il T4-DNA-ligasbuffert (10X) | ||
| 1 pl av molekylärbiologisk kvalitet vatten | ||
| Exempel mall smälta | 5 ug plasmid-DNA | |
| 10 | il restriktionsenzymbuffert (10X) | ||
| 3 il Not1 (utom Shh-GFP, Kpn1 används) | ||
| Består till 100 pl med molekylärbiologisk kvalitet vatten |
Tabell 2. Exempel reaktionsbetingelser som används för subkloning och producera syntetiska mRNA för Wnt8a-HA-EGFP.
| Lösning | Komponenter |
| Cystein-HCl | 0,1 X NAM |
| 2,5% L-cystein-hydroklorid-monohydrat (pH 7,8) | |
| NAM-salter | 110 mM NaCl |
| 2 mM KCl | |
| 1 mM CA (NO3) 2 | |
| 0,1 mM EDTA | |
| NAM / 2 | 0,5X NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mM Bikarbonat | |
| 25 | ig / ml gentamycin | |
| NAM / 3 + Ficoll | 0.33X NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mM Bikarbonat | |
| 2 5ug / ml gentamycin | |
| 5% Ficoll | |
| NAM / 10 | 0,1 X NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 25 | ig / ml gentamycin |
Tabell 3. Lösningar som används under produktionen och mikroinjektion av Xenopus laevis embryon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En väsentlig del av detta protokoll genererar biologiskt aktiva ligander som normalt behandlas, utsöndras, och som kan framkalla ett svar i den mottagande cellen, trots att de har en fluorescerande bunden. Det är kritiskt att fastställa att den fluorescensmärkta genprodukten är biologiskt aktiv med användning av en lämplig analys. För Shh-GFP, var förmågan att aktivera uttrycket av PTC1 bekräftas 16. Wnt8a har en anmärkningsvärt potent förmåga att inducera en sekundär axel när den uttrycks i en enda ventralt blastomer 20-21, och Wnt8a-HA-EGFP visades bibehålla denna biologiska aktivitet. Wnt11b hämmar aktivin behandlad ektodermala explants från genomgår konvergent förlängning 21-22 och Wnt11b-HA-EGFP behåller också sin biologiska aktivitet 17. Förmågan hos de märkta ligander för att framkalla reaktioner motsvarande de omärkta proteiner tyder på att slutsatserna bygger på experiment med hjälp av fluorescerande ligander be är relevant för det normala proteinet. Tillsatsen av HA-epitopen mellan liganden och det fluorescerande proteinet som en spacerregion som gör att Wnt-konstruktionerna att vara både aktiv och fluorescerande.
Den största begränsningen av denna typ av analys är att det inte direkt informera om endogena morfogena lutningar. Exempelvis kan diffusion av Shh över fältet av celler i djurlocket inte återspegla det sätt endogena Shh rör sig genom den kolonn neurala epitelet i embryot. Men enkelheten i detta protokoll gör experiment där effekten av exogena tillsynsmyndigheter om fördelningen av ligander kan testas. Resultaten från dessa metoder kan utgöra grunden för hypoteser som ska testas med användning mer krävande in vivo-analyser. Exempelvis pekade förmågan hos överuttryckta Sulf1 att begränsa fördelningen av Shh-GFP med användning av de metoder som beskrivs i detta dokument att potentialen för Sulf1 vid modulering av Shh morfogen gradient. Detta var direkt testats och validerats med antisens morfolino knock-down av Sulf1 och immuncytokemi att visualisera endogen Shh i neuralrörsdefekter 16. En liknande metod för att vår har använts för att undersöka specifika mekanismer som skulle kunna reglera ligand diffusion. Smith och kollegor visade att en GFP-märkt nodal (Xnr2) används enkel diffusion, och inte cell förlängningar (cytonemes) eller transcytos (med användning av vesiklar) för att bilda en gradient 23.
Ytterligare vidareutvecklingar av dessa förfaranden är möjliga där andra proteiner som blockerar specifika reaktionsvägar kan uttryckas i målceller för att undersöka om ett svar till signaleringsmolekylen behövs som en mellanhand för att vidarebefordra signaler från en cell till en annan. Till exempel, som uttrycker en dominant negativ aktivin receptor mellan källan för aktivin och de svarande celler visade att enkel ligand diffusion kan framkalla ett svar flera celldiametrar bort från källan even med icke-responsiva celler i mellan 24. Denna slutsats stöddes av arbete i zebrafisk där vildtypceller kan svara på en källa till nod, trots att omges av icke-responsiva muterade celler som saknar en viktig co-receptor för nodal 25. Andra studier har använt zebrafisk att undersöka spridningen av fluorescerande taggade ligander 28,29. Vissa studier har observerat att epitop tagga C-terminalen av Wnt-proteiner kan påverka signal aktivitet, möjligen på grund av de kraftigt konserverade cysteiner som bidrar till proteinkonformation. Vårt tidigare arbete har visat att bland annat ett distansorgan (såsom HA-markör) resulterar i etikette Wnt ligander som är biologiskt aktiva 17. Detta är sannolikt eftersom distansen ger flexibilitet som behövs för ligand-receptorinteraktion, såsom i tummen pekfingret modell av Wnt-Frz bindande 30.
Nästa steg för att främja våra studier är att inkludera en visUAL avläsning för aktiveringen av signalvägen. Exempelvis uttrycker GFP-tagged DVL 26 i celler på avstånd från källan för liganden kommer att tillåta intervallet över vilken Wnt11b har förmåga att signalera, som skall mätas. Utbudet av Wnt8a signaleringsaktivitet kunde påvisas med användning av antikroppsfärgning för att mäta nukleär lokalisering av B-catenin i celler 27 på ett avstånd från källan. Dessa typer av experiment är möjliga med användning av de tekniker som beskrivs i detta dokument. Genom att använda en mängd olika fluorescerande proteiner eller fluoroforer, skulle en ytterligare nivå av information som ska lämnas där man mäter inte bara fördelningen av en ligand men också produktionen av de signalvägar, och på så sätt bestämma tröskelområdet för en morfogen .
Xenopus laevis är en användbar modell för att visualisera GFP-märkta ligander och ytterligare information om metoder för upphandlande embryon, mRNA-syntes, mikroinjektion och dissekerajon är tillgängliga 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en BBSRC bevilja ledamot av Europaparlamentet (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvot anställning till SAR och en MRC STUDENT till SWF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Free download http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer - M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | homemade | ||
| Zen lite software | Carl Zeiss | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
