Summary
Manuskriptet her gir et enkelt sett med metoder for å analysere utskillelsen og spredning av fluorescently merkede ligander i Xenopus. Dette gir en sammenheng for å teste muligheten for andre proteiner for å modifisere ligand fordeling og tillater eksperimenter som kan gi innsikt i mekanismene som regulerer morphogen gradienter.
Abstract
Denne protokollen beskriver en metode for å visualisere ligander fordelt over et felt av celler. Det er utrolig lett å uttrykke eksogene proteiner, sammen med den store størrelsen på sine celler i tidlige embryoer, gjør Xenopus laevis en nyttig modell for å visualisere GFP-merket ligander. Syntetiske mRNA er effektivt settes etter injeksjon i tidlig stadium Xenopus embryo, og injeksjoner kan være rettet mot en enkelt celle. Når kombinert med en avstamning tracer, for eksempel membran bundet RFP, kan det injiserte cellen (og dens etterkommere) som gir de overuttrykt protein lett følges. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av fluorescensmerket WNT og shh ligander fra injisert mRNA. Fremgangsmåtene involverer micro disseksjon av ectodermal eksplantater (dyre caps) og analyse av ligand diffusjon i flere prøver. Ved å bruke confocal bildebehandling, kan informasjon om ligand sekresjon og spredning over et felt av celler oppnås. Statistiske analyser av konfokale bilder gir kvantitative data om formen ligand gradienter. Disse metodene kan være nyttig for forskere som ønsker å teste effekten av faktorer som kan regulere formen morphogen gradienter.
Introduction
Under tidlig embryoutvikling, blir cellene progressivt forpliktet til å følge bestemte linjer av differensiering: Dette betyr at en gruppe av totipotent (eller pluripotent) celler blir begrenset gradvis til å etablere populasjoner av stamceller bestemt for å gi opphav til en celletype. Celle-celle signalisering er sentralt i reguleringen av avstamning spesifikasjon under embryonal utvikling. Manipulering av disse signalene vil være nødvendig for å lede stamceller mot spesielle skjebner å støtte nye medisinske behandlinger.
Et relativt lite antall signalveier er gjentatt under utvikling, blant annet veier å svare på TGF super (nodals og BMP) 1-2, FGF'er 3, Wnts 4, og Pinnsvin 5. Disse utskilte proteiner binde reseptorer til stede på cellemembranen for å aktivere signaloverføring og dermed endre genekspresjon og / eller celle-adferd. Den stramme regulering av celle tegnAlling er viktig for celle avstamning spesifikasjon og normal utvikling. Mens krysstale mellom disse banene er viktig for å bestemme skjebnen celle, kan et enkelt ligand i seg selv fremkalle forskjellige responser i forskjellige konsentrasjoner. Morphogen gradienter ble beskrevet over 100 år siden som en teori for å forklare hvordan ulike celletyper kan utlede fra et felt av celler 6. Signale molekyler som produseres av en gruppe celler kan diffundere over et visst område, avtar i konsentrasjon med en større avstand fra kilden. Celler utsatt for signalet vil reagere på den lokale konsentrasjon i sine posisjoner i feltet av celler, med celler i forskjellige stillinger reagere forskjellig på forskjellige nivåer i signalet. Bevis for eksistensen av morphogens kommer fra studier av den tidlige Drosophila embryo 7 og vingen skive 8, i tillegg til virveldyr lem 9 og neural røret 10.
Metoder er nødvendig for å ivestigate hvordan morphogen gradienter er etablert og å identifisere andre molekyler viktige i å regulere disse stigninger. Elegante eksperimenter ved hjelp av immunhistokjemi for å visualisere endogene proteiner in vivo i forbindelse med ulike genetiske bakgrunn er blitt brukt til å undersøke morphogen gradienter 11-12. Imidlertid gode antistoffer og spesifikke mutanter er ikke alltid tilgjengelig, så vi beskriver her en protokoll ved hjelp av overekspresjon av fluorescerende ligander i Xenopus, for å tilveiebringe en alternativ, enkel metode for å dissekere hvor eksogene genprodukter kan påvirke fordelingen av ligander over et felt av celler. Xenopus laevis gir et utmerket system for å gjennomføre slike eksperimenter som sine embryoer utvikle eksternt, slik at de er tilgjengelige på de tidligste stadiene. Sin store størrelse (1-1.5mm i diameter) forenkler mikroinjeksjon og kirurgisk manipulering og ved blastula iscenesetter cellene er lett å image som de er fortsatt relativt stor (ca. 2081; m over). Overekspresjon studier i Xenopus er enkelt å gjøre: mRNA injiseres i tidlig embryo kan målrettes mot bestemte celler og er effektivt oversatt.
De fluorescently tagget Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP konstruksjoner ble generert ved hjelp pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 og EGFP. HA peptid er viktig å inkludere, ikke bare for å gi en ytterligere molekylær tag, men også fordi det er tenkt å fungere som en avstandsholder som skiller de WNT og EGFP-proteiner tillater begge genprodukter for å fungere. Den konstruksjon som brukes for visualisering av Shh ble tidligere brukt til å generere et transgene mus som uttrykker en Shh-EGFP-fusjonsprotein 15; dette ble vennlig levert av Andy McMahon. Viktigere er GFP tag for alle konstruksjonene klonet 3 'for signalsekvensen, slik at det opprettholdes etter behandlingen. Det er også viktig å sikre at det endelige protein omfatter sekvenser som er nødvendig for modifikasjoner, slik at tilsetningenn av lipider som er tilfelle for Shh og Wnt ligands.The cDNA ble subklonet i pCS2 + uttrykk vektor som er optimalisert for prodution av syntetisk mRNA; den inneholder en SP6 promoter og polyadenyleringssignalet (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Arbeidet er beskrevet her gir en enkel protokoll for å sammenligne sekresjon og spredning av fluorescently tagget Wnt og Shh tagget ligander. Ved å injisere definerte mengder syntetiske mRNA, circumnavigates protokollen eventuelle problemer knyttet til variabel uttrykk fra ulike vektorer ved hjelp av ulike arrangører. Disse metodene har nylig blitt brukt for å undersøke effektene av heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-EGFP og Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP sekresjon og diffusjon i Xenopus 16-17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk uttalelse: Dyreforsøk ble gjort under en britisk Hjemmekontor lisens til MEP og eksperimenter utført ble godkjent av University of York etikkutvalg i samsvar med den kommer (forsøksdyr: Rapportering av in vivo-forsøk) retningslinjer. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).
1. Strategi for å generere fluorescently Tagged Ligander
Nedenfor er et eksempel på protokoll for subkloning Wnt8a-HA og EGFP inn pCS2, for å produsere den i ramme fusjon konstruere Wnta-HA-EGFP:
- Sett opp og kjøre PCR reaksjoner for Wnt8a-HA og EGFP. Bruk primer informasjonen som vises i Tabell 1, og eksempel PCR reaksjonen og eksempel PCR-betingelsene vist i tabell 2. Merk: mal DNA, vil variere avhengig av konstruksjonen som blir produsert i dette eksempel, er Wnt8a-HA anvendt som templat-DNA.
- Rydd opp PCR reaksjoner ved bruk av en gel utvinning kit, utføre endelige eluering i tre0μl av molekylær grade vann.
- Kontroller 2 pl av PCR-produktet på en 1% agarosegel i TAE fremstilt.
- Digest Wnt8a-HA og EGFP PCR-produkter og pCS2 ved hjelp av passende restriksjonsenzymer (se tabell 1), satt opp reaksjoner som beskrevet i tabell 2 (eksempel PCR-produkt digest).
- Inkuber reaksjoner i 3 timer ved 37 ° C, og deretter lagre Wnt8a-HA og GFP PCR-produkter på is.
- Legg 1 ul av alkalisk kalve intestinal fosfatase (CAIP) til pCS2 fordøye og inkuberes i 6 min ved 37 ° C.
- Varme inaktivere CAIP ved inkubering i 15 minutter ved 65 ° C.
- Kjør pCS2 og PCR fordøyer på en 1% ultra agarosegel utarbeidet i TAE.
- Gel ekstrakt og rydde opp pCS2 og PCR-produkter ved hjelp av en gel utvinning kit, utføre endelige eluering i 30 ul av molekylær grade vann.
- Sett opp ligering som beskrevet i tabell 2 (eksempel T4 ligering) og inkuber ved 12 ° C i 16 timer.
2. mRNA Synthesis: Generering av Template
- Produsere maler ved hjelp av restriksjonsenzym-nedbrytning av de følgende plasmider (alle i ekspresjonsvektoren pCS2): membran-Shibuya (memCerulean), membran-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP.
- Sett opp restriksjonsspaltninger som beskrevet i tabell 2 (eksempel mal digest).
- Bland forsiktig og inkuber reaksjonene i 2 timer ved 37 ° C.
- Kjør 2,5 ul av fordøyd plasmid på en 1% agarosegel (TAE) for å kontrollere at reaksjonen er fullstendig kuttet.
- Rydde opp i fordøyer med en gel utvinning kit, utføre endelige eluering i 50 ul molekylær grade vann.
3. mRNA Synthesis: In vitro transkripsjon
- Syntetisere funksjonelle mRNA ved hjelp av SP6 mRNA transkripsjon kit. Monter reaksjoner i 1,5 ml DNAse / RNase fritt mikrosentrifugerør.
- Sett opp mRNA transkripsjonsreaksjoner, som beskrevet i tabell 2 (eksempel mRNA-syntese).
- Blandreaksjoner forsiktig med en pipette og deretter inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
- Kontroller 1 pl av reaksjonen på en 2% agarosegel (TAE).
- Tilsett 1 pl DNAse til reaksjons, bland forsiktig med et P20 og inkuber reaksjonsblandingen i ytterligere 15 minutter ved 37 ° C.
- Legg 340 mL av molekylær klasse vann, 40 ul av ammoniumacetat og 400 mL av fenol-kloroform til reaksjonen. Vortex reaksjonene i 30 sek.
- Snurr mRNA for 5 min, 14 000 xg, 4 ° C.
- Pipette toppen (vandig) lag fra hver reaksjon å flytte det til en frisk 1,5 ml skrukork mikrosentrifugerør.
- Legge til et likt volum av kloroform til hver av de dekanterte reaksjoner. Vortex prøvene for 30 sek.
- Spinn mRNA i 5 minutter, 14 000 xg, 4 ° C
- Pipette toppen vandige laget fra hver reaksjon flytte det til en frisk 1,5 ml skrukork mikrosentrifugerør.
- Legge til et likt volum av isopropanol til hver av reaksjonene, og utfelling av mRNA ved -80 ° C i 30 min.
- Spinn hver av reaksjonene i 15 min ved 14 000 xg, 4 ° C for å pelletere mRNA
- Fjern supernatanten tar seg ikke å forstyrre pelletert mRNA
- Tilsett 200 ul 70% etanol til hver av reaksjonene, bland reaksjonene og deretter spinner i 10 minutter ved 14 000 xg, 4 ° C.
- Fjern etanolen tar seg ikke å forstyrre mRNA, tørk pellet ved romtemperatur ved hjelp av en vakuumeksikator eller speed-vac.
- Re-suspendere mRNA i 10-20 mL av molekylær grade vann. Spinne kort og holde prøvene på is. Merk: Varme prøven til 80 ° C i 1 min kan hjelpe den oppløses.
- Kjør 1 ul av mRNA på en 2% agarosegel (TAE), og analysere 1,2 pl på et spektrofotometer for å få en nøyaktig avlesning av konsentrasjonen.
Kritisk trinn: en konsentrasjon på 400 ng / mL av syntetisk mRNA er nødvendig for å utføre de følgende forsøk.
KRITISK TRINN: Hvis 260/280 forholdet erutenfor området 2,00-2,20, eller den totale mengden av mRNA stiger 12 mikrogram, gjennomføre en lithiumklorid nedbør. - Lagres mRNA i 1 mL alikvoter ved -80 ° C. Bruk porsjoner og deretter kaste bort; ikke fryses mRNA.
4. Generere Xenopus laevis Embryoet
- Prime Xenopus laevis hunner ved subkutan injeksjon med 50 enheter av humant choriongonadotropin hormon (HCG, Chorulon) en uke før forsøket.
- Xenopus laevis indusere hunner natten før forsøket ved å injisere 250 enheter av HCG og inkubere dem i mørket, O / N ved 19 ° C.
- Dissekere ut testiklene fra avlivet hann frosk og butikk i 1xNAM ved 4 ° C. Merk: Mann frosken er avlivet av terminal anestesi i samsvar med Vedlegg 1 of Animals (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
- Massasje kvinnelige Xenopus laevis å indusere eggløsning, samle laid egg i en mm diameter 55 runde petriskål.
- Lag en sperm suspensjon ved å knuse ¼ av en Xenopus laevis testis i 1 ml avionisert vann.
- Brush Xenopus oocytter med knust sperm suspensjonen med en Pasteur pipette og pipette pære KRITISK STEP. Utfør befruktning reaksjoner på ca 04:30 på dagen for forsøket.
- Kultur embryoer ved 21 ° C i NAM / 10 (se tabell 3 for oppløsninger) i 55 mm petriskåler belagt med 1% agarose fortynnet i vann (vann).
- De-gelé embryoer etter 45 min ved anvendelse av cystein / HCL (tabell 3). Merk: Ved 21 ° C, blir embryoene nå to celle trinn etter 90 min og hver spalte 20 min etter at.
5. Microinjecting Xenopus Embryoet
- Ved hjelp av en X 90mm glasskapillærer og en Narishige PC-10 dual-stage glass mikropipette avtrekker, trekke mikropipetter for injeksjoner. Juster innstillinger empirisk å oppnå en fin spiss (mindre enn én mikrometer Diameter).
- Fest en mikropipette (p) til en gass microinjector (for eksempel, Harvard Appartaus PLI-100 PICO-INJECTOR) til gjentatte ganger å levere presise mengder væske ved påføring av et regulert trykk for et digitalt innstilt tidsperiode. Juster pneumatisk trykk for å gi et volum på 1,25 til 10 nanolitres som bestemt ved hjelp av et trådkors eller kalibrering lysbilde.
- Belegge en 55 mm petriskål med 5 ml av 1% agarose (vann). Skjær et 35-35 mm kvadratet av agarose ut av fatet, vil dette gi et stabilt underlag for å microinject embryoer.
- Overfør embryoene til NAM / 3 + Ficoll (Tabell 3) og flytter til injeksjon fatet.
- Injiser embryoer i dyret halvkulen når de når den ønskede fasen for forsøket.
- For å analysere fordelingen av GFP merkede ligander på celleoverflaten, injiserer embryoene bi-lateralt ved to cellestadiet, 10nl per celle. Eksempel mRNA fortynninger nedenfor for Wnt8a-HA-EGFP. KRITISK STEP: Sørg for at all mRNA konsentrasjoner stkunst på 400 ng / mL.
Bemerk: Mengden av mRNA som skal injiseres må bestemmes empirisk ved testing av konsentrasjoner og å finne den minimale mengde som er nødvendig for å visualisere det fluorescerende ligand. Western blotting ved å bruke et anti-HA-antistoff er et viktig skritt for å bestemme at mRNAer omregnes til tilsvarende nivåer for å tillate sammenligning av to forskjellige fluorescerende merkede ligander; Vi har gjort dette for Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP i Fellgett et al., 2015.
Merk: Når der effekten av et injisert mRNA (slik som en som koder for en kandidat regulator), er en typisk kontroll å injisere et ikke-aktiv RNA, slik som LacZ, inn i søskenembryoer for å kontrollere for eventuelle virkninger av den ytterligere transkripsjoner i embryoet.- Fortynn memRFP mRNA 1 i 4 (1 ul + 3 ul dH 2 O) med molekylært kvalitetsbestemt vann for å redusere konsentrasjonen til 100 ng / mL.
- Fortynne Wnt8a-HA-EGFP mRNA 1 i 4 (1 ul + 3 ul dH2 O) med molekylært kvalitetsbestemt vann for å redusere konsentrasjonen til 100 ng / mL.
- Bland memRFP mRNA i et 1: 1-forhold med Wnt8a-HA-EGFP mRNA.
- Bland mRNA fra 5.5.1.3 i et 1: 1 forhold med enten kontroll mRNA LacZ eller en modulator slik som Sulf1.
- Injisere embryoer bilateralt på to cellestadiet med 10nl av mRNA per celle (totalt 20nl). Merk: Dette resulterer i 250 pg av m em RFP, 250 pg av Wnt8a-HA e GFP, 500 pg av Wnt11b-HA e GFP og 2 ng LacZ eller Sulf1 mRNA blir injisert i hver celle.
- For å analysere diffusjon av GFP merkede ligander, injisere mRNA som koder for ligand-GFP sammen med en linje markør såsom memRFP ved 16-32 cellestadiet, 1,25 nl per celle.
- For å analysere virkningene av en hvilken som helst potensiell modulator av ligand diffusjon, co-injisere mRNA som koder for modulatoren sammen med liganden og avstamning tracer. Alternativt injisere nabocellene: en med mRNA som koder for GFP-merket ligand og en linje tracer (memRFP) og den andre med mRNA som koder for modulatoren og en annen avstamning tracer (memCerulean).
- For å analysere fordelingen av GFP merkede ligander på celleoverflaten, injiserer embryoene bi-lateralt ved to cellestadiet, 10nl per celle. Eksempel mRNA fortynninger nedenfor for Wnt8a-HA-EGFP. KRITISK STEP: Sørg for at all mRNA konsentrasjoner stkunst på 400 ng / mL.
- Overfør embryo til en 12,5 ° C inkubator og kultur til neste dag, Nieuwkoop og Faber (NF) stadium 8.
6. excising Animal Cap eksplantater
- Overfør embryo til en 55 mm petriskåler belagt med 5 ml av 1% agarose (vann). Fyll formen med NAM / 2 (Tabell 3).
- Ta sirkulære dyre caps bruker Wolfram nåler kritisk punkt. Ta store caps på dette stadiet som disse vil gro bedre og være lettere å avbilde, holde kontroll caps for å sikre at ingen konvergent forlengelse oppstår.
- Overfør dyr eksplantater til 55 mm petriskåler belagt med 1% agarose (vann) og kultur embryoer ved 21 ° C i 4 timer kritisk trinn. De 4 timers inkubering er nødvendig for å tillate fluorescerende proteiner til å modnes.
- Generere hjelpe lysbilder ved å stikke ned to lag med PVC insulation teip på objektglass. Skjær en 14 mm med 10 mm rektangel ut av båndet for å forlate et kammer for montering dyre caps kritisk punkt. Flat begge lag med tape grundig inn på lysbildet før du skjærer rektangelet.
- Pipette 2 separate dråper av NAM / 2 (Tabell 3) inn i relieff sklie, ca 30 mL per dråpe.
- Overfør dyre eksplantater til hjelpe lysbilder ved hjelp av et avskåret P20 tips og orientere slik at den apikale siden vender oppover. Merk: Hver side kan holde 10-15 dyr caps kritisk punkt. På dette stadiet dyret caps burde ha delvis helbredet, betyr det at de er mindre delikat og kan tiltes ved hjelp av pinsett.
- Senk et glass dekkglass på avlastnings lysbildet og la dekkglass for å tørke i 20 minutter kritisk trinn: Størrelsen på dyret hetten er avgjørende;. at hetten er stor nok til at når glass dekkglass senkes ned på avlastningsglide den komprimerer den apikale lag av animalsk cap cellene nok til produce et flatt underlag til bilde. Dersom dyret hettene er for liten fremdeles deretter redusere PVC-tape til en lag.
- Tett lysbildet bruker neglelakk kritisk punkt. Ikke bruk for mye neglelakk for å forsegle hjelpe lysbilder fordi hvis PVC tape blir for fuktig det vil heve opp og ødelegge raset.
- Tørre hjelperyttere for 20 minutter i mørket og de er klare til bilde, typisk dyre caps vil forbli sunt for 4-6 timer en gang forseglet i raset.
7. Imaging
Merk: Imaging ble utført ved hjelp av en invertert konfokal mikroskop. Lambda-modus ble valgt for avbildning da dette tillot flere fluoroforer med overlappende signaturer som skal brukes, og fjernet problemet med potensiell prøven bevegelse mellom skanninger.
- Finn explants ved hjelp av en lav forstørrelse objektiv deretter bytte til 63x / 1.4 objektiv olje for Resolution Imaging høyere.
- Slå på nødvendige lasere; for dette eksempel er 405laser ble brukt til å opphisse memCerulean ble 488 laser brukes til å opphisse GFP og 561 laser å opphisse memRFP bruker 405 og 488/561 dichroic speil.
- Bruk lambda-modus (I Zen 2011 velger lambda-modus - 32 binger).
- Velg 405nm, 488nm og 561nm lasers.To tillater et bredere synsfelt, zoome ut bildet (til 0,6x).
- Sett rammestørrelsen til ønsket bildestørrelse (1024 x 1024 med pikselstørrelser på 220nm ble brukt til dette datasettet).
- Satt i snitt til typisk 4 til 8 for å øke signal til støyforhold.
- Optimal pinhole (1 luftig enhet ifølge 561nm laseren ble anvendt for dette datasettet).
- Optimal laser krefter kritisk punkt. Balanser 405nm, 488nm og 561nm lasere slike at alle fluoroforene kan oppdages ved hjelp av 32 detektorgruppen mens minimere mengden av spenning og gevinst nødvendig.
- Samle lyset som slippes ut fra memCerulean, GFP og memRFP. For dette arbeidet lyset ble samlet inn hver ~10nm fra 415-720nm, men større samling intervaller er også mulig (f.eks., Hver ~ 20 nm).
8. Bildeanalyse
- Å undersøke effekten av modulatorene på celleoverflate-ekspresjon av GFP-merket ligander
MERK: Følgende trinn er en detaljert guide for hvordan analysen ble utført i vårt laboratorium. Sluttbrukeren kan være lurt å effektivisere prosessen ved å skrive en ImageJ eller FIJI skript for å fjerne noen av de manuelle trinn.
Kritisk trinn: Det er viktig at sluttbrukeren prøvene spektra av eventuelle fluoroforer som brukes i de samme forhold som det endelige eksperiment utført for å perf orm effektive spektrale unmixing av de flere fluoroforer som brukes i det endelige eksperiment.
To hovedtyper av analyser er utført i denne seksjonen:- Beregning av totale antall Wnt-HA-EGFP piksler ko-lokalisering med cellemembranen.
- Unmix det grønne,røde og Cerulean kanaler ved hjelp av spek samplet fra enkle injeksjoner av disse fluoroforene i ZEN programvare. Lagre disse bildene som separate LSM dokumenter til bruk i alle de følgende trinnene.
- Åpne LSM-filer direkte i bilderedigeringsprogrammet. Merk: Følgende instruksjoner er for FIJI Bilde J.
- Redd LSM bildene som bildesekvens dokumenter, vil dette automatisk delt bildene inn i separate kanaler.
- Lagre bildet sekvens i samme mappe som de skript for skriptet analyse programvare som vil bli brukt til å analysere dataene (se supplerende kodefiler for selve script). Merk: Følgende instruksjoner er for Matlab.
- Åpne opp script analyse programvare og åpne katalogen som skriptene er skrevet.
- Angi filnavnet under Plassering analyse, vil programvaren ta filnavnet og utføre analysen.
Merk: filnavnene vil lese ImageA0000 og ImageA0001 for hver image. Skriptet analyse programvare vil bruke bildet merket 0001 som masken og analysere andelen av piksler i bilde 0000 som co-lokalisere med denne masken. - Ta prosent samlokalisering nummer (kommentert som Cell membran befolket) og kopiere denne til et regneark. Merk: Følgende instruksjoner er for Excel.
- Plotte prosent samlokalisering nummer på et stolpediagram enten som en absolutt eller relativ verdi.
- Analyse av antall, størrelse og form av Wnt-HA-EGFP puncta.
- Åpne ublandet LSM-filer direkte i bilderedigeringsprogrammet. MERK: Følgende instruksjoner er for FIJI Bilde J.
- Splitte hvert bilde i sine separate kanaler (Bilde> Farger> Split kanaler).
- Terskel både Wnt-HA-EGFP og membran markør kanaler (Bilde> Adjust> Auto-terskel) kritisk punkt. Prøv en rekke terskler for å se hvilken som gir et representativt bilde, uten å overeksponerekanalen.
- Konverter membranen markør kanal til en maske (Process> Binary> Gjør maske).
- Invertere denne masken (Edit> Invert).
- Konvertere Wnt-HA-EGFP puncta til en maske som ovenfor.
- Trekk membranen markør maske fra liganden-GFP maske (Process> Bilde kalkulator> Wnt maske i top-boks, membran maske i nederste boksen).
- Bruk analysere partikkel funksjonen. Herfra velge de nødvendige parameterne og analysere data (Analyse> Analyse partikler).
- Kopier antall partikler, gjennomsnittlig partikkelstørrelse og sirkulariteten data til et regneark, og deretter plotte grafer fra disse dataene. Merk: For denne analysen, partikler bare mellom 0.1-10μm 2 størrelse ble analysert, ble ingen begrensninger plassert på partikkel circularity. Denne instruksjonen er for Excel.
- Beregning av totale antall Wnt-HA-EGFP piksler ko-lokalisering med cellemembranen.
- Analyse omfanget av ligand diffusjon
- Åpne opp alle ublandede bilder i konfokalmikroskoper imaldring programvare og deretter eksportere filer i en TIF-format, som rådata og som et RGB-bilde Merk:.. Denne undervisningen er for Zen lite 2011 KRITISK STEP: Inkluder en skala bar på minst ett av bildene, slik at avstanden kan være beregnet under analysen.
- Åpne bilder som skal analyseres i bildeanalyse programvare. Merk: Følgende instruksjoner er for Photoshop 8.2.3) Høyreklikk på bakgrunnen av bildet og velg "lag fra bakgrunnen", for å skape et nytt lag..
- Still membran markør kanaler til 0, slik at bare den ligand-GFP kanalen er synlig (Layer> New justeringslag> Channel mixer) kritisk punkt. Clip den nye justeringslag til bildet blir analysert, muligheten klippet det nye laget til dette bildet er tilgjengelig som et kryss etter å ha klikket på kanalen mikser alternativet.
- Åpne en ny arbeidsplass. Sett oppløsningen til 300 piksler per tomme og fargemodus til RGB fargerom (File>Ny> utklippstavlen).
- Kopiere alle bildene som blir analysert i den ene arbeidsområdet (Klikk på bildet, og det er klippet kanals mikser ved å holde kontroll så hold kontroll og Alt og dra bildet inn i arbeidsområdet).
- Orientere alle bildene, slik at den maksimale lengden av diffusjon for hvert bilde kan måles langs den horisontale akse, og cellene som uttrykker Wnt-HA-EGFP orientert til venstre.
- Lagre arbeidsplass som en TIF og åpne dette i bildeanalyse programvare. Merk: Følgende instruksjoner er for FIJI Bilde J.
- Åpne ROI leder vindu (Analyse> Verktøy> ROI manager).
- Tegn et rektangel på det første bildet, kan den eksakte størrelsen på rektangelet spesifiseres (Velg rektangel verktøyet og trekke noen rektangel> Rediger> Valg> Angi). Merk: En størrelse på 650 x 100 piksler, lengde x bredde ble brukt i denne studien.
- Plasser rektangel i utkanten av domenet uttrykke Wnt-HA-EGFP. Plasser rektangel over regionen med maksimal avstand på Wnt-HA-EGFP diffusjon. KRITISK STEP: Selv uten membran markør regionene uttrykker Wnt-HA e GFP skal være synlig på grunn av bakgrunnen fluorescens; hvis ikke så ta kontakt med RAW-bilder.
- Shift boksen 10 mikrometer til høyre. Bestem antall mikrometer ved å måle lengden av skalaen bar inngår i ett av bildene (Tegn en linje sporing målestokken> Analyse> set skala). Merk: Dette gir en verdi for 10 um i piksler.
- Legg boksen til ROI leder ved å trykke på knappen Legg ROI leder vinduet.
- Flytt rektangel til neste bilde som skal måles ved å klikke tilbake på rektangel verktøyet for å flytte rektangelet. Gjenta trinn 8.2.10-11.
- Når alle panelene har blitt målt, velger multiplot fra menyen ROI manager (ROI Behandling> Mer> Multiplot> List).
Merk: dataene representerer Wnt pixel intensity (Y) med økende avstand langs den horisontale aksen (X, målt i piksler). Verdien for y er den gjennomsnittlige signalintensiteten av ligand-GFP ved punktet X og gjennomsnittet beregnes fra alle pikslene i Y-aksen for hver X-verdi. Følgelig høyere boksen, jo flere piksler bli analysert for å produsere dette gjennomsnittet. En liten boks (i Y-aksen) vil være mer utsatt for støy; en høy boks vil ha svært lav gjennomsnittlig piksel intensitet. - Kopiere data fra multiplot boksen inn i et regneark og re-label tilsvarende. Merk: Følgende instruksjoner er for Excel.
- Kast den første 10-20μm av data fra hver analyse som dette representerer bakgrunnsfluorescens fra ligand-GFP uttrykkende celler og forvrenger grafene.
- Åpne opp vitenskapelig analyse og grafer programvare og opprette en ny bærbar PC. Merk: Følgende instruksjoner er for Sigmaplot 13.
- Merke det nødvendige antall kolonner for data ved å dobbeltklikke på de horisontale tall on regnearket og merke dem avstand i mikrometer, Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP.
- Kopiere data fra regneark i de aktuelle kolonnene i vitenskapelig analyse og grafer programvare.
- Lag en punktdiagram (lage grafen> Scatter> Multiple scatter> Velg X mange Y> Velg avstanden kolonnen for X> Velg Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP for Y-verdier> Fullfør).
- Utføre regresjonsanalyse på Wnt8a-HA-EGFP kurve ved å venstreklikke på en Wnt8a-HA-EGFP punkt på punktdiagram. Alle de punktene bør markere. Klikk på Analyse> Regression veiviseren.
- Velg kurven ligningen kategori (eksponentiell) og ligningen navn (Singel, tre parameter) og trykk deretter neste.
- Velg X- og Y-verdiene som kurven skal monteres (hvis dataene ble understreket tidligere, bør dette gjøres automatisk) og trykk deretter neste.
- Fortsett gjennom veiviseren til Numeric Output alternativets side, sikre Opprett rapport er krysset deretter trykker neste. Merk: Parametrene for utstyrt kurven vil bli vist i rapport 1 *.
- På grafen alternativer siden sikre 'legge ligningen til grafen tittelen "er krysset deretter trykker finish. Merk: Veiviseren har opprettet rapport 1 * og Graf 1 * faner øverst i notatboken. I tillegg kurven skal ha blitt lagt til grafen produsert i (8.2.20).
- Gjenta trinn 8.2.21-8.2.25 å passe en kurve for Wnt11b-HA-EGFP kritisk punkt. Prøv sittende flere liknings kategorier og liknings navnene til dataene. Merk: Kurven med best mulig passform skal produsere den høyeste R2 verdi med lavest restsummen av kvadrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Confocal analyse av dyr cap eksplantater uttrykker fluorescently tagget proteiner gir et effektivt system for å visualisere ligand distribusjon under ulike eksperimentelle forhold. I et eksempel på fordelingen av GFP merket Shh er vist (figur 1). Ved to-celle-stadiet, blir Xenopus embryoer injisert i begge celler med enten med en kontroll mRNA eller mRNA som koder for Sulf1, et enzym som endrer celleoverflate heparansulfat og påvirker Shh morphogen gradient 16. Disse embryoer blir dyrket fram til 32-cellestadiet og en enkelt celle er co-injisert med mRNA som koder for Shh-GFP og memRFP (som en avstamning tracer). Dette skaper en klone av celler som uttrykker Hysj-GFP som er merket med cellemembranen tethered RFP. På blastula trinnet, blir dyr cap eksplantater tatt for analyse ved konfokal mikroskopi. Figur 1 viser at under kontrollbetingelser, er Shh-GFP utskilt og diffunderer utsiden av region uttrykker de injiserte mRNA. Men i nærvær av Sulf1, er Shh-GFP mer begrenset i sin distribusjon og, i denne prøven, ikke blir oppdaget utenfor klone av celler som produserer den. Effektene av Sulf1 på Shh-GFP distribusjon har blitt analysert nærmere 16.
Når uttrykt i Xenopus embryoer, fluorescensmerket WNT ligander utskilles, oppsamles på cellemembranen, og diffundere på tvers av feltet av celler. I figur 2 ser vi karakterisere quantitaive og kvalitative egenskaper ved de to forskjellige fluorecently merket WNT ligander i celler injisert og uttrykking av proteinene. Figur 2A-H viser eksempler på hvordan Wnt8a og Wnt11b-HA-EGFP samle seg på membranen av animalsk cap cellene . Ved å sammenligne paneler 2B og 2F er det klart at Wnt8a-HA-EGFP akkumulerer mer effektivt på cellemembranen enn Wnt11b-HA-EGFP. Kvantitativ informasjon er blitt hentet fra konfokale bilder ved hjelp av en combinasjon av bilde og script analyseprogramvare (tilleggskode-fil). Figur 2I viser den relative akkumulering av Wnt8a-HA-EGFP på cellemembranen i forhold til Wnt11b-HA-EGFP. Dataene ble oppnådd ved anvendelse av en datamaskin skript som bestemmer det totale antall Wnt-HA-EGFP piksler ko-lokalisering med cellemembran pikslene i hvert bilde. I en annen tilnærming, er det totale antallet Wnt-HA-EGFP puncta som co-lokalisere med cellemembranen telt ved bruk av programvare for bildeanalyse (figur 2J). Kvalitativ informasjon om størrelsen og formen av individuelle puncta kan også være hentet fra data ved hjelp av bildeanalyse-programvare. I tillegg til færre Wnt11b-HA-EGFP puncta co-lokalisering med cellemembranen (figur 2J) disse puncta har også en mindre gjennomsnittsstørrelse enn Wnt8a-HA-EGFP puncta (figur 2K). Videre Wnt11b-HA-EGFP puncta ha en redusert circularity forhold til Wnt8a-HA-EGFP puncta (figur 2L). Circularity er et mål på hvor nær en gjenstand som ligner en perfekt sirkel, med en som representerer en perfekt sirkel, og 0.1 en langstrakt ikke-sirkulær form. Denne tilnærmingen kan brukes til å teste noen kandidat regulator av Wnt ligand diffusjon. For å gjøre dette, bør kontrollceller injiseres med en kontroll mRNA som koder for en inaktiv form av kandidatens regulator eller en irrelevant protein som beta-galaktosidase (lacZ); Dette gir en mer gyldig kontroll enn rett og slett ikke å injisere regulator. Data i disse eksempler ble analysert ved hjelp av ikke-parametrisk test Mann-Whitney U 18-19. En statistisk analyse program ble anvendt for å utføre testen.
I figur 3, undersøker vi Wnt ligand diffusjon. En enkelt blastomere ble injisert i 4-cellestadiet, slik at dyret cap eksplantater representerer et felt av celler der bare noen celler uttrykker enten Wnt8a-HA-EGFP eller Wnt11b-HA-EGFP. Ved å inkludere en celle avstamning tracer, kan vi identifisere EXPREssing versus ikke-uttrykke celler og dette gjør området Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP ligand diffusjon bort fra kildecellene som skal analyseres (figur 3B og 3C). På grunn av krumningen av de dyr cap eksplantater, den maksimale avstand som kan måles pålitelig ved hjelp av denne analysen var 160μm, som ikke var nok til å måle den absolutte avstanden av ligand diffusjon. Men ved hjelp av en kombinasjon av konfokalt analyse, bildeanalyse og vitenskapelig analyse og grafer programvare den generelle formen på Wnt-HA-EGFP morphogen gradient kunne analyseres (Figur 3D). Denne informasjonen kan brukes til å undersøke hvorvidt overekspresjon et annet protein, sammen med de merkede ligandene i de samme cellene kan påvirke Wnt sekresjon eller diffusjon. I en annen type eksperiment (figur 3E-3J) virkningene av en potensiell regulator i mottakerceller kan måles ved å overuttrykke kandidaten proteinet i kloner av celler ved siden av celler extrykke Wnt8a eller Wnt11b-HA-EGFP. Dette gjør at alle ikke-celle-autonome virkninger av regulatoren på Wnt-HA-EGFP diffusjon ligand som skal undersøkes. I samsvar med figur 2, kan mer Wnt8a-HA-EGFP oppdages spre bort fra celler enn Wnt11b-HA-EGFP i begge diffusjon eksperimenter.
De typer eksperimenter som er beskrevet i denne artikkelen har blitt brukt til å analysere effekten av Sulf1 på Shh og Wnt signale 16,17.
Figur 1. Modulering av Shh-GFP fordeling kan påvises ved konfokal analyse av Xenopus animal caps. (A) En tegneserie som viser eksperimentelt assay hvor embryoer blir først injisert med mRNA som koder for Sulf1 eller en kontroll mRNA, de samme embryoer er senere injiseres ved 32-cellestadiet med mRNA som koder for Shh-GFP til en enkelt celle. (BC) Animal cap eksplantats ble tatt ved trinn 8 og avbildes etter 4 timer. Bildene vises på kanten av en Shh-GFP + memRFP uttrykke klone av celler. I kontroll embryoer (B), er Shh-GFP fordelt bort fra memRFP merket klon av signalproduserende celler. I embryoer uttrykker Sulf1 (C), er Shh-GFP mer begrenset i sin distribusjon, se 16. memRFP vises i magenta og Shh-GFP i grønt. Skala barer representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kvantitativ og kvalitativ analyse av Wnt8a og Wnt11b-HA-EGFP puncta på cellemembranen. (AH) Embryoer ble mikroinjisert bi-lateralt med mRNA som koder for memRFP (500 pg) i dyret halvkule på to cellestadiet. I tillegg embryoer ble injisert med mR NA koding (AD) Wnt8a-HA-EGFP (500 pg) eller [EH] Wnt11b-HA-EGFP (1NG). Embryoene ble også injisert med mRNA som koder for LacZ for å tilveiebringe en kontroll for ytterligere mRNA / protein ved analyse av virkningene av eventuelle regulator. De hvite bokser i (C) og (G) markerer områdene forstørret i paneler (D) og (H) hhv. Den totale mengde Wnt-HA-EGFP fluorescens ko-lokaliserende med cellemembranen ble beregnet ved bruk av bildeanalyse og script programvare og deretter normalisert (I). Kvalitativ informasjon ble hentet ved hjelp av bildeanalyse programvare. Wnt8a og Wnt11b-HA-EGFP punctae ble analysert for partikkeltall (J), partikkelstørrelse (K) og partikkel sirkularitet (L). Mann-Whitney U (** P <0,01), N = antall embryoer. memRFP vises i magenta, og Wnt8a / 11b-HA-GFP er vist i grønt, skala barer representerer 20 pm.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Måle området spredning av fluorescently tagget Wnt ligander. (A) Diagram som viser analysen anvendes for å måle Wnt8a og Wnt11b-HA-EGFP-sekresjon og diffusjon bort fra uttrykkende celler. (BC) mRNA som koder for (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 nanogram) og Wnt8a-HA-EGFP (2NG) eller (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 nanogram) og Wnt11b-HA-EGFP (2 ng ) ble injisert i dyret halvkule av en blastomere på fire cellestadiet. (D) Området for diffusjon av Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP ble målt gjennom en kontroll bakgrunn. (E) Diagram som viser den test som benyttes å måle Wnt8a og Wnt11b-HA-EGFP diffusjon gjennom en bakgrunn uttrykker LacZ, se metode for Fondet feiler. (FG) mRNA som koder for memCerulean (600 pg) og (F og H) Wnt8a-HA-EGFP (2 ng) eller (G og I) Wnt11b-HA-EGFP ble injisert i dyret halvkule av en blastomere på fire cellestadiet. En tilstøtende blastomere ble injisert med mRNA som koder memRFP (600 pg) og LacZ (4 ng) se Key for detaljer. (J) Utvalget av Wnt8a-HA-EGFP og Wnt11b-HA-EGFP diffusjon ble målt gjennom en bakgrunn uttrykker LacZ. Dataene ble kvantifisert og plottet ved hjelp konfokalt analyse, bildeanalyse og vitenskapelig analyse og grafer programvare. memCerulean (blå (CD) og Gul (F og H)), Wnt-HA-EGFP (grønn), memRFP (magenta), skala barer representerer 20 mikrometer. Klikk her for å laste ned en større versjon av denne filen.
filer / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>
Tabell 1. Grunning brukes til subklone Wnt8a / Wnt11b-HA-EGFP og Shh-GFP inn pCS2.
| Reaksjon | Komponenter | |
| Eksempel CS2 + digest | 1,5 mikrogram pCS2 + | |
| 2 mL av begrensning enzym 1 | ||
| 2 mL av Restriction enzym 2 | ||
| 5 pl restriksjonsenzym-buffer (10X) | ||
| Gjort opp til 50 ml med molekylær grade vann | ||
| Eksempel mRNA-syntese | 2 pl linealisert mal | |
| 2 ul 10x Megascript trx mix | ||
| 2 pl 50 mM ATP | ||
| 2 ul 50 mM CTP | ||
| 2 ul 50 mM UTP | ||
| 2 pl 5mM GTP | ||
| 2,5 ul 40 mM Cap Analog (m7G (5 ') | ||
| 2 ul SP6 enzym mix | ||
| 3,5 mL Molecular grade vann | ||
| Eksempel PCR-reaksjon | 0,5 ul HiFi-DNA-polymerase (2000 enheter / ml) | |
| 2 ng Mal DNA | ||
| 2,5 mL av forover og bakover primere (10 nm) | ||
| 0.5ul dNTPs | ||
| 5 ul DNA ploymerase buffer (10X) | ||
| Gjort opp til 50 ml med molekylær grade vann | ||
| Eksempel PCR-betingelser | Innledende denaturering 2 min ved 98 ° C | |
| 15 sek 98 ° C | ||
| 15 sek 65 ° C | 30 sykluser | |
| 40 sek 72 ° C | ||
| Endelig ekstensjon 10 minutter ved 72 ° C | ||
| Eksempel PCR produkt digest | 28 mL av PCR-produkt | |
| 2 mL av Restriction enzyme 1 | ||
| 2 mL av Restriction enzym 2 | ||
| 5 pl restriksjonsenzym-buffer (10X) | ||
| 13 mL Molecular grade vann | ||
| Eksempel T4 ligation | 1 ul Cut CS2 + | |
| 3 pl Cut PCR produktet 1 | ||
| 3 pl Cut PCR produkt 2 | ||
| 1 pl av T4 DNA-ligase | ||
| 1 pl T4 DNA-ligase-buffer (10X) | ||
| 1 ul Molecular grade vann | ||
| Eksempel mal fordøye | 5 ug Plasmid DNA | |
| 10 ul Restriksjonsenzym-buffer (10X) | ||
| 3 pl Not1 (unntatt Hysj-GFP, Kpn1 brukes) | ||
| Opp til 100 ml med molekylær grade vann |
Tabell 2. Eksempel reaksjonsbetingelser anvendt for subkloning og produsere syntetisk mRNA for Wnt8a-HA-EGFP.
| Løsning | Komponenter |
| Cystein-HCL | 0,1X NAM |
| 2,5% L-cystein-hydroklorid-monohydrat (pH 7,8) | |
| NAM salter | 110 mM NaCl |
| 2 mM KCl | |
| 1 mM CA (NO3) 2 | |
| 0,1 mM EDTA | |
| NAM / 2 | 0.5x NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mm Bicarbonate | |
| 25 pg / ml Gentamycin | |
| NAM / 3 + Ficoll | 0.33X NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mm Bicarbonate | |
| 2 5 ug / ml Gentamycin | |
| 5% Ficoll | |
| NAM / 10 | 0,1X NAM salter |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 25 pg / ml Gentamycin |
Tabell 3. Solutions brukt under produksjon og mikroinjeksjon av Xenopus laevis embryoer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En vesentlig del av denne protokollen er å generere biologisk aktive ligander som er normalt bearbeides, utskilte, og i stand til å fremkalle en reaksjon i mottakercellen, til tross for at en fluoriserende gruppe er festet. Det er viktig å fastslå at det fluorescens-merket genprodukt er biologisk aktivt ved hjelp av et passende assay. For Hysj-GFP, ble muligheten til å aktivere uttrykk for PTC1 bekreftet 16. Wnt8a har en bemerkelsesverdig potent evne til å indusere en sekundær akse når de uttrykkes i en enkelt ventral blastomere 20-21, og Wnt8a-HA-EGFP ble vist å beholde denne biologiske aktivitet. Wnt11b hemmer aktivin behandlet ectodermal eksplantater fra omgår konvergent forlengelse 21-22, og Wnt11b-HA-EGFP beholder også sin biologiske aktivitet 17. Evnen til de merkede ligander for å fremkalle reaksjoner tilsvarende de umerkede proteiner antyder at konklusjonene basert på eksperimenter ved hjelp av fluorescerende ligander vil be er relevante for det normale proteinet. Tilsetningen av HA-epitop mellom liganden og den fluorescerende protein gitt en avstandsområdet som tillater Wnt konstruerer å være både aktive og fluorescerende.
Den store begrensning av denne typen analyse er at den ikke direkte informere om endogene morphogen stigninger. For eksempel, kan diffusjonen av Shh over feltet av celler i dyr hetten ikke gjenspeiler hvordan endogene shh beveger seg gjennom det spalte nevrale epitelet i embryo. Imidlertid enkelhet av denne protokollen tillater forsøk hvor effekten av eksogene regulatorer på fordelingen av ligander kan testes. Resultatene fra disse metodene kan danne grunnlag for hypoteser som skal prøves ved hjelp av mer krevende in vivo-analyser. For eksempel, evnen til over-uttrykt Sulf1 å begrense fordelingen av Shh-GFP anvendelse av metodene beskrevet i dette dokumentet pekt på muligheten for Sulf1 i modulere Shh morphogen gradient. Dette ble direkte testet og validert ved hjelp av anti morfolino- knock-down av Sulf1 og immunocytokjemi å visual endogen Shh i nevralrøret 16. En lignende metode for å våres har blitt brukt for å undersøke bestemte mekanismer som kunne regulere ligand diffusjon. Smith og medarbeidere viste at en GFP-merket nodal (Xnr2) anvendt enkel diffusjon, og ikke celle utvidelser (cytonemes) eller transcytose (ved hjelp av vesikler) for å danne en gradient 23.
Ytterligere elaborations av disse fremgangsmåter er mulige hvor andre proteiner som blokkerer bestemte reaksjonsveier kan uttrykkes i målrettede celler for å undersøke hvorvidt en reaksjon på signalmolekyl er nødvendig som et mellomledd for å videresende signaler fra en celle til en annen. For eksempel, uttrykker en dominant negativ activin reseptor mellom kilden activin og de svarer celler viste at enkle ligand diffusjon kunne framprovosere en reaksjon flere celle diametre unna kilden even med ikke-responsive celler i mellom 24. Denne konklusjonen ble støttet av arbeidet i sebrafisk hvor villtype-celler kan reagere med en kilde for nodal, til tross for å være omgitt av ikke-reagerende mutante celler som mangler en viktig ko-reseptor for nodal 25. Andre studier har brukt sebrafisk for å undersøke spredningen av fluorescently merkede ligander 28,29. Noen studier har observert at epitop merking den C-terminale ende av WNT proteiner kan påvirke signaleringsaktivitet, muligens på grunn av den svært konserverte cysteiner som bidrar til protein conformation. Vårt tidligere arbeid har vist at inkludering av et avstandsstykke (slik som HA-tag) resulterer i kodet WNT ligander som er biologisk aktive 17. Dette er sannsynligvis fordi avstandsstykket gir en fleksibilitet som er nødvendig for ligand-reseptor-interaksjon, slik som i tommel-pekefinger modell av Wnt-Frz binding 30.
Det neste trinnet for fremføring våre studier er å inkludere en visual avlesning for aktivering av signalveien. For eksempel uttrykker GFP-merket Dvl 26 i celler fjernt fra kilden for liganden vil tillate periode i hvilken Wnt11b har evne til signalet som skal måles. Utvalget av Wnt8a signale aktivitet kan bli vist ved hjelp av antistoff-farging for å måle kjerne lokalisering av b-catenin i celler 27 i en avstand fra kilden. Slike forsøk er mulig ved hjelp av teknikkene som beskrives i dette dokumentet. Ved å anvende en rekke forskjellige fluorescerende proteiner eller fluoroforer, vil et ekstra nivå av informasjon gis der man ikke bare måler fordelingen av en ligand, men også produksjonen av signalveier, og på denne måte å bestemme terskelområdet av en morphogen .
Xenopus laevis er en nyttig modell for å visualisere GFP-merket ligander og ytterligere detaljer om metodene for oppdrags embryoer, mRNA-syntese, mikroinjeksjon og dissekereion er tilgjengelige 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av en BBSRC innrømme MEP (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvote studieplass til SAR, og en MRC studieplass til SWF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Free download http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer - M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | homemade | ||
| Zen lite software | Carl Zeiss | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
