Summary
Manuskriptet her giver et simpelt sæt af metoder til analyse sekretion og udbredelse af fluorescens mærkede ligander i Xenopus. Dette giver en kontekst for at afprøve, om andre proteiner for at modificere ligand distribution og tillade eksperimenter, der kan give indsigt i mekanismer, der regulerer morfogen gradienter.
Abstract
Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at visualisere ligander fordelt på et felt af celler. Den lethed at udtrykke eksogene proteiner, sammen med den store størrelse af deres celler i tidlige embryoner, gør Xenopus laevis en nyttig model til at visualisere GFP-mærkede ligander. Syntetiske mRNA'er translateres effektivt efter injektion i det tidlige stadie Xenopus embryoner og injektioner kan målrettes til en enkelt celle. Når det kombineres med en slægt sporstof såsom membran tøjret RFP, kan den injicerede celle (og dens efterkommere), der producerer det overudtrykte protein let følges. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til fremstilling af fluorescens mærkede Wnt og Shh-ligander fra injiceret mRNA. Metoderne involverer miCRO dissektion af ektodermale eksplantater (animalsk hætter) og analyse af ligand diffusion i flere prøver. Ved at anvende konfokal billeddannelse, kan information om ligand sekretion og diffusion over et felt af celler opnås. Statistiske analyser af konfokal billeder giver kvantitative data om formen af ligand gradienter. Disse metoder kan være nyttige for forskere, der ønsker at afprøve virkningerne af faktorer, der kan regulere formen af morfogen gradienter.
Introduction
I den tidlige fosterudvikling celler gradvist forpligtet til at følge specifikke slægter af differentiering: det betyder en gruppe af totipotent (eller pluripotente) celler bliver gradvist begrænset til oprettelse populationer af stamceller bestemt at give anledning til én celletype. Celle-celle signalering er central for reguleringen af afstamning specifikation under fosterudviklingen. Manipulation af disse signaler vil være forpligtet til at lede stamceller mod bestemte skæbner til at støtte nye medicinske behandlinger.
Et forholdsvis lille antal signalveje er gentaget under udvikling, herunder veje reagerer på TGF overfamilien (nodals og BMP'er) 1-2, FGF'er 3, Wnts 4, og pindsvin 5. Disse secernerede proteiner binder receptorer til stede på cellemembranen for at aktivere signaltransduktion derved ændrer genekspression og / eller celle adfærd. Den stramme regulering af celle tegnAlling er afgørende for cellelinie specifikation og normal udvikling. Mens krydstale blandt disse veje er vigtig ved bestemmelse celleskæbnen, kan en enkelt ligand selv fremkalde distinkte reaktioner ved forskellige koncentrationer. Morfogen gradienter blev beskrevet over 100 år siden som en teori til at forklare, hvordan forskellige celletyper kan stamme fra et felt af celler 6. Signalering molekyler produceres af en gruppe af celler kan diffundere over et bestemt interval, faldende koncentrationen med en større afstand fra kilden. Celler udsat for signalet vil reagere på den lokale koncentration på deres position inden for celler, med celler ved forskellige positioner reagerer forskelligt på forskellige niveauer af signalet. Beviser for eksistensen af morfogener kommer fra studier af det tidlige embryo Drosophila 7 og vingen skiven 8, samt hvirveldyr lemmer 9 og neuralrøret 10.
Fremgangsmåder er nødvendige ivestigate hvordan morfogen gradienter er etableret, og at identificere andre molekyler vigtige i reguleringen af disse stigninger. Elegante eksperimenter under anvendelse af immunhistokemi at visualisere endogene proteiner in vivo i forbindelse med forskellige genetiske baggrunde er blevet anvendt til at undersøge morfogen gradienter 11-12. Men gode antistoffer og specifikke mutanter er ikke altid tilgængelige, så vi beskriver her en protokol ved hjælp af overekspression af fluorescerende ligander i Xenopus, at tilvejebringe en alternativ, enkel metode til at dissekere hvordan eksogene genprodukter kan påvirke fordelingen af ligander over en mark af celler. Xenopus laevis giver en fremragende system til at foretage disse typer af eksperimenter som deres embryoner udvikler eksternt, så de er tilgængelige på de tidligste stadier. Deres store størrelse (1-1.5mm i diameter) forenkler mikroinjektion og kirurgisk manipulation og blastulaen stadier cellerne er nemme at billedet som stadig er forholdsvis store (ca. 2081 m på tværs). Overekspression studier i Xenopus er enkle at gøre: mRNA indsprøjtes i den tidlige embryo kan målrettes til specifikke celler og er translateres effektivt.
De fluorescerende mærkede Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP konstruktioner blev frembragt under anvendelse pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 og eGFP. HA-peptid er vigtigt at inkludere, ikke kun for at tilvejebringe en yderligere molekylemærkning, men også fordi det menes at fungere som en spacer adskille Wnt og eGFP proteiner tillader både genprodukter til at fungere. Konstruktionen anvendes til visualisering af Shh er tidligere blevet anvendt til at danne en transgen mus som udtrykker et Shh-eGFP fusionsprotein 15; dette blev venligst stillet til rådighed af Andy McMahon. Det er vigtigt, er GFP tag for alle konstruktioner klonet 3 'for signalsekvensen, således at den fastholdes efter forarbejdning. Det er også vigtigt at sikre, at den endelige protein indeholder sekvenser, der kræves for modifikationer, såsom den Ydn af lipider som det er tilfældet for Shh og Wnt ligands.The cDNA'er blev subklonet ind i pCS2 + ekspressionsvektor, som er optimeret til brugsdyr af syntetisk mRNA; det indeholder en SP6-promotor og polyadenyleringssignal (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).
Den her beskrevne arbejde giver en enkel protokol til at sammenligne sekretion og diffusion af fluorescens-mærkede Wnt og Shh mærkede ligander. Ved at injicere definerede mængder af syntetisk mRNA, protokollen circumnavigates problemer forbundet med variabel ekspression fra forskellige vektorer under anvendelse af forskellige promotorer. Disse metoder er for nylig blevet anvendt til at undersøge virkningerne af den heparansulfat endosulfatase Sulf1 på Shh-eGFP og Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP sekretion og diffusion i Xenopus 16-17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Dyreforsøg blev udført under en britiske indenrigsministerium licens til MEP og forsøgene udført blev godkendt af University of York etiske komité i overensstemmelse med ankommer (Animal Research: Indberetning af in vivo forsøg) retningslinjer. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).
1. Strategi at generere Fluorescerende Tagged ligander
Nedenfor er et eksempel protokol til subkloning Wnt8a-HA og eGFP ind pCS2, for at producere den i ramme fusion konstruere Wnta-HA-eGFP:
- Etablere og drive PCR reaktioner for Wnt8a-HA og eGFP. Brug primer oplysninger, der vises i Tabel 1 og eksempel PCR-reaktionen og eksempel PCR-betingelser, der vises i tabel 2. Bemærk: Template DNA vil variere afhængigt af konstruktionen, der fremstilles i dette eksempel, er Wnt8a-HA anvendt som template-DNA.
- Rense PCR-reaktioner under anvendelse af et Gel Extraction kit, udføre endelig eluering i 30μl af vand af molekylærbiologisk kvalitet.
- Kontrol 2 pi PCR-produkt på en 1% agarosegel i TAE fremstillet.
- Digest Wnt8a-HA og eGFP PCR-produkter og pCS2 anvendelse af de passende restriktionsenzymer (se tabel 1), der er oprettet reaktioner som beskrevet i tabel 2 (eksempel PCR-produkt Digest).
- Inkuber reaktioner i 3 timer ved 37 ° C og derefter opbevares Wnt8a-HA- og GFP PCR-produkter på is.
- Tilføj 1 pi af kalve alkalisk intestinal phosphatase (CAIP) til pCS2 fordøjelse og inkuberes i 6 min ved 37 ° C.
- Varmeinaktiveres CAIP ved inkubering i 15 minutter ved 65 ° C.
- Run pCS2 og PCR fordøjelser på en 1% agarosegel ultrarent fremstillet i TAE.
- Gel ekstrakt og rydde op pCS2 og PCR-produkter ved hjælp af en gelekstraktionskit, udføre den endelige eluering i 30 pi af vand af molekylærbiologisk kvalitet.
- Oprettet ligering som beskrevet i tabel 2 (eksempel T4 ligering) og inkuberes ved 12 ° C i 16 timer.
2. mRNA syntese: Generering Template
- Fremstil skabeloner ved hjælp restriktionsenzymfordøjelse af følgende plasmider (alle i ekspressionsvektoren pCS2): membran-Cerulean (memCerulean), membran-RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
- Oprettet restriktionsfordøjelser som beskrevet i tabel 2 (eksempel skabelon fordøje).
- Bland forsigtigt og inkuberes reaktionerne i 2 timer ved 37 ° C.
- Kør 2,5 pi fordøjet plasmid på en 1% agarose gel (TAE) til at kontrollere, at reaktionen er skåret til ende.
- Rydde op i fordøjer ved hjælp af en gelekstraktionskit, udføre den endelige eluering i 50 pi vand af molekylærbiologisk kvalitet.
3. mRNA syntese: in vitro-transkription
- Syntetisere funktionelle mRNA under anvendelse af SP6 mRNA-transkription kit. Saml reaktionerne i 1,5 ml DNAse / RNAse gratis mikrocentrifugerør.
- Oprettet mRNA transkriptionsreaktioner som beskrevet i tabel 2 (eksempel mRNA-syntese).
- Blandreaktioner forsigtigt med en pipette og derefter inkuberes ved 37 ° C i 4 timer.
- Kontrol 1 pi af reaktionen på en 2% agarosegel (TAE).
- Tilsæt 1 pi DNAse til reaktionen, blandes forsigtigt med en P20 og inkuberes reaktionen i yderligere 15 minutter ved 37 ° C.
- Tilføj 340 pi vand af molekylærbiologisk kvalitet, 40 pi ammoniumacetat og 400 pi phenol-chloroform til reaktionsblandingen. Vortexes reaktionerne i 30 sek.
- Spin mRNA'et i 5 minutter, 14.000 xg, 4 ° C.
- Pipetteres toppen (vandige) lag fra hver reaktion flytte det til en frisk 1,5 ml skruelåg mikrocentrifugerør.
- Tilføj et lige så stort volumen chloroform til hver af de dekanterede reaktioner. Vortex prøverne i 30 sek.
- Spin mRNA'et i 5 minutter, 14.000 xg, 4 ° C
- Pipettere det øverste vandige lag fra hver reaktion flytte den til et frisk 1,5 ml skruelåg mikrocentrifugerør.
- Tilføj et lige så stort volumen isopropanol til hver af reaktionerne og udfælde mRNA ved -80 ° C i 30 min.
- Spin hver af reaktionerne i 15 minutter ved 14.000 xg, 4 ° C for at pelletere mRNA
- Fjern supernatanten pas på ikke at forstyrre pelleteret mRNA
- Tilsæt 200 pi 70% ethanol til hver af reaktionerne, bland reaktionerne og derefter spinde i 10 minutter ved 14.000 xg, 4 ° C.
- Fjern ethanol pas på ikke at forstyrre mRNA, tør pille ved stuetemperatur ved hjælp af en vakuumekssikkator eller speed-vac.
- Re-suspendere mRNA i 10-20 pi vand af molekylærbiologisk kvalitet. Spin kort og holde prøverne på is. Bemærk: opvarmning af prøven til 80 ° C i 1 min kan hjælpe det opløses.
- Kør 1 pi af mRNA på en 2% agarosegel (TAE) og analysere 1,2 pi på et spektrofotometer for at få en nøjagtig aflæsning af koncentration.
Afgørende skridt: En koncentration på 400 ng / ul af syntetisk mRNA er forpligtet til at udføre følgende forsøg.
Afgørende skridt: Hvis 260/280 forholdet eruden for intervallet 2,00-2,20, eller den totale mængde af mRNA overstiger 12 ug, foretage en lithiumchlorid udfældning. - Store mRNA i 1 pi alikvoter ved -80 ° C. Anvendes delprøver og derefter smide væk; ikke nedfryses igen mRNA.
4. Generering Xenopus laevis Embryoner
- Prime Xenopus laevis hunner ved subkutan injektion med 50 enheder af humant choriongonadotropin hormon (HCG; Chorulon) en uge før forsøget.
- Inducere Xenopus laevis hunner natten før forsøget ved at injicere 250 enheder af HCG og inkubere dem i mørket, O / N ved 19 ° C.
- Dissekere ud testikler fra aflivet mandlige frø og butik i 1xNAM ved 4 ° C. Bemærk: Mand frøen er aflivet ved terminal anæstesi i henhold til bilag 1 af dyr (Videnskabelige Procedurer) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
- Massage kvindelige Xenopus laevis at fremkalde ægløsning, indsamle laid æg i en diameter 55 mm rund petriskål.
- Fremstil en sædcelle suspension ved at knuse ¼ Xenopus laevis testis i 1 ml deioniseret vand.
- Pensel Xenopus-oocytter med den knuste spermsuspension ved hjælp af en Pasteur-pipette og pipette pære afgørende skridt:. Udfør befrugtning reaktioner på ca 04:30 på dagen for eksperimentet.
- Kultur embryoner ved 21 ° C i NAM / 10 (se tabel 3 for opløsninger) i 55 mm petriskåle overtrukket med 1% agarose fortyndet i vand (vand).
- De-jelly embryoner efter 45 minutter under anvendelse af cystein / HCL (tabel 3). Bemærk: ved 21 ° C, vil embryoer nå 2 cellestadiet efter 90 minutter og spalte hver 20 min efter at.
5. mikroinjektion Xenopus embryoer
- Brug 1 X 90mm glas kapillærer og et Narishige PC-10 dual-stage glas mikropipette aftrækker, træk mikropipetter til injektioner. Juster indstillingerne empirisk for at opnå en fin spids (mindre end en mikron Diameter).
- Vedhæft en mikropipette (nål) til en gas mikroinjektor (f.eks Harvard Appartaus PLI-100 PICO-injektor) gentagne gange at levere præcise mængder af væske ved at påføre et reguleret pres for en digitalt sæt tidsperiode. Juster pneumatiske pres for at levere et volumen på 1,25 til 10 nanolitres som bestemt ved anvendelse af et trådkors eller kalibrering slide.
- Coat en 55 mm petriskål med 5 ml 1% agarose (vand). Skær et 35-35 mm kvadrat af agarose ud af skålen, vil dette give en stabil overflade for at microinject embryoner.
- Overfør embryoner i NAM / 3 + Ficoll (tabel 3), og flytter til injektion fad.
- Injicer embryoner i halvkugle dyr, når de når den ønskede fase for eksperimentet.
- For at analysere fordelingen af GFP tagged ligander på celleoverfladen, injicere embryonerne bi-lateralt på to cellestadiet, 10nl per celle. Eksempel mRNA fortyndinger vist nedenfor for Wnt8a-HA-eGFP. Afgørende skridt: Sørg for, at alle mRNA koncentrationer stkunst på 400 ng / pl.
Bemærk: Mængden af mRNA, der skal injiceres skal bestemmes empirisk ved at teste koncentrationer og finde den minimale mængde er nødvendig for at visualisere den fluorescerende ligand. Western blotting under anvendelse af et anti-HA-antistof er et vigtigt skridt at fastslå, at mRNA'erne omregnes til tilsvarende niveauer for at muliggøre sammenligning af to forskellige fluorescens mærkede ligander; vi har gjort det for Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP i Fellgett et al., 2015.
Bemærk: Ved vurdering af effekten af en injiceret mRNA (såsom én der koder for en kandidat regulator), en typisk kontrol er at injicere en ikke-aktiv RNA, såsom LacZ, til søskende embryoner med henblik på at kontrollere for eventuelle effekter af den ekstra udskrifter i fosteret.- Fortynd memRFP mRNA 1 i 4 (1 pi + 3 pi dH2O) med vand af molekylærbiologisk kvalitet at reducere koncentrationen til 100 ng / pl.
- Fortynd Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 i 4 (1 pi + 3 pi dH2 O) med vand af molekylærbiologisk kvalitet at reducere koncentrationen til 100 ng / pl.
- Bland memRFP mRNA i et 1: 1-forhold med Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
- Bland mRNA fra 5.5.1.3 i et 1: 1 forhold med enten kontrol mRNA LacZ eller en modulator såsom Sulf1.
- Injicer embryoner bilateralt på 2 cellestadiet med 10nl af mRNA per celle (i alt 20nl). Bemærk: Dette resulterer i 250 pg m em RFP, 250 pg Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg Wnt11b-HA- e GFP og 2 ng LacZ eller Sulf1 mRNA injiceres ind i hver celle.
- For at analysere diffusionen af GFP mærkede ligander, injicere mRNA, der koder for ligand-GFP sammen med en slægt markør, såsom memRFP på 16-32 celle stadiet, 1,25 nl per celle.
- For at analysere virkningerne af enhver potentiel modulator af ligand diffusion, co-injicere mRNA koder for modulatoren sammen med liganden og afstamning sporstof. Alternativt kan injicere naboceller: en med mRNA koder for GFP-mærkede ligand og en slægt sporstof (memRFP) og den anden med mRNA'er, der koder for modulatoren og en anden slægt sporstof (memCerulean).
- For at analysere fordelingen af GFP tagged ligander på celleoverfladen, injicere embryonerne bi-lateralt på to cellestadiet, 10nl per celle. Eksempel mRNA fortyndinger vist nedenfor for Wnt8a-HA-eGFP. Afgørende skridt: Sørg for, at alle mRNA koncentrationer stkunst på 400 ng / pl.
- Overfør embryoner til en 12,5 ° C inkubator og kultur til den følgende dag, Nieuwkoop og Faber (NF) etape 8.
6. udskære Animal Cap Eksplantater
- Overfør embryoner til et 55 mm petriskåle overtrukket med 5 ml 1% agarose (vand). Fyld skålen med NAM / 2 (tabel 3).
- Tage cirkulære dyr hætter hjælp Wolfram nåle afgørende skridt:. Tag store hætter på dette tidspunkt, da disse vil helbrede bedre og være lettere at billedet, holde kontrol hætter til at sikre, at ingen konvergent forlængelse sker.
- Overfør dyr eksplantater til 55 mm petriskåle overtrukket med 1% agarose (vand) og kultur embryoner ved 21 ° C i 4 timer kritiske trin:. Den 4 timers inkubation er nødvendige, for at fluorescerende proteiner til at modnes.
- Generer relief lysbilleder ved at stikke ned to lag PVC-isolering pron tape på objektglas. Skær en 14 mm x 10 mm rektangel ud af båndet til at forlade et kammer til montering dyr caps afgørende skridt:. Glat begge lag tape grundigt på objektglasset før opskæring rektanglet.
- Pipette 2 separate dråber af NAM / 2 (tabel 3) i relief slide, ca. 30 pi per drop.
- Overfør dyr eksplanteret til nødhjælp dias ved hjælp af en afskåret P20 spids og orientere således at den apikale side vender opad. Bemærk: Hver side kan holde 10-15 dyr caps afgørende skridt:. På dette stadie dyret hætter burde have delvist helbredt, dette betyder, at de er mindre følsomme og kan være orienteret ved hjælp af pincet.
- Sænk forsigtigt et dækglas på objektglasset relief og tillade dækglasset tørre i 20 min kritiske trin: Størrelsen af dyret hætten er af afgørende betydning;. sikre hætten er stort nok, at når dækglas sænkes ned på relief slide det komprimerer den apikale lag af animalsk cap celler nok til PRoduce en flad overflade til billedet. Hvis dyret hætter er for små stadig derefter reducere PVC tape til et lag.
- Forsegle dias ved hjælp af neglelak afgørende skridt:. Brug ikke for meget neglelak at forsegle relief glider fordi hvis PVC tape bliver for fugtig det vil hæve op og ødelægge dias.
- Tørre relief dias for 20 minutter i mørke og de er klar til billedet, typisk dyr hætter forbliver sundt for 4-6 timer, når beseglet i dias.
7. Imaging
Bemærk: Imaging blev udført under anvendelse af et omvendt konfokalt mikroskop. Lambda-tilstand blev valgt til billeddannelse, da dette tilladt flere fluoroforer med overlappende underskrifter, der skal anvendes, og fjernet problemet med potentielle bevægelse prøve mellem scanninger.
- Find eksplantater ved hjælp af en lav forstørrelse målsætning derefter skifte til 63x / 1.4 objektiv olie til højere opløsning billeddannelse.
- Tænd nødvendige lasere; for dette eksempel 405laser blev brugt til at ophidse memCerulean blev den 488 laser, der anvendes til at ophidse GFP og 561 laser til ophidse memRFP hjælp 405 og 488/561 dikroiske spejle.
- Brug lambda-mode (I Zen 2011, skal du vælge lambda-mode - 32 spande).
- Vælg 405nm, 488 nm og 561nm lasers.To tillade et bredere synsfelt, zoome ud af billedet (til 0,6x).
- Sæt rammen størrelse til den ønskede billedstørrelse (1024 x 1024 med pixel størrelser af 220 nm blev anvendt til dette datasæt).
- Set i gennemsnit til typisk 4 til 8 for at øge signal-støj-forholdet.
- Optimering af pinhole (1 luftige ifølge den 561nm laser blev anvendt til dette datasæt).
- Optimer lasereffekter afgørende skridt:. Balancér 405nm, 488nm og 561nm lasere, således at alle fluoroforer kan påvises ved anvendelse af 32 detektoropstillingen samtidig minimere mængden af spænding og krævede forstærkning.
- Saml lyset udsendes fra memCerulean, GFP og memRFP. For dette arbejde lys blev indsamlet hver ~10 nm fra 415-720nm, skønt større intervaller indsamling er også mulige (f.eks. Hver ~ 20 nm).
8. Image Analysis
- Undersøgelse af virkningerne af modulatorer på celleoverfladeekspression af GFP-mærkede ligander
BEMÆRK: Følgende trin er en detaljeret vejledning i, hvordan analyse blev udført i vores laboratorium. Slutbrugeren kan vil strømline processen ved at skrive en ImageJ eller FIJI script til at fjerne nogle af de manuelle trin.
Afgørende skridt: Det er vigtigt, at slutbrugeren prøver spektre af eventuelle fluorforer anvendt i de samme betingelser, at den endelige eksperiment udføres for at perf orm effektiv spektral unmixing af de mange fluoroforer, der anvendes i det endelige eksperiment.
To hovedtyper af analyser udføres i dette afsnit:- At beregne det samlede antal Wnt-HA-eGFP pixels co-lokaliseringssystem med cellemembranen.
- Unmix det grønne,røde og Cerulean kanaler ved hjælp af spektre stikprøven fra enkelte injektioner af disse fluorophorer i ZEN software. Gem disse billeder som separate LSM dokumenter til brug i alle de følgende trin.
- Åbent LSM filer direkte i billedredigering software. Bemærk: Følgende instruktioner gælder for FIJI billede J.
- Gem LSM billeder som billedsekvens dokumenter, vil dette automatisk opdele billederne ind i separate kanaler.
- Gem billedet sekvens i den samme mappe som de scripts til scriptet analyse software, der vil blive anvendt til at analysere de data (se supplerende kode filer til faktiske script). Bemærk: Følgende instruktioner er til Matlab.
- Åbne op scriptet analyse software og åbne den mappe, hvor scripts er skrevet.
- Indtast filnavnet under Placering analyse, vil softwaren tage filnavnet og udføre analysen.
Bemærk: Filnavnet vil læse ImageA0000 og ImageA0001 for hver image. Scriptet analyse software vil bruge billedet markeret 0001 som masken og analysere den procentdel af pixels i billedet 0000, at co-lokalisere med denne maske. - Tag den procentvise co-lokalisering nummer (betegnet som Cellemembran befolkede områder) og kopiere det til et regneark. Bemærk: Følgende instruktioner er til Excel.
- Plot den procentvise co-lokalisering nummer på et søjlediagram, enten som en absolut eller relativ værdi.
- Ved analyse af antallet, størrelsen og formen af Wnt-HA-eGFP puncta.
- Åbn ublandet LSM filer direkte i billedredigering software. Bemærk: Følgende instruktioner gælder for FIJI billede J.
- Split hvert billede i sine enkelte kanaler (Billede> Farve> Split kanaler).
- Threshold både Wnt-HA-eGFP og membranen markør kanaler (Image> Adjust> Auto-tærskel) afgørende skridt:. Prøv en række tærskler, for at se, hvilken en frembringer et repræsentativt billede, uden at overeksponerekanalen.
- Konverter membranen markør kanal til en maske (Process> Binary> Opret maske).
- Vend denne maske (Rediger> Inverter).
- Konverter Wnt-HA-eGFP puncta til en maske som ovenfor.
- Træk membranen markør maske fra ligand-GFP maske (Proces> Billede lommeregner> Wnt maske i top-boks, membran maske i bunden boks).
- Brug analysere partikel funktion. Herfra skal du vælge de nødvendige parametre og analysere data (Analyse> Analysere partikler).
- Kopier antallet af partikler, gennemsnitlig partikelstørrelse og cirkularitet data i et regneark og derefter plotte grafer fra disse data. Bemærk: Til denne analyse, partikler kun mellem 0.1-10μm 2 størrelse blev analyseret, blev der ingen restriktioner placeret på partikel cirkularitet. Denne instruktion er til Excel.
- At beregne det samlede antal Wnt-HA-eGFP pixels co-lokaliseringssystem med cellemembranen.
- Analyse området af ligand diffusion
- Åbne alle ublandede billeder i konfokal imaldrende software og derefter eksportere filer i en TIF-format, som rådata og som et RGB-billede Bemærk:.. Denne instruktion er til Zen lite 2011 afgørende skridt: Medtag en skala bar på mindst et af de billeder, så afstanden kan være beregnet under analysen.
- Åbn de billeder, der skal analyseres i billedanalyse software. Bemærk: Følgende instruktioner er til Photoshop 8.2.3) Højreklik på baggrunden af billedet og vælg 'lag fra baggrunden', for at skabe et nyt lag..
- Indstil membran markør kanaler til 0, så kun den ligand-GFP kanal er synlig (Lag> Nyt justeringslag> Kanal mixer) afgørende skridt:. Klip den nye justering lag til billedet, der analyseres, er muligheden for klip det nye lag til dette billede er tilgængelig som en afkrydsningsfelt efter at have klikket på den kanal mixer mulighed.
- Åbn et nyt arbejdsområde. Indstil opløsningen til 300 pixels per tomme og farven tilstand til RGB-farve (Filer>Ny> Udklipsholder).
- Kopiere alle de billeder, der analyseres i det indre arbejdsområde (Klik på billedet, og det er klippet kanal mixer ved at holde kontrol derefter holde kontrol og Alt og trække billedet ind i arbejdsområdet).
- Orientere alle de billeder, så kan måles den maksimale længde af diffusion for hvert billede blive langs den vandrette akse, med celler, der udtrykker Wnt-HA-eGFP orienteret til venstre.
- Gem arbejdsområdet som en TIF og derefter åbne denne i billedet analyse software. Bemærk: Følgende instruktioner gælder for FIJI billede J.
- Åbn ROI Manager-vinduet (Analysere> Værktøj> ROI manager).
- Tegn et rektangel på det første billede, kan den nøjagtige størrelse af rektanglet skal specificeres (Vælg rektangelværktøjet og drage nogen rektangel> Rediger> Valg> Angiv). Bemærk: en størrelse på 650 x 100 pixels længde x bredde blev anvendt i denne undersøgelse.
- Placer rektanglet på kanten af domænet udtrykker Wnt-HA-eGFP. Placer rektanglet over regionen med den maksimale afstand af Wnt-HA-eGFP diffusion. Afgørende skridt: Selv uden membranen markør regionerne udtrykker Wnt-HA- e GFP skal være synlig på grund af baggrunden fluorescens; hvis ikke så rådføre rå billeder.
- Skift kassen 10 uM til højre. Bestem antallet af mikrometer ved at måle længden af skalaen bar inkluderet i et af billederne (Tegn en linje sporing skalaen bar> Analyse> sæt skala). Bemærk: Dette giver en værdi for 10 uM i pixels.
- Føj boksen til ROI Manager ved at trykke på knappen Tilføj i ROI Manager-vinduet.
- Flyt rektangel til det næste billede, der skal måles, ved at klikke tilbage på det rektangel værktøj til at flytte rektanglet. Gentag trin 8.2.10-11.
- Når alle panelerne er blevet målt, skal du vælge multiplot fra ROI Manager menuen (ROI Manager> Mere> Multiplot> List).
Bemærk: data repræsenterer Wnt pixel intensity (Y) med stigende afstand langs den vandrette akse (X, målt i pixel). Værdien for Y er den gennemsnitlige signalintensitet af ligand-GFP ved punktet X og gennemsnittet beregnes fra alle de pixels i Y-aksen for hver X-værdi. Derfor højere kassen, jo flere pixels analyseres for at producere dette gennemsnit. En lille boks (i Y-aksen) vil være mere støjende; en høj kasse vil have meget lav gennemsnitlig pixel intensitet. - Kopier data fra multiplot boksen i et regneark og re-label i overensstemmelse hermed. Bemærk: Følgende instruktioner er til Excel.
- Kassér den første 10-20μm af data fra hver analyse som dette repræsenterer baggrund fluorescens fra ligand-GFP-udtrykkende celler og fordrejer graferne.
- Åbne op videnskabelig analyse og graftegning software og oprette en ny notesbog. Bemærk: Følgende instruktioner gælder for Sigmaplot 13.
- Mærk det nødvendige antal kolonner for de data, ved at dobbeltklikke på de vandrette tal on regnearket og mærkning dem distance i um, Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP.
- Kopier data fra regnearket i de relevante kolonner i den videnskabelige analyse og graftegning software.
- Opret en scatter graf (Opret graf> Scatter> Multiple scatter> Vælg X mange Y> Vælg den kolonne for X> Vælg Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP for Y-værdier> Finish afstand).
- Udfør regressionsanalyse på Wnt8a-HA-eGFP kurve ved at venstreklikke på et Wnt8a-HA-eGFP punkt på scatter grafen. Alle de punkter bør fremhæve. Klik på Analyser> Regression guiden.
- Vælg den kurve ligning kategori (eksponentiel henfald) og ligningen navn (Single, 3 parameter) tryk derefter på næste.
- Vælg X og Y-værdier, som kurven skal monteres (hvis dataene blev understreget tidligere, bør dette ske automatisk) tryk derefter på næste.
- Fortsæt gennem guiden, indtil det numeriske output optionside, sikre 'Opret rapport' er afkrydset og tryk på næste. Bemærk: Parametrene for den tilpassede kurve vil blive vist i rapporten 1 *.
- På grafen muligheder siden sikre "tilføjer ligning til at tegne titel" er markeret og tryk på finish. Bemærk: Guiden vil have skabt Rapport 1 * og Graf 1 * faner øverst på note bog. Desuden vil være blevet tilføjet kurven til grafen fremstillet i (8.2.20).
- Gentag trin 8.2.21-8.2.25 til at passe en kurve for Wnt11b-HA-eGFP afgørende skridt:. Prøv montering flere ligning kategorier og ligning navne til data. Bemærk: Kurven med den bedste pasform skal producere den højeste R2 værdi med den laveste resterende sum af kvadrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konfokal analyse af animalsk cap eksplantater udtrykker fluorescens mærkede proteiner giver et effektivt system til visualisering ligand fordeling under forskellige eksperimentelle betingelser. I et eksempel fordelingen af GFP mærkede Shh er vist (figur 1). Ved 2-celle stadiet, er Xenopus embryoner injiceret i begge celler med enten med en kontrol mRNA eller med mRNA, der koder for Sulf1, et enzym, der modificerer celleoverflade heparansulfat og har indflydelse på Shh morfogenet gradient 16. Disse embryoner dyrkes indtil 32-celle stadiet og en enkelt celle er co-injiceret med mRNA'er der koder for Shh-GFP og memRFP (som slægt sporstof). Dette skaber en klon af celler, der udtrykker GFP-Shh, der er markeret med cellemembranen tøjret RFP. På blastula stadium er dyr cap eksplantater udtaget til analyse ved konfokal mikroskopi. Figur 1 viser, at under kontrolbetingelser, er Shh-GFP udskilt og diffunderer uden for region udtrykker de injicerede mRNA'er. Men i nærværelse af Sulf1 Shh-GFP er mere begrænset i sin distribution og, i denne prøve, er ikke påvist uden for klon af celler, der producerer det. Virkningerne af Sulf1 på Shh-GFP distributionen er blevet analyseret nærmere 16.
Når det udtrykkes i Xenopus embryoer, fluorescerende mærkede ligander Wnt udskilles, ophobes på cellemembranen, og diffundere over marken af celler. I figur 2 har vi karakterisere quantitaive og kvalitative egenskaber af de to forskellige fluorecently mærkede Wnt ligander i injicerede celler og udtrykke proteinerne. Figur 2A-H viser eksempler på, hvordan Wnt8a og Wnt11b-HA-eGFP ophobes på membranen af animalsk cap celler . Ved at sammenligne paneler 2B og 2F er det klart, at Wnt8a-HA-eGFP akkumuleres mere effektivt på cellemembranen end Wnt11b-HA-eGFP. Kvantitative oplysninger er uddraget fra konfokale billeder ved hjælp af en comkombination af billede og script analysesoftware (supplerende kodefil). Figur 2I viser den relative akkumulering af Wnt8a-HA-eGFP på cellemembranen i forhold til Wnt11b-HA-eGFP. Dataene blev opnået ved anvendelse af en computer script, der bestemmer det samlede antal Wnt-HA-eGFP pixels co-lokaliserende med cellemembran pixel i hvert billede. I en anden tilgang, er det samlede antal Wnt-HA-eGFP puncta der co-lokalisere med cellemembranen talt ved anvendelse billede analyse software (Figur 2J). Kvalitative oplysninger om størrelsen og formen af de enkelte puncta kan også udvindes af data ved hjælp af billedanalyse-software. Ud over færre Wnt11b-HA-eGFP puncta co-lokalisering med cellemembranen (figur 2J) disse puncta også have en mindre gennemsnitlig størrelse end Wnt8a-HA-eGFP puncta (figur 2K). Desuden Wnt11b-HA-eGFP puncta har en reduceret cirkelform i forhold til Wnt8a-HA-eGFP puncta (figur 2L). Circularity er et mål for, hvor tæt et objekt ligner en perfekt cirkel, med 1 repræsenterer en perfekt cirkel og 0,1 en langstrakt ikke-cirkulær form. Denne fremgangsmåde kan bruges til at teste enhver kandidat regulator af Wnt ligand diffusion. For at gøre dette, bør kontrol celler injiceres med et kontrol-mRNA, der koder for en inaktiv form af kandidat regulator eller et irrelevant protein, såsom beta-galactosidase (lacZ); dette giver en mere gyldig kontrol end simpelthen ikke at injicere regulatoren. Data i disse eksempler blev analyseret ved anvendelse af ikke-parametrisk test Mann-Whitney U 18-19. En statistisk analyse program blev anvendt til at udføre testen.
I figur 3, undersøger vi Wnt ligand diffusion. En enkelt blastomer blev injiceret på 4-celle stadiet, således at dyret cap eksplantater repræsenterer et felt af celler, i hvilke kun nogle celler udtrykker enten Wnt8a-HA-eGFP eller Wnt11b-HA-eGFP. Ved at inkludere en celle afstamning sporstof, kan vi identificere EXPREssing versus ikke-udtrykkende celler, og dette tillader række Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP ligand diffusion væk fra kilden celler, der skal analyseres (figur 3B og 3C). På grund af krumningen af dyret cap eksplantaterne, den maksimale afstand, der kunne måles pålideligt ved hjælp af denne analyse var 160μm, hvilket ikke var nok til at måle den absolutte afstand af ligand diffusion. Men ved at anvende en kombination af konfokal analyse, billedanalyse og videnskabelige analyser og grafer software den overordnede form af Wnt-HA-eGFP morfogen gradient kunne analyseres (figur 3D). Disse data kan anvendes til at undersøge, om overekspression andet protein sammen med de mærkede ligander i de samme celler kan påvirke Wnt sekretion eller diffusion. I en anden type forsøg (figur 3E-3J) virkningerne af en potentiel regulator i modtagende celler kan måles ved overekspression kandidaten protein i kloner af celler der støder op til celler extrykke Wnt8a eller Wnt11b-HA-eGFP. Dette tillader, at de ikke-celle-autonome virkninger af den regulerende Wnt-HA-eGFP ligand diffusion, der skal undersøges. I overensstemmelse med figur 2, kan mere Wnt8a-HA-eGFP påvises diffundere væk fra celler end Wnt11b-HA-eGFP i begge diffusionsforsøg.
De typer af forsøgene beskrevet i dette papir er blevet brugt til at analysere effekten af Sulf1 på Shh og Wnt signalering 16,17.
Figur 1. Graduering af Shh-GFP fordelingen kan påvises ved konfokal analyse af Xenopus animal caps. (A) En tegneserie afbilder eksperimentelle assay embryoner, der først injiceret med mRNA, der koder for Sulf1 eller et kontrol-mRNA, de samme embryoner senere injiceres ved 32-celle stadiet med mRNA der koder for Shh-GFP i en enkelt celle. (BC) Animal cap eksplantats blev taget ved trin 8 og filmede efter 4 timer. Billeder vises i kanten af en Shh-GFP + memRFP udtrykkende klon af celler. I kontrolforsøg embryoner (B), er Shh-GFP spredes væk fra memRFP mærket klon af signal-producerende celler. I embryoner udtrykker Sulf1 (C), er Shh-GFP mere begrænset i dens fordeling, se 16. memRFP er vist i magenta og Shh-GFP grønt. Scale søjler repræsenterer 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kvantitativ og kvalitativ analyse af Wnt8a og Wnt11b-HA-eGFP puncta på cellemembranen. (AH) Embryoer mikroinjiceret bi-lateralt med mRNA, der koder memRFP (500 pg) i halvkugle dyr på to-celle stadium. Desuden embryoer blev injiceret med mR NA-kodning (AD) Wnt8a-HA-eGFP (500 pg) eller [EH] Wnt11b-HA-eGFP (1 ng). De embryoner blev også injiceret med mRNA, der koder for LacZ at give en kontrol for yderligere mRNA / protein når man analyserer virkningerne af en eventuel potentiel regulator. De hvide kasser i (C) og (G) markerer de områder, forstørret i paneler (D) og (H) hhv. Den samlede mængde Wnt-HA-eGFP fluorescens co-lokalisering med cellemembranen blev beregnet ved anvendelse image og script analyse software og derefter normaliseret (I). Kvalitative oplysninger blev ekstraheret anvendelse af billedanalyse-software. Wnt8a og Wnt11b-HA-eGFP punctae blev analyseret for partikelantal (J), partikelstørrelse (K) og partikel cirkularitet (L). Mann-Whitney U (** P <0,01), N = antallet af embryoner. memRFP er vist i magenta og Wnt8a / 11b-HA-GFP er vist i grønt, repræsenterer skalapanelerne 20 um.ove.com/files/ftp_upload/53162/53162fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling intervallet diffusion af fluorescens mærkede Wnt ligander. (A) Diagram der viser analysen anvendes til at måle Wnt8a og Wnt11b-HA-eGFP sekretion og diffusion væk fra udtrykkende celler. (BC) mRNA, der koder (B) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) og Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) eller (C) memCerulean (600 pg), LacZ (4 ng) og Wnt11b-HA-eGFP (2 ng ) blev injiceret i dyret halvkugle med en blastomer på fire celletrinnet. (D) Rækken af diffusion af Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP blev målt ved hjælp af en kontrol baggrund. (E) Diagram der viser assayet anvendes at måle Wnt8a og Wnt11b-HA-eGFP diffusion gennem en baggrund, som udtrykte lacZ, se metode for the fattes. (FG) mRNA, der koder memCerulean (600 pg), og (f og h) Wnt8a-HA-eGFP (2 ng) eller (G og I) Wnt11b-HA-eGFP blev injiceret i dyret halvkugle med en blastomer på fire celle stadiet. En tilstødende blastomer blev injiceret med mRNA, der koder memRFP (600 pg) og LacZ (4 ng) se Nøgle for detaljer. (J) Rækken af Wnt8a-HA-eGFP og Wnt11b-HA-eGFP diffusion blev målt gennem en baggrund udtrykker LacZ. Dataene blev kvantificeret og afbildet ved hjælp konfokal analyse, billedanalyse og videnskabelig analyse og graftegning software. memCerulean (blå (CD) og gul (F og H)), Wnt-HA-eGFP (grøn), memRFP (magenta), repræsenterer skala stænger 20 pm. Klik her for at downloade en større version af denne fil.
filer / ftp_upload / 53162 / 53162table1.jpg "/>
Tabel 1. Primere anvendt til at subklone Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP og Shh-GFP ind pCS2.
| Reaktion | Komponenter | |
| Eksempel CS2 + Digest | 1,5 ug pCS2 + | |
| 2 pi Restriktionsenzymanalyse 1 | ||
| 2 pi Restriktionsenzymanalyse 2 | ||
| 5 pi Restriktionsenzymanalyse buffer (10X) | ||
| Gjort op til 50 pi med vand af molekylærbiologisk kvalitet | ||
| Eksempel mRNA-syntese | 2 pi lineariseret skabelon | |
| 2 pi 10x Megascript trx mix | ||
| 2 pi 50 mM ATP | ||
| 2 pi 50 mM CTP | ||
| 2 pi 50 mM UTP | ||
| 2 pi 5 mM GTP | ||
| 2,5 pi 40 mM Cap Analog (m7G (5 ') | ||
| 2 pi SP6 enzymblanding | ||
| 3,5 pi Molekylær kvalitet vand | ||
| Eksempel PCR-reaktion | 0,5 pi High fidelity DNA polymerase (2.000 enheder / ml) | |
| 2 ng skabelon-DNA | ||
| 2,5 ul frem og tilbage primere (10 pm) | ||
| 0,5pi dNTP'er | ||
| 5 pi DNA ploymerase buffer (10X) | ||
| Gjort op til 50 pi med vand af molekylærbiologisk kvalitet | ||
| Eksempel PCR-betingelser | Intial denaturering 2 minutter ved 98 ° C | |
| 15 sek 98 ° C | ||
| 15 sek 65 ° C | 30 cykler | |
| 40 sek 72 ° C | ||
| Final extension 10 minutter ved 72 ° C | ||
| Eksempel PCR-produkt Digest | 28 pi PCR-produkt | |
| 2 ul Begrænsning enzyme 1 | ||
| 2 pi Restriktionsenzymanalyse 2 | ||
| 5 pi Restriktionsenzymanalyse buffer (10X) | ||
| 13 pi Molekylær kvalitet vand | ||
| Eksempel T4 ligation | 1 pi Cut CS2 + | |
| 3 pi Cut PCR-produkt 1 | ||
| 3 pi Cut PCR-produkt 2 | ||
| 1 pi T4 DNA-ligase | ||
| 1 pi T4 DNA ligase buffer (10X) | ||
| 1 pi vand af molekylærbiologisk kvalitet | ||
| Eksempel skabelon fordøje | 5 ug plasmid-DNA | |
| 10 pi Restriktionsenzymanalyse buffer (10X) | ||
| 3 pi Not1 (undtagen Shh-GFP, Kpn1 anvendes) | ||
| Gjort op til 100 pi med vand af molekylærbiologisk kvalitet |
Tabel 2. Eksempel reaktionsbetingelser, der anvendes til subkloning og producere syntetisk mRNA for Wnt8a-HA-eGFP.
| Løsning | Komponenter |
| Cystein-HCL | 0,1X NAM |
| 2,5% L-cystein-hydrochlorid-monohydrat (pH 7,8) | |
| NAM-salte | 110 mM NaCI |
| 2 mM KCI | |
| 1 mM CA (NO3) 2 | |
| 0,1 mM EDTA | |
| NAM / 2 | 0,5X NAM salte |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mM bicarbonat | |
| 25 ug / ml gentamycin | |
| NAM / 3 + Ficoll | 0.33X NAM salte |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 0,25 mM bicarbonat | |
| 2 5 pg / ml gentamycin | |
| 5% Ficoll | |
| NAM / 10 | 0,1X NAM salte |
| 5 mM HEPES pH 7,4 | |
| 25 ug / ml gentamycin |
Tabel 3. Opløsninger under fremstillingen og mikroinjektion af Xenopus laevis embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En væsentlig del af denne protokol genererer biologisk aktive ligander, der normalt forarbejdes, udskilles, og i stand til at fremkalde en reaktion i den modtagende celle, trods en fluorescerende del knyttet. Det er afgørende at fastslå, at fluorescens-mærket genprodukt er biologisk aktiv anvendelse af et passende assay. For Shh-GFP, blev evnen til at aktivere ekspressionen af PTC1 bekræftet 16. Wnt8a har en bemærkelsesværdig potent evne til at fremkalde en sekundær akse, når det udtrykkes i en enkelt ventral blastomer 20-21 og Wnt8a-HA-eGFP blev vist bevare denne biologiske aktivitet. Wnt11b hæmmer activin behandlet ektodermale eksplanteret fra undergår konvergent forlængelse 21-22, og Wnt11b-HA-eGFP bevarer også sin biologiske aktivitet 17. Evnen af de mærkede ligander til at fremkalde reaktioner svarende til de umærkede proteiner tyder på, at konklusionerne baseret på forsøg med de fluorescerende ligander vil be relevant for det normale protein. Tilsætningen af HA-epitopen mellem liganden og det fluorescerende protein tilvejebragt en spacer region, der gør det muligt for Wnt-konstruktioner at være både aktiv og fluorescerende.
Den største begrænsning i denne type analyse er, at det ikke direkte informere om endogene morfogen gradienter. For eksempel kan diffusionen af Shh over marken af celler i dyr cap ikke afspejle den måde endogene Shh bevæger sig gennem søjleformede epitel i neurale embryoet. Men enkelheden i denne protokol tillader eksperimenter, hvor effekten af eksogene regulatorer om fordelingen af ligander kan testes. Resultaterne fra disse fremgangsmåder kan danne grundlag for hypoteser, der skal testes ved hjælp af mere krævende in vivo analyser. For eksempel, evne overudtrykt Sulf1 at begrænse fordelingen af Shh-GFP ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet i dette dokument pegede på potentialet for Sulf1 i modulering af Shh morfogen gradient. Dette blev direkte testet og valideret ved hjælp af antisense morpholino knock-down af Sulf1 og immunocytokemi at visualisere endogene Shh i neuralrøret 16. En fremgangsmåde svarende til vores har været anvendt til at undersøge specifikke mekanismer, der kan regulere ligand diffusion. Smith og kolleger vist, at en GFP-mærket nodal (Xnr2) anvendes simpel diffusion, og ikke celle forlængelser (cytonemes) eller transcytose (ved hjælp af vesikler) til dannelse af en gradient 23.
Er mulige yderligere uddybninger af disse metoder, hvor andre proteiner, der blokerer bestemte veje kan udtrykkes i målrettede celler at undersøge, om et svar på signalering molekylet er nødvendig som et mellemled til at videresende signaler fra én celle til en anden. For eksempel udtrykker en dominant negativ activinreceptoren mellem kilden til activin og de responderende celler viste, at simpel diffusion ligand kunne fremkalde en flere cellediametre væk fra kilden eelv med ikke-responsive celler i mellem 24. Denne konklusion blev støttet af arbejde i zebrafisk, hvor vildtypeceller kan reagere på en kilde til nodal, trods bliver omgivet af ikke-responsive mutante celler, der mangler et væsentligt co-receptor for nodal 25. Andre undersøgelser har brugt zebrafisk til at undersøge diffusion af fluorescens mærkede ligander 28,29. Nogle undersøgelser har bemærket, at epitop tagging C-terminalen af Wnt proteiner kan påvirke signalaktivitet, muligvis på grund af de stærkt konserverede cysteiner, der bidrager til protein konformation. Vores tidligere arbejde har vist, at indførelse af en spacer (f.eks HA-mærket) resulterer i mærkede Wnt ligander, som er biologisk aktive 17. Det er sandsynligt, fordi afstandsstykket giver fleksibilitet nødvendig for ligand-receptor interaktion, såsom i tommelfinger-pegefinger model af Wnt-Frz binding 30.
Det næste skridt for at fremme vores studier er at inkludere en visual udlæsning for aktiveringen af signalvejen. For eksempel udtrykker GFP-mærkede Dvl 26 i celler fjernt fra kilden af ligand vil give området, hvorover Wnt11b har evne til at signalere, der skal måles. Rækken af Wnt8a signalering aktivitet kunne påvises under anvendelse af antistof-farvning til måling kernelokalisering af b-catenin i celler 27 i en afstand fra kilden. Er mulige Disse typer af eksperimenter anvendelse af teknikkerne beskrevet i dette dokument. Ved at anvende en række forskellige fluorescerende proteiner eller fluoroforer, vil et yderligere information gives, hvor man ikke kun måler fordelingen af en ligand, men også produktionen af signalvejene, og på denne måde bestemme tærsklen rækkevidde af et morfogen .
Xenopus laevis er en nyttig model til visualisering af GFP-mærkede ligander og yderligere oplysninger om de metoder, for indkøb af embryoner, mRNA syntese, mikroinjektion og dissekereion er tilgængelige 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af en BBSRC indrømmer MEP (BB / H010297 / 1), en BBSRC kvote studentship til SAR, og en MRC studentship til SWF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Melford | MB 1200 | |
| Ammonium acetate | Ambion | From Megascript SP6 Kit AM 1330 | |
| Bicarbonate | VWR International | RC-091 | |
| Calcium nitrate | Sigma | C13961 | |
| Cap analog (m7G(5')) | Applied Biosystems | AM 8050 | |
| Chloroform | Sigma | C 2432 | |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880 | |
| dNTPs | Invitrogen | 18427-013 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | O3690 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.33 | |
| Ficoll 400 | Sigma | F 4375 | |
| Fiji image J software | Free download http://fiji.sc/Fiji | ||
| Gentamycin | Melford | G 0124 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A/0400/PB17 | |
| Glass cover slips, No.1.5 | Scientific Laboratory Supplies | 22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 | |
| Glass needle puller | Narishige | Narishige PC -10 | |
| Glass pull needles | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Human chronic gonadotropin (HCG) | Intervet | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | P/7500/PB17 | |
| Lithium chloride (LiCl) | Sigma | L-7026 | |
| LSM710 and Zen software (2008-2010) | Carl Zeiss | ||
| Matlab software | Mathworks | http://uk.mathworks.com/ | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP 2819-10 | |
| Nail varnish | Boots | Bar code 3600530 373048 | |
| Spectrophotometer | Lab.tech International | ND-1000 / ND8000 | |
| Petri dish (55 mm) | VWR International | 391-0865 | |
| Phenol-chloroform | Sigma | P3803 | |
| Photoshop software | Adobe | http://www.photoshop.com/products | |
| High fidelity DNA polymerase and buffers | Biolabs | M0530S Buffer - M0531S | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P/4280/53 | |
| PVC insulation tape | Onecall | SH5006MPK | |
| Gel extraction kit | Qiagen | S28704 | |
| Restriction enzymes buffers | Roche | SuRE/CUT Buffer Set 11082 035 001 | |
| RNAse-free DNAse | Promega | ME10A | |
| Steel back single edge blades | Personna | 66-0403-0000 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | 27810.364 | |
| SP6 transcription kit | Ambion | AM1330 | |
| Glass slides | Thermo Fisher | SHE 2505 | |
| Tris base | Invitrogen | 15504-020 | |
| Tungsten needles | homemade | ||
| Zen lite software | Carl Zeiss | Free download http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html |
References
- Shen, M. M. Nodal signaling: developmental roles and regulation. Development. 134 (6), 1023-1034 (2007).
- Shimmi, O., Newfeld, S. J. New insights into extracellular and post-translational regulation of TGF-beta family signalling pathways. J Biochem. 154 (1), 11-19 (2013).
- Pownall, M. E., Isaacs, H. V. FGF Signalling in Vertebrate Development. 1, Colloquium Series on Developmental Biology. 1-75 (2010).
- Clevers, H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127 (3), 469-480 (2006).
- Ingham, P. W., McMahon, A. P. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes and Development. 15 (23), 3059-3087 (2001).
- Wolpert, L. One hundred years of positional information. Trends in Genetics. 12 (9), 359-3564 (1996).
- Rushlow, C. A., Shvartsman, S. Y. Temporal dynamics, spatial range, and transcriptional interpretation of the Dorsal morphogen gradient. Current Opinion in Genetics and Development. 22 (6), 542-546 (2012).
- Erickson, J. L. Formation and maintenance of morphogen gradients: an essential role for the endomembrane system in Drosophila melanogaster wing development. Fly (Austin). 5 (3), 266-271 (2011).
- Towers, M., Wolpert, L., Tickle, C. Gradients of signalling in the developing limb. Current Opinions in Cell Biology. 24 (2), 181-187 (2012).
- Dessaud, E., McMahon, A. P., Briscoe, J. Pattern formation in the vertebrate neural tube: a sonic hedgehog morphogen-regulated transcriptional network. Development. 135 (15), 2489-2503 (2008).
- Briscoe, J., et al. Homeobox gene Nkx2.2 and specification of neuronal identity by graded Sonic hedgehog signalling. Nature. 398 (6728), 622-627 (1999).
- Ribes, V., et al. Distinct Sonic Hedgehog signaling dynamics specify floor plate and ventral neuronal progenitors in the vertebrate neural tube. Genes and Development. 24 (11), 1186-1200 (2010).
- Freeman, S. D., Moore, W. M., Guiral, E. C., Holme, A., Turnbull, J. E., Pownall, M. E. Extracellular regulation of developmental cell signaling by XtSulf1. Developmental Biology. 320 (2), 436-445 (2008).
- Tao, Q., et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required for axis formation in Xenopus embryos. Cell. 120 (6), 857-871 (2005).
- Chamberlain, C. E., Jeong, J., Guo, C., Allen, B. L., McMahon, A. P. Notochord-derived Shh concentrates in close association with the apically positioned basal body in neural target cells and forms a dynamic gradient during neural patterning. Development. 135 (6), 1097-1106 (2008).
- Ramsbottom, S. A., Maguire, R. J., Fellgett, S. W., Pownall, M. E. Sulf1 influences the Shh morphogen gradient during the dorsal ventral patterning of the neural tube in Xenopus tropicalis. Developmental Biology. 391 (2), 207-218 (2014).
- Fellgett, S. W., Maguire, R. J., Pownall, M. E. Sulf1 has ligand dependent effects on canonical and non-canonical WNT signalling. Journal of Cell Science. 128 (7), 1408-1421 (2015).
- Dytham, C. Choosing and using statistics : A biologist's guide. , Blackwell publishing. Oxford. (2005).
- Fay, M. P., Proschan, M. A. Wilcoxon-Mann-Whitney or t-test? On assumptions for hypothesis tests and multiple interpretations of decision rules. Statistical Surveys. 4, 1-39 (2010).
- Christian, J. L., McMahon, J. A., McMahon, A. P., Moon, R. T. Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1 /int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis. Development. 111 (4), 1045-1055 (1991).
- Du, S. J., Purcell, S. M., Christian, J. L., McGrew, L. L., Moon, R. T. Identification of distinct classes and functional domains of Wnts through expression of wild-type and chimeric proteins in Xenopus embryos. Molecular and Cellular Biology. 15 (5), 2625-2634 (1995).
- Tada, M., Smith, J. C. Xwnt11 is a target of Xenopus Brachyury: regulation of gastrulation movements via Dishevelled, but not through the canonical Wnt pathway. Development. 127 (10), 2227-2238 (2000).
- Williams, P. H., Hagemann, A., Gonzalez-Gaitan, M., Smith, J. C. Visualizing long-range movement of the morphogen Xnr2 in the Xenopus embryo. Current Biology. 14 (21), 1916-1923 (2004).
- McDowell, N., Zorn, A. M., Crease, D. J., Gurdon, J. B. Activin has direct long-range signalling activity and can form a concentration gradient by diffusion. Current Biology. 7 (9), 671-681 (1997).
- Chen, Y., Schier, A. F. The zebrafish Nodal signal Squint functions as a morphogen. Nature. 411 (6837), 607-610 (2001).
- Miller, J. R., Rowning, B. A., Larabell, C. A., Yang-Snyder, J. A., Bates, R. L., Moon, R. T. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos coincides with the dorsal enrichment of dishevelled that is dependent on cortical rotation. Journal of Cell Biology. 146 (2), 427-437 (1999).
- Schohl, A., Fagotto, F. B. eta-catenin MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Muller, P., et al. Differential diffusivity of Nodal and Lefty underlies a reaction-diffusion patterning system. Science. 336, 721-724 (2012).
- Yu, S. R., Burkhardt, M., Nowak, M., Ries, J., Petrasek, Z., Scholpp, S., Schwille, P., Brand, M. Fgf8 morphogen gradient forms by a source-sink mechanism with freely diffusing molecules. Nature. 461, 533-536 (2009).
- Janda, C. Y., Waghray , D., Levin, A. M., Thomas, C., Garcia, K. C. Structural basis of Wnt recognition by Frizzled. Science. 337, 59-64 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
