Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

لالفيروسات RNA، أدلى ظهور تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف في أواخر 1970s من الممكن تحويل الجينوم RNA الفيروسي إلى استنساخ كدنا]، والتي يمكن بعد ذلك نشرها كما البلازميدات في البكتيريا للتلاعب الجيني للفيروسات RNA. 1 فيروس RNA الأول أن يكون كان جزيئيا المستنسخة الجراثيم Qβ، فيروس RNA إيجابي المنطلق الذي يصيب القولونية. البلازميد التي تحتوي على نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني Qβ أدت إلى فاجات Qβ المعدية عندما أدخلت E. القولونية. 2 بعد ذلك بوقت قصير، تم تطبيق هذه التقنية لفيروس شلل الأطفال، وهو فيروس RNA إيجابي حبلا من البشر والحيوانات. تم المعدية عند transfected البلازميد تحمل كدنا] بالطول من الحمض النووي الريبي الجيني لفيروس شلل الأطفال في خلايا الثدييات وقادرة على انتاج virions المعدية 3 في هذا النهج "التي تطلق DNA"، يجب نسخها على cDNAs المستنسخة داخل الخلية لبدء النسخ المتماثل RNA الفيروسي؛ومع ذلك، فإنه من غير الواضح كيف يتم بدء النسخ وكيف تتم معالجة النصوص إلى تسلسل الفيروسي الصحيح. وقد أدى هذا الاهتمام إلى وضع بديل "تطلق RNA" النهج، حيث يتم استنساخ نسخة كدنا] كاملة من الجينوم الفيروسي RNA تحت المروج المعترف بها من قبل E. كولاي أو فج RNA البلمرة لإنتاج الرنا الاصطناعية في المختبر مع المعرفة 5 'و 3' تيرميني، التي تخضع لدورة تكاثر الفيروس كاملة عندما قدم إلى الخلايا المضيفة. 4،5 أفيد أول نجاح مع هذا النهج للبروم فيروس الفسيفساء ، 6،7 فيروس RNA إيجابي حبلا من النباتات. ومنذ ذلك الحين، تم وضع نهج أطلقت RNA لمجموعة واسعة من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، بما في ذلك الكأسية (Caliciviruses)، alphaviruses، flaviviruses، arteriviruses، والفيروسات الإكليلية. 1،4،5،8

في كل من DNA- RNA وإطلاق أنظمة الوراثة العكسية، بناء القل طول كدنا] استنساخ هو المفتاح لتوليد الحمض النووي RNA المعدية أو من فيروسات RNA إيجابية المنطلق، ولكنه يصبح تحديا كبيرا الفني كما يزيد حجم الجينوم الفيروسي. 9-17 وعلى وجه الخصوص، الجينوم RNA كبير من ~ 10 -32 كيلوبايت تقدم ثلاث عقبات رئيسية في استنساخ [كدنا] وظيفي كامل طول. 18 وتكمن الصعوبة الأولى هي توليف [كدنا المؤمنين نسخ، لأن الإخلاص للRT-PCR يتناسب عكسيا مع طول RNA الفيروسي. العقبة الثانية هي وجود تسلسل السامة، لأن جزيئات الحمض النووي الريبي طويلة أكثر عرضة لتحتوي على تسلسلات غير متوقعة قادرة على صنع جزء كدنا] في البلازميدات غير المستقرة في E. القولونية. العدد الثالث والأكثر أهمية هو توافر ناقل مناسب، لأنه من الصعب العثور على ناقلات الاستنساخ الذي يتسع لادخال كدنا] الفيروسية> 10 كيلو بايت. على مدى العقود الثلاثة الماضية، وقد تم التغلب على هذه العقبات عن طريق العديد من التطورات في علم الإنزيمات، منهجية، وهيد vectorology. 1،4،5،8 ومن بين هؤلاء، وتطوير الواعدة والمبتكرة هي استنساخ كبيرة فيروسات RNA إيجابية حبلا الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية المعدية كما (البكالوريا). ناقلات BAC هو البلازميد-نسخة منخفضة الاستنساخ (1-2 نسخ / خلية) استنادا إلى E. عامل الخصوبة القولونية، ويبلغ متوسط ​​حجم إدراج DNA من ~ 120-350 كيلوبايت 19-21 يتم إدخال جزء الحمض النووي في ناقلات BAC بطريقة مماثلة لاستنساخ في ناقلات الاستنساخ العامة؛ ينتج عن ذلك من الحيوانات المستنسخة BAC مستقرة على مدى عدة أجيال في E. القولونية. 22،23 وحتى الآن، وقد استخدمت هذه التكنولوجيا لخلق BAC استنساخ [كدنا] المعدية ل> 10 أعضاء من ثلاث عائلات فيروس RNA إيجابية المنطلق، أي الفيروسات المصفرة، 24-29 Arteriviridae و 30 و Coronaviridae. 9،16،17 ، 31،32

باستخدام فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) كمثال، تقارير العمل الحالي الإجراءات التفصيلية التي يمكن أن تكونتستخدم لبناء كامل طول BAC المعدية مستقر وراثيا لمجموعة متنوعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا. JEV هو الفيروسة المصفرة الحيوانية 33 التي تم إرسالها في الطبيعة بين الطيور والخنازير، ويستضيف الفقاريات الآخرين من خلال البعوض الناقل. 34،35 في البشر، والعدوى JEV يمكن أن يسبب مرض عصبي التهاب الدماغ الياباني غالبا ما يكون مميتا شديد (JE)، 36 الذي يحدث في آسيا وأجزاء من غرب المحيط الهادئ، 37،38 مع حدوث سنوي يقدر ب ~ 50،000-175،000 الحالات السريرية. 39،40 الجينوم من JEV هو ~ 11 كيلو بايت، واحد الذين تقطعت بهم السبل،-بالمعنى الإيجابي جزيء RNA وتتكون من واحد إطار القراءة المفتوحة (ORF) يحيط بها اثنان مناطق غير الترميز (NCRS) في 5 'و 3' ينتهي. 41،42 وORF يشفر polyprotein التي المشقوق من قبل المضيف والبروتياز الفيروسية لتوليد 10 البروتينات الفردية، المعين C، PRM، E، NS1، NS2A، NS2B، NS3، NS4A، NS4B، وNS5 في N- إلى الاتجاه C-المحطة. 34،43،44 أيضا، عن طريق البريدوأعرب عن شكل xtended من NS1 (NS1 ') من قبل -1 frameshifting الريباسي في الكودونات 8-9 من NS2A. 45،46 من هذه البروتينات 11، والبروتينات الهيكلية الثلاثة (C، PRM، وE) ضرورية لتشكيل المعدية virions، 47،48 وثمانية البروتينات غير الهيكلية المتبقية (NS1 إلى NS5، وNS1 ') هي الحاسمة لتكاثر الفيروس RNA، والتجمع 49-51 الجسيمات، 52-56 والفطري التهرب من الحصانة. 57-59 كل 5' و 3 'NCRS تحتوي يحفظ تسلسل الابتدائية و/ هياكل التعليم العالي شكل RNA الثانوية، 60-62 التي تعتبر هامة لتحوير تكرار RNA الفيروسي. 63،64

يصف هذا البروتوكول الأدوات والأساليب والاستراتيجيات لتوليد كامل طول BAC المعدية من JEV SA 14 -14-2. يحتوي على 28 استنساخ هذا BAC الوظيفي نسخة كدنا] كاملة من الحمض النووي الريبي الجيني JEV، 65 التي تشملها المروج لالبلمرة SP6 RNA المنبعمن الفيروسية 5'نهاية وفريدة من نوعها Xba I موقع تقييد المصب من الفيروسية 3'نهاية لفي المختبر الاعادة النسخ. هذه التكنولوجيا BAC قابلة للتطبيق على بناء كدنا] استنساخ الجزيئية تعمل بكامل طاقتها لمجموعة من الفيروسات RNA إيجابية حبلا.

Protocol

ملاحظة: يعرض الشكل 1 استراتيجية لبناء كامل طول المعدية JEV كدنا] باعتباره BAC يوفر 28 الجدول 1 قائمة أليغنوكليوتيد] المستخدمة في هذا البروتوكول 28.

1. استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسي من JEV الجسيمات في الخلية الثقافة Supernatants

  1. نبدأ مع مستنبت الخلية التي تحتوي JEV SA 14 -14-2، وهو فيروس اللقاح JE الحية التي يتطلب السلامة الأحيائية المستوى 2 الاحتواء.
    ملاحظة: عيار الفيروسي حوالي 1-3 × 10 6-تشكيل لوحة وحدة / مل.
  2. خذ التدريب في مجال السلامة الأحيائية ضروري لجميع الممارسات القياسية الميكروبيولوجية، ومعدات السلامة، ومرافق المختبرات قبل العمل مع JEV SA 14 -14-2.
  3. تنقية RNA الفيروسي من قسامة من مستنبت الخلية التي تحتوي على الفيروس باستخدام محلول الطور من الفينول وغوانيدين ثيوسيانات 66 (الشكل 1A).
    1. ميلاديد 600 ميكرولتر من كاشف الطور إلى 200 ميكرولتر من طاف الثقافة في 1.7 مل microtube. تجانس الخليط باليد يهز الأنبوب بقوة لمدة 30 ثانية واحتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    2. إضافة 160 ميكرولتر من كلوروفورم على عينة متجانسة. تخلط جيدا باليد يهز الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية وتركها لمدة 2-3 دقيقة في RT.
    3. الطرد المركزي المحللة الكلي في 13400 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، مما يؤدي الى الفصل بين مرحلتين السائلة، أي مرحلة العضوية أقل والمرحلة المائية العليا. نقل المرحلة المائية العليا (أقل من 200 ميكرولتر) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي لmicrotube الجديد.
    4. ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 1 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / الجليكوجين ميكرولتر و 400 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول واحتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. الطرد المركزي الخليط في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تجاهل طاف ويغسل بيليه RNA مع 1 مل من الايثانول 75٪ التي كتبها نبض vortexing ل04:57مرات والطرد المركزي في 13400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. الهواء الجاف بيليه RNA لمدة 10 دقيقة وحله في 40 ميكرولتر من 2 درهم O. تخزين الحمض النووي الريبي المستخرج في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. توليف مجموعة من أربعة تداخل كدنا] شظايا (F1 إلى F4) ويمتد على كامل الجينوم الفيروسي RNA التي كتبها عكس النسخ (RT) -PCR

  1. إجراء 20 ميكرولتر RT رد فعل مع قسامة 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفيروسي النقي كقالب وشكل معدل من فيروس اللوكيميا مولوني الفئران الناسخ العكسي 67
    1. إعداد مزيج 13 ميكرولتر تحتوي على 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المنقى، 1 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP، 1 ميكرولتر 4 بمول / ميكرولتر التمهيدي، و 1 ميكرولتر درهم 2 O. استخدام التمهيدي جزء معين لكل رد فعل RT: 1RT لF1، F2 2RT ل، 3RT لF3، F4 و4RT ل.
    2. احتضان الخليط عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، ومكان على الجليد لمدة 1 دقيقة، ثم السريعة تدور لجمع كونتياليلة في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. إضافة 4 ميكرولتر 5 × RT العازلة، 1 ميكرولتر 0.1 M DTT 1 ميكرولتر 40 U / ميكرولتر ريبونوكلياز المانع، و1 ميكرولتر 200 U / ميكرولتر عكس الناسخ. مزيج من قبل pipetting صعودا وهبوطا 3-5 مرات.
    4. السماح للرد فعل المضي قدما عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم وقف نشاط حرارة العينة على 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. تخزين تصنيعه [كدنا حبلا لأول مرة في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إجراء 100 ميكرولتر PCR تفاعل مع قسامة 5 ميكرولتر من الحرارة المعطل RT رد فعل كقالب وعالية الدقة DNA بالحرارة البلمرة 68 (الشكل 1B).
    1. إعداد 100 ميكرولتر PCR رد فعل على الجليد، تحتوي على 5 ميكرولتر من رد فعل RT، 20 ميكرولتر 5 × PCR العازلة، 4 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP، 5 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام، 5 ميكرولتر 10 ميكرومتر التمهيدي العكسي، 1 ميكرولتر 2 U / البلمرة DNA ميكرولتر و 60 ميكرولتر درهم 2 O. استخدام الزوج التمهيدي جزء معين لكل reactio PCRن: 1F + 1R لF1 (2573 سنة مضت)، 2F + 2R لF2 (4171 سنة مضت)، 3F + 3R لF3 (3922 بي بي)، و4F + 4R لF4 (1798 سنة مضت).
    2. المزيج بلطف أنبوب التقليب إصبع 3-5 مرات وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع محتوياته في الجزء السفلي.
    3. تبدأ الحراري thermocycling مع خطوة تمسخ الأولية من 30 ثانية في 98 ° C، تليها 25-30 دورات مع ملف PCR التالية: 10 ثانية عند 98 ° C، 30 ثانية في 60 ° C، و1-2 دقيقة (30 ثانية / كيلوبايت) عند 72 درجة مئوية. تخزين المنتجات PCR في 4 درجات مئوية حتى تحليلها.
  3. تشغيل قسامة 2-5 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على هلام الاغاروز 0.8٪ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل إيثيديوم بروميد (EtBr) (الشكل 2).
    تنبيه: EtBr هو المغير قوي ويتطلب معاطف معمل، ونظارات السلامة، وقفازات إلى أن ترتديه والحذر الشديد التي يتعين مراعاتها أثناء استعمالها وتخزينها والتخلص منها.

3. Subclone كل واحد من أربعة أجزاء كدنا] (F1 إلى F4) إلى ناقل BAC إنشاء pBAC / F1 إلى pBAC / F4 بتقنيات الاستنساخ الجزيئي ذ

  1. هضم ناقلات وإدراج السلطات الوطنية المعينة مع اثنين من نوكليازات الاقتطاع الداخلية المناسبة، على النحو التالي:
    1. إجراء عملية الهضم متتابعة من pBAC / PRRSV / FL (ناقلات)، 30 مشتق من البلازميد pBeloBAC11 (7507 سنة مضت، بنك الجينات عدد الانضمام U51113)، مع PME الأول وليس لي في الحجم الكلي لل60 ميكرولتر (التي تحتوي على ~ 500 DNA نانوغرام ، 10 U الانزيم، عازلة الهضم 1X و 1 × BSA) عند 37 درجة مئوية لمدة 12-15 ساعة، والتي ينتج متجه جزء 15426-BP.
    2. إجراء عملية الهضم متسلسل لكل من amplicons كدنا] أربعة (إدراج) مع سعد محمد الأول وليس لي في الحجم الكلي لل60 ميكرولتر (التي تحتوي على ~ 1 ميكروغرام DNA، 20 U الانزيم، 1 × العازلة الهضم، و1 × BSA) في 25 ° C (SMA I) أو 37 درجة مئوية (لا I) عن 12-15 ساعة، والتي ينتج شظايا إدراج التالية من الحجم المطلوب: F1 (2559 سنة مضت)، F2 (4157 سنة مضت)، F3 (3908 بي بي)، و F4 (1784 سنة مضت).
  2. تنقيةالمطلوب النواقل وإدراج شظايا الحمض النووي عن طريق استخراج الهلام.
    1. فصل المنتجات هضمها بشكل مضاعف على 1٪ منخفضة ذوبان نقطة هلام الاغاروز تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr. قطع عصابة من جزء الحمض النووي المطلوب مع الحد الأدنى من الاغاروز (عادة ~ 200 ميكرولتر) تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة.
    2. إضافة حجم مساو من العازلة TEM (10 ملي تريس، الكلور، 1 ملم EDTA، و 10 ملي MgCl 2) إلى رفعه الاغاروز في 1.7 مل microtube. احتضان العينة على 72 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة، مع vortexing لكل 2-3 دقائق حتى قد ذاب تماما agarose.
    3. إضافة حجم مساو من قبل تحسنت المشبعة العازلة الفينول، دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT.
      ملاحظة: الخليط يفصل في المرحلة العضوية أقل والمرحلة المائية العليا. نقل المرحلة المائية العلوية التي تحتوي على الحمض النووي لmicrotube الجديد.
    4. إضافة حجم مساو من كلوروفورم: الكحول أيزو أميلي (24: 1)، دوامة لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي في 13،400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT. نقل المرحلة المائية العليا لmicrotube الجديد.
    5. إضافة 0.5 ميكرولتر من 10 ميكروغرام الحمض الريبي النووي النقال الخميرة / ميكرولتر، 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم، و 2.5 أحجام من الإيثانول بنسبة 100٪. الحفاظ على الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
    6. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة طاف ويغسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الايثانول 70٪ التي كتبها نبض vortexing لثلاث إلى خمس مرات والطرد المركزي في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة.
    7. الهواء الجاف بيليه الحمض النووي لمدة 10 دقيقة وحله في 20 ميكرولتر من TE العازلة (10 ملي تريس الكلورين و1 ملم EDTA [الرقم الهيدروجيني 7،6]).
  3. Ligate ناقلات المطلوب وإدراج شظايا الحمض النووي باستخدام T4 DNA يغاز.
    1. انشاء 20 ميكرولتر ربط رد فعل تحتوي على 50-100 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات، فائض المولي ~ 3 أضعاف من الحمض النووي إدراج، 400 U T4 DNA يغاز، و1 × ربط العازلة. احتضان رد فعل ربط على 16 درجة مئوية لمدة 12-15 ساعة.
      ملاحظة: وتشمل مقاولات سلبيرد فعل رأ، أي متجه فقط دون إدراج، في نفس الوقت.
    2. أداء أربع عمليات ربط منفصلة، ​​كل بالانضمام إلى 15426-BP PME I- ليس أنا جزء من pBAC / PRRSV / FL لدى بي بي 2559 (لF1)، 4157-BP (لF2)، 3908-BP (لF3)، أو 1784-بي بي (لF4) سعد محمد I- ليس أنا جزء واحد من amplicons كدنا] أربعة، لتوليد subclones pBAC / F1 إلى pBAC / F4.
  4. تحويل الحمض النووي ligated إلى E. القولونية DH10B بواسطة الأسلوب صدمة -heat CaCl 2.
    1. خذ 100 مكل من CaCl 2 المعالجة بالإثير خلايا DH10B المختصة 69 المخزنة في -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد لهم على الجليد.
      ملاحظة: استخدم 100 ميكرولتر من الخلايا في التحول.
    2. إضافة قسامة 10 ميكرولتر من رد فعل ربط الحمض النووي ل100 ميكرولتر من الخلايا إذابة في 1.7 مل microtube، المزيج بلطف من خلال الاستفادة من أنبوب، والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة.
    3. للحرارة صدمة الخليط خلايا الحمض النووي لمدة 45 ثانية في 42 ° C واحمام ثالثا، مكان على الجليد لمدة 2 دقيقة، ثم قم بإضافة 900 ميكرولتر من مرق LB قبل استعد لRT.
    4. احتضان الخلايا للحرارة صدمت في 35 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، مع اهتزاز عند 225-250 دورة في الدقيقة.
    5. نشر 50-200 مكل من الخلايا المستزرعة على لوحات أجار LB تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CML). الحفاظ على لوحات في RT، الجانب الأيمن تصل، حتى تكون جافة.
    6. تحويل لوحات رأسا على عقب واحتضان عند 35 درجة مئوية لمدة 15 ساعة.
  5. استرداد DNA BAC المستنسخة من الخلايا المضيفة على طريقة تنقية القائم على العمود (الشكل 1C).
    1. اختيار ستة إلى ثمانية المستعمرات البكتيرية من لوحات أجار LB-دم مزمن وتلقيح لهم في 3 مل من مرق 2xYT تحتوي على 10 ميكروغرام / مل دم مزمن. احتضان الثقافات في 35 درجة مئوية لمدة 10 ساعة مع الهز قوي (225-250 دورة في الدقيقة).
    2. عزل المؤتلف BAC السلطات الوطنية المعينة 1-1،5 مل من الثقافات البكتيرية باستخدام أعمدة الدوران، وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة. 70 أزل الحمض النووي المستخرج (typiأتوماتيكيا 100-200 نانوغرام) في 20 ميكرولتر من TE العازلة.
    3. إجراء عمليتين التحليلية الهضم انزيم تقييد البكالوريا معزولة عن ~ 6 ساعات في حجم ما مجموعه 10 ميكرولتر، واحدة لتحديد وجود ناقلات مع ادخال الصحيح باستخدام نفس الإنزيمات المستخدمة في الاستنساخ (انظر بروتوكول 3.1)، والآخر لاختبار سلامة البكالوريا المستنسخة مع انزيم المناسب (على سبيل المثال، BGL II، I ضابط صف، أو توقيت المحيط الهادي I)، وتوليد نمط تقييد جزء فريد من نوعه.
    4. نشر البكالوريا المستنسخة بشكل صحيح، فحقن 500 ميكرولتر من الثقافات الإيجابية البكتيرية (من البروتوكول 3.5.1) في 500 مل من 2xYT-دم مزمن المتوسطة وزراعة اللقاح لمدة 6 ساعة عند 35 درجة مئوية في حين تهتز على 225-250 دورة في الدقيقة. تنقية BAC DNA (عادة 10-20 ميكروغرام) من الثقافة 500 مل باستخدام أعمدة التصفية، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة. 71
      ملاحظة: أربعة subclones BAC الأولية، تحتوي كل منها على جزء كدنا] من JEV RNA الجيني، قد يثبت أن يكون علىه أو تحور أكثر غير مرغوب فيها (الصورة) بالمقارنة مع تسلسل إجماع الجينوم الفيروسي 42 (والتي هي بمثابة تسلسل المرجعية). تحتاج أي طفرة من هذا القبيل إلى تصحيحها عن طريق PCR القائم الطفرات موقع الموجه قبل تجميع كامل طول JEV كدنا]. 27

4. إنشاء كامل طول JEV كدنا] مع 5 'SP6 المروج و3' الإعادة الموقع

  1. جعل ثلاثة تعديلات وراثية (انظر أدناه البروتوكولات 4.1.1-4.1.3) في cDNAs المستنسخة للسماح في المختبر الاعادة نسخ من الرنا الجينوم طول مع أصيلة 5 'و 3' ينتهي من الجينوم الفيروسي.
    1. إدخال المروج SP6 المنبع مباشرة من 5 'نهاية الجينوم الفيروسي بالتالي تداخل PCR (الشكل 1D، pBAC / F1 SP6).
      1. تضخيم اثنين متداخلة شظايا الحمض النووي عن طريق أول PCR القياسية من pBAC / F1 مع اثنين من أزواج التمهيدي SP6F + SP6R (حجم المنتج، 173 بي بي) وF1F + F1R (ق المنتجإيزي، 676 بي بي)، كل في رد فعل 50 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر قالب الحمض النووي (~ 200 غ / ميكرولتر)، و 10 ميكرولتر 5 × PCR العازلة، 2 ميكرولتر 10 ملي dNTPs، 2.5 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس الاشعال، 0.5 ميكرولتر 2 U / ميكرولتر البلمرة DNA و 68 و 31.5 ميكرولتر درهم 2 O. أداء PCR باستخدام ملف التعريف الدراجات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 25 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية.
      2. هلام تنقية اثنين شظايا الحمض النووي PCR تضخيم بعد تشغيل كل من اثنين من المنتجات PCR على 1.5٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز هلام، كما هو موضح في بروتوكول 3.2.
      3. دمج اثنين من شظايا الحمض النووي تنقيته هلام عن طريق الانصهار الثاني PCR باستخدام بادئات SP6F الأبعد + F1R (حجم المنتج، 821 بي بي) في تفاعل 100 ميكرولتر بما في ذلك 1 ميكرولتر كل اثنين من شظايا الحمض النووي النقاء (~ 100 غ / ميكرولتر)، 20 ميكرولتر 5 × العازلة PCR، 4 ميكرولتر 10 ملي dNTPs، 5 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس الاشعال، 1 ميكرولتر2 U DNA / ميكرولتر بوليميريز و 68 و 63 ميكرولتر درهم 2 O. استخدام البيانات الشخصية التالية الحرارية ركوب الدراجات: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 25 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
      4. هلام تنقية PCR amplicon تنصهر من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز هلام، كما هو موضح في بروتوكول 3.2.
      5. تنفيذ الإجراء استنساخ خمس خطوات وصفها في البروتوكولات 3،1-3،5 لligate 760-BP جزء باك I- BSI WI من هلام تنقية تنصهر PCR amplicon مع 9532-BP جزء باك I- BSI WI من pBAC / F1 لتوليد pBAC / F1 SP6.
    2. إزالة القائمة من قبل، داخلي موقع Xba أنا في النوكليوتيدات 9131 عن طريق إدخال طفرة نقطة الصامتة (A 9134 → T) عن طريق تمديد تداخل PCR (الشكل 1D، pBAC / F3 KO).
      1. تضخيم اثنين متداخلة شظايا الحمض النووي عن طريق أول PCR القياسية من pBAC / F3 مع اثنين من أزواج التمهيدي X1F + X1R(حجم المنتج، 746 بي بي) وX2F + X2R (حجم المنتج، 316 بي بي) في رد فعل 50 ميكرولتر تحت ظروف تجريبية وصفها في بروتوكول 4.1.1.1.
      2. هلام تنقية اثنين شظايا الحمض النووي PCR تضخيم بعد الانفصال الكهربي على 1.5٪ الهلام منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز، كما هو مفصل في البروتوكول 3.2.
      3. دمج اثنين من شظايا الحمض النووي تنقيته هلام عن طريق الانصهار الثاني PCR باستخدام X1F الاشعال الأبعد + X2R (حجم المنتج، 1033 بي بي) في 100 ميكرولتر رد فعل في ظل الظروف التجريبية وصفها في بروتوكول 4.1.1.3.
      4. هلام تنقية PCR amplicon تنصهر من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز هلام، كما هو مفصل في البروتوكول 3.2.
      5. تنفيذ الإجراء استنساخ خمس خطوات وصفها في البروتوكولات 3،1-3،5 لligate على 949-BP ابر II- ليس أنا جزء من هلام تنقية تنصهر PCR amplicon مع 16245-BP ليس I- BSI WI و 2141-BP BSI W I - شظايا ابر الثاني من pBAC / F3 لإنتاج pBAC / F3 KO.
      </ لى>
    3. مهندس Xba الاصطناعي الجديد أركض خارج الموقع فقط المصب من نهاية 3 'من الجينوم الفيروسي عن طريق PCR القائم موقع الموجه الطفرات (الشكل 1D، pBAC / F4 RO).
      1. توليد جزء DNA واحدا تلو PCR من pBAC / F4 مع الاشعال ROF + ROR (حجم المنتج، 324 بي بي) في تفاعل 100 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكرولتر قالب الحمض النووي (~ 200 غ / ميكرولتر)، و 20 ميكرولتر 5 × PCR العازلة، 4 ميكرولتر 10 ملي dNTPs، 5 لكل واحد من 10 ميكرومتر إلى الأمام ميكرولتر وعكس الاشعال، 1 ميكرولتر 2 U / ميكرولتر البلمرة DNA و 68 و 64 ميكرولتر درهم 2 O. أداء PCR باستخدام ملف التعريف الدراجات التالية: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 25 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية لمدة 15 ثانية.
      2. هلام تنقية جزء DNA PCR تضخيم من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز هلام، كما هو مفصل في البروتوكول 3.2.
      3. تنفيذ الإجراء استنساخ خمس خطوات وصفها في البروتوكولات 3،1-3،5 لligate 283-BP SFI I- Nبعد التمديد أنا جزء من هلام تنقية PCR amplicon مع 16933-BP SFI I- ليس أنا جزء من pBAC / F4 لخلق pBAC / F4 RO.
  2. تجميع مجموعة من أربعة المعدلة، وتداخل cDNAs إلى واحد كامل طول SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) من خلال الانضمام في ثلاثة مواقع تقييد الطبيعي (فرقة البحث GI، بام مرحبا، وأنا افا ) بطريقة متسلسلة باستخدام الخطوة خمس سنوات استنساخ الإجراءات المفصلة في البروتوكولات 3،1-3،5 (الشكل 1E): F1 SP6 → F1 F2 SP6 (بالاستعاضة عن فرقة البحث G I- ليس أنا جزء من pBAC / F1 SP6 مع أن من pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (عن طريق استبدال بام H I- ليس أنا جزء من pBAC / F1 F2 SP6 مع أن من pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (عن طريق استبدال افا I- ليس أنا جزء من pBAC / F1 F2 SP6F3 KO مع أن من pBAC / F4 RO).

5. إعداد عالية النقاء ماكسي الإعدادية من كامل طول SA 14 -14-2 BAC

  1. تنمو مستعمرة واحدة من E. القولونية DH10B تحمل pBAC / SA 14 -14-2 في 3 مل من مرق 2xYT تحتوي على 10 ميكروغرام / مل دم مزمن لمدة 10 ساعة على 35 درجة مئوية مع اهتزاز عند 225-250 دورة في الدقيقة، ومن ثم الارتقاء، فحقن 500 ميكرولتر من 10 ساعة ثقافة البكتيرية إلى 500 مل من 2xYT-دم مزمن المتوسطة وزراعة اللقاح لمدة 6 ساعة عند 35 درجة مئوية مع اهتزاز قوي.
  2. الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في غضون 250 مل الزجاجات على 3107 × ز لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. resuspend كل بيليه في 30 مل من GTE حل (50 ملي الجلوكوز، 25 ملي تريس، الكلور، و 10 ملي EDTA [الرقم الهيدروجيني 8.0])، ثم قم بإضافة 500 ميكرولتر من 60 ملغ / مل الليزوزيم. احتضان تعليق خلية اثنين على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  3. إضافة 60 مل من تقدم طازجة حل تحلل (0.2 N هيدروكسيد الصوديوم و 1٪ SDS) إلى كل تعليق الخلية، وتخلط جيدا حتى واضح، والحفاظ على لست]في RT لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 45 مل من محلول تحييد (100 مل، وتتألف من 60 مل 5 M خلات البوتاسيوم، 11.5 مل الجليدية حمض الخليك، و 28.5 مل درهم 2 O) لكل زجاجة، مزيج دقيق من قبل قلب الزجاجات، واحتضان لست] تحييد على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  5. أجهزة الطرد المركزي في تحييد لست] في 18566 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل طاف كل من الزجاجات إلى قسمين الجديدة 250 مل الزجاجات. إضافة 0.6 حجم 100٪ الأيزوبروبانول لكل، والاحتفاظ بها على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  6. تدور أسفل رواسب في 18566 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. حل كل بيليه في 5 مل من TE العازلة، الجمع بينهما في أنبوب 50 مل (المجموع 10 مل)، وترسيب الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة حجم مساو من 5 M كلوريد الليثيوم. احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  7. الطرد المركزي يعجل الحمض النووي الريبي في 14636 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. طاف لنقل أنبوب جديد 250 مل ويعجل الحمض النووي عن طريق إضافة 2 مجلدات من 100٪ الأيزوبروبانول.احتضان الخليط على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  8. تدور باستمرار يعجل DNA في 18566 × ز لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح طاف، resuspend الكرية DNA في 9.5 مل من TE العازلة (درجة الحموضة 7.6)، وإضافة 10 غرام من كلوريد السيزيوم (CSCL) و 390 ميكرولتر من 10 ملغ / مل EtBr.
  9. تحميل حل الحمض النووي CSCL-EtBr في أنبوب البولي بروبلين 16 × 76 مم اغلاقها باحكام باستخدام حقنة مزودة إبرة 18 G. تدور التدرج CSCL مختومة في نابذة فائقة السرعة في 401700 × ز لمدة 16 ساعة على 20 ° C (الشكل 3).
  10. جمع الفرقة DNA من BAC البلازميد من التدرج CSCL باستخدام إبرة G 18 لإنشاء تنفيس الهواء في الجزء العلوي من التدرج و 20 G-مجهزة إبرة حقنة لاسترداد DNA BAC من جانب التدرج.
  11. إضافة 2.5 أحجام درهم 2 O-المشبعة بيوتانول لعينة من الحمض النووي BAC EtBr الملون ومزيج من قبل vortexing. الطرد المركزي الخليط في 13400 × ز لمدة 1 دقيقة ونقل المرحلة المائية السفلى لجديد 1.7 مل هيئة التصنيع العسكريrotube. كرر هذا الإجراء ست مرات.
  12. ترسيب الحمض النووي BAC مجانا EtBr عن طريق إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم و 2.5 حجم الإيثانول بنسبة 100٪ على الحمض النووي المستخرج BAC-بيوتانول واحتضان لمدة 10 دقيقة على الجليد. الطرد المركزي يعجل في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة، ويغسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الايثانول 70٪، وإعادة بيليه من قبل الطرد المركزي.
  13. الهواء الجاف بيليه الحمض النووي لمدة 10 دقيقة وحلها في 200 ميكرولتر من TE العازلة (درجة الحموضة 7.6).
    ملاحظة: يبين الشكل 4 لمحة عامة عن نظام الوراثة العكسية لJEV SA 14 -14-2.

6. إكتب الرنا الاصطناعية في المختبر من كامل طول DNA JEV BAC خطي

  1. أداء نطاق واسع انزيم الهضم تقييد pBAC / SA 14 -14-2 مع Xba أنا في إجمالي حجم 100 ميكرولتر (التي تحتوي على 3 ميكروغرام DNA، 60 U الانزيم، 1 × الهضم العازلة، و1 × BSA) عند 37 درجة C مدة 12-15 ساعة. دراسة قسامة 3 ميكرولتر من درد فعل igestion على هلام الاغاروز 0.8٪ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr.
  2. احتضان رد فعل الهضم أيضا مع 25 U من مونج الفول نوكلياز (MBN) عند 30 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (الشكل 4A).
  3. جعل حجم عينة MBN المعاملة Xba I هضمها تصل إلى 300 ميكرولتر مع DH 2 O. إضافة حجم مساو من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1) على عينة الواحد، دوامة بقوة لمدة 1 دقيقة، وتدور في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة، ثم نقل المرحلة المائية العلوية إلى الجديدة 1.7 مل microtube. إضافة حجم مساو من كلوروفورم وكرر الإجراء استخراج.
  4. استرداد الفينول / استخراج الكلوروفورم، BAC خطي من قبل هطول الأمطار الإيثانول: إضافة 10/01 حجم 3 M خلات الصوديوم و 2.5 حجم الإيثانول بنسبة 100٪، واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة. الطرد المركزي يعجل في 13400 × ز لمدة 10 دقيقة، ويغسل بيليه الحمض النووي مع 1 مل من الايثانول 70٪، ثم تدور عليه من خلال إعادة الطرد المركزي.
  5. الهواء الجاف وبيلي DNAتي لمدة 10 دقيقة وحله في 30 ميكرولتر من 2 درهم O. دراسة قسامة 1 ميكرولتر من BAC تعافى على 0.8٪ agarose هلام مع 0.5 ميكروغرام / مل EtBr (الشكل 5A).
  6. إجراء النسخ جولة الاعادة من الحمض النووي BAC خطي في الحجم الكلي لل25 ميكرولتر (التي تحتوي على ~ 200 نانوغرام قالب DNA، 0.8 ملي سقف التناظرية [م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') A]، 1 ملم rNTPs، 40 U ريبونوكلياز المانع، 20 U SP6 RNA البلمرة و 72 و 1 × العازلة النسخ) عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الشكل 4B). تشمل 0.5 ميكرومتر [3 H] UTP لالكمي RNA على أساس [3 H] UTP التأسيس، كما رصدتها الامتزاز على الورق DE-81 مرشح. 69
  7. تشغيل قسامة 1-2 ميكرولتر من رد فعل النسخ الاعادة على هلام الاغاروز 0.6٪ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل EtBr (الشكل 5B).

7. تحديد RNA العدوى والفيروسات الغلة

  1. زراعة BHK-21 الخلايا في 150 مم cultuإعادة الأطباق في كثافة 3 × 10 6 خلية / طبق لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: الحفاظ على BHK-21 ألفا الخلايا في الحد الأدنى من المتوسط ​​الضروري أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 2 ملي الجلوتامين، والفيتامينات، والبنسلين / الستربتومايسين.
  2. شطف أحادي الطبقة الخلية مع 10 مل من البرد الحل ألف (137 ملي كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 8.1 ملي نا 2 هبو 4، و 1.5 مم KH 2 PO 4). فصل الخلايا من الأطباق عن طريق العلاج مع 4 مل من التربسين-EDTA (0.25٪)، وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 270 × ز في أجهزة الطرد المركزي سطح المكتب لمدة 2 دقيقة.
  3. resuspend الكرية الخلية مع 50 مل من البرد الحل (أ) في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي تعليق خلية في 270 × ز لمدة 2 دقيقة. كرر هذا الإجراء يغسل ثلاث مرات؛ بعد غسل الماضي، resuspend الكرية خلية في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 7 خلية / مل في سول A.
  4. مزيج قسامة 400 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 2 μغرام من RNA الاصطناعية في 2 ملم الفجوة كفيت، وعلى الفور electroporate الخليط مع electroporator تحت الظروف المثلى Electroporation لل: طول 980 V، 99 μsec النبض، و 5 البقول (الشكل 4C).
    ملاحظة: استخدم 3-المسمى H RNA توليفها في بروتوكول 6.5 مباشرة ل electroporation دون مزيد من التنقية.
  5. ترك الخلايا electroporated في RT لمدة 10 دقيقة، ونقل إلى 1.7 مل microtube تحتوي على 600 ميكرولتر من اكتمال مستنبت.
  6. إعداد التخفيف المتسلسل 10 أضعاف الخلايا electroporated في 1 مل من مستنبت وصفيحة قسامة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على الطبقات الوحيدة من unelectroporated BHK-21 الخلايا (5 × 10 5) في لوحة 6 جيدا.
  7. بعد 4-6 ساعة من الحضانة، وتراكب الخلايا مع 0.5٪ الاغاروز في الحد الأدنى من المتوسط ​​أساسيا تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. احتضان لوحات لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  8. تصور وسط المعديةالصورة (لويحات) من خلال تثبيت مع 7٪ الفورمالديهايد وتلطيخ مع 1٪ الكريستال البنفسجي في 5٪ من الإيثانول 27 (الشكل 6A).
    1. اختياري: فحص خلايا electroporated RNA في 18-20 ساعة بعد ترنسفكأيشن لJEV البروتين التعبير المقايسات المناعي 27،73 (الشكل 6B)، وحصاد supernatants من الخلايا electroporated RNA في 22 و 40 ساعة بعد ترنسفكأيشن للفيروس المعايرة عن طريق فحوصات البلاك 27،63 (الشكل 6C).

Representative Results

لجميع فيروسات RNA إيجابية المنطلق، موثوقية وكفاءة نظام الوراثة العكسية تعتمد على الاستقرار الجيني للاستنساخ كامل طول كدنا]، التي تتابع ما يعادل تسلسل إجماع RNA الجيني الفيروسي. ويبين الشكل 1 27 خمس خطوة استراتيجية لبناء كدنا] المعدية طول كامل كما BAC لJEV SA 14 -14-2 28: الخطوة 1، تنقية RNA الفيروسي من طاف ثقافة الخلية من JEV المصابة BHK-21 الخلايا (الشكل 1A)؛ الخطوة 2، تركيب أربعة amplicons كدنا] متداخلة (F1 إلى F4) تغطي كامل الجينوم الفيروسي (الشكل 1B). الخطوة 3، subcloning كل من أربعة أجزاء كدنا] متجاورة في ناقلات BAC، وخلق pBAC / F1 إلى pBAC / F4 (الشكل 1C)؛ خطوة 4، وتعديل cDNAs المستنسخة في المختبر الاعادة النسخ مع SP6 بوليميريز RNA، أي وضع SP6تسلسل المروج المنبع مباشرة من الفيروسية 5'نهاية (pBAC / F1 SP6)، والقضاء على موجود مسبقا الداخلي موقع Xba أنا في النوكليوتيدات 9131 عن طريق إدخال طفرة نقطة الصامتة، A 9134 → T (pBAC / F3 KO)، وإدراج وXba الاصطناعي الجديد I موقع الاعادة المصب على الفور من الفيروسية 3'نهاية (pBAC / F4 RO) (الشكل 1D)؛ والخطوة 5، والتجمع من كامل طول SA 14 -14-2 كدنا] BAC، pBAC / SA 14 -14-2 (الشكل 1E). ويبين الجدول 1 [أليغنوكليوتيد المستخدمة في هذا الإجراء الاستنساخ 28

لبناء وظيفية JEV كدنا]، فإن الخطوة الهامة الأولى هي تجميع للأربع شظايا [كدنا متداخلة باستخدام RNA الفيروسي النقي كنموذج لRT-PCR الشكل 2 يوفر نتيجة ممثل لأربعة منتجات RT-PCR التي كانت electrophoresed على 0.8٪هلام الاغاروز. يوضح هذا الجل بوضوح أن كامل طول JEV [كدنا يتم تضخيمه إلى أربعة أجزاء كدنا] متداخلة. في بعض الأحيان، وردود الفعل RT-PCR قد تسفر عن واحد أو أكثر إضافية الفيروس محددة أو غير محددة المنتجات التي هي في معظمها أصغر من المنتج المتوقع، بسبب الصلب غير محدد من التمهيدي خلال كدنا] التوليف / التضخيم. من ناحية أخرى، فإن القليل أو لا يتوقع أن يتم تضخيم المنتج RT-PCR بسبب تلوث ريبونوكلياز عرضي خلال عزل الحمض النووي الريبي الفيروسية أو غير لائق أداء RT-PCR.

الخطوة الرئيسية التالية هي استنساخ وتعديل كامل طول partial- أو JEV كدنا] في BAC، وهو إجراء بسيط نسبيا الذي يستخدم تقنيات الحمض النووي المؤتلف القياسية. ويعرض 69 الشكل 3 نتائج تمثيلية لتنقية استنساخ BAC تحتوي على [كدنا] بالطول من JEV SA 14 -14-2 التي كتبها النطاقات في التدرج CSCL-EtBr.في هذه التجربة، وبعد الطرد المركزي لمدة 16 ساعة على 401700 × ز، شريطين متميزة، أي E. القولونية DNA الكروموسومات أعلاه، وsupercoiled BAC DNA البلازميد أدناه، مرئية في منتصف الأنبوب تحت الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة. A الحد الأدنى من حجم (~ 400 ميكرولتر) لانخفاض الفرقة DNA BAC جمعت بعناية من قبل بدس حفرة مع حقنة على جانب الأنبوب. وفي وقت لاحق، تم استخراج EtBr من الحمض النووي BAC عن طريق استخراج بيوتانول، وتركزت BAC DNA خالية من EtBr من قبل هطول الأمطار الإيثانول.

والخطوة الأخيرة هي تحديد العدوى محدد من الرنا الاصطناعية كتب في المختبر من كامل طول SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) بعد ترنسفكأيشن RNA في الخلايا متساهلة (الشكل 4). وتنطوي هذه الخطوة ثلاث خطوات متتابعة: الخطوة 1، الخطية من كامل طول SA 14 -14-2 كدنا] في '3-end من الجينوم الفيروسي (الشكل 4A)؛ الخطوة 2، وإنتاج الرنا الاصطناعية من كدنا] خطي من قبل جولة الاعادة النسخ (الشكل 4B)؛ والخطوة 3، والإنقاذ من الفيروسات المؤتلف في BHK-21 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مع الرنا الاصطناعية (الشكل 4C). تجريبيا، وخطي اثنين من الحيوانات المستنسخة مستقلة pBAC / SA 14 -14-2 مع Xba I الهضم وتعامل مع MBN لإزالة أربعة قاعدة-5 "فيض الناتجة عن Xba I الهضم. تم تنظيف البكالوريا خطي من قبل استخراج الفينول كلوروفورم، تليها هطول الأمطار الإيثانول. وقد أظهرت الخطية من اثنين من البكالوريا النقاء على هلام الاغاروز 0.8٪ (الشكل 5A). ويجب أن يتم استخراج الفينول كلوروفورم بعناية للتأكد من أن البكالوريا خطي خالية من ريبونوكلياز. كل واحد من اثنين من البكالوريا خطي بمثابة قالب [كدنا عن النسخ الاعادة باستخدام SP6 بوليميريز الحمض النووي الريبي في وجود م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') A التناظرية الغطاء. وقد تبين سلامة الرنا الاصطناعية عن طريق تشغيل aliquots من اثنين من الخلائط رد فعل النسخ على هلام الاغاروز 0.6٪، جنبا إلى جنب مع إشارة 1 كيلوبايت DNA سلم (الشكل 5B). وفي هذا الاختبار البسيط، والفرقة الرئيسية RNA بارز هاجر دائما فقط أقل من 3 كيلو بايت مرجع الفرقة DNA ويبدو أن حادة. ومع ذلك، تدهورت سيكون RNA لها مظهر طخت على نفس هلام.

مركز الفحص المعدية هو المعيار الذهبي لتحديد العدوى محدد من الرنا الاصطناعية. وقد تم هذا الاختبار من قبل electroporating BHK-21 الخلايا مع عينات الحمض النووي الريبي، بذر قسامات متساوية للأضعاف 10 المخفف متسلسل خلايا electroporated في 6 لوحات جيدة تحتوي على السذاجة BHK-21 الخلايا (3 × 10 5 خلايا / جيد)، وتتراكب الاغاروز على الطبقات الوحيدة الخلية. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 4 أيام، تم إصلاح الخلايا على قيد الحياة مع الفورمالديهايد وملطخة مع الصورة الكريستال البنفسجيolution لقياس عدد المراكز المعدية (لويحات)، والتي تتطابق مع عدد من جزيئات الحمض النووي الريبي المعدية تسليمها إلى الخلايا (الشكل 6A). منذ ثبت القالب كدنا] تستخدم لنسخ في المختبر لتكون غير معدية، 27 قسامة من خليط التفاعل النسخ كانت تستخدم مباشرة ل electroporation. Electroporation للهو الأسلوب المفضل لRNA ترنسفكأيشن. بدلا من ذلك، الرنا يمكن transfected عن طريق وسائل أخرى باستخدام الجسيمات الشحمية DEAE-ديكستران والموجبة. RNA Electroporation للهي فعالة جدا، ولكن "الانحناء" للنبض كهربائي يحدث نادرا ما موجودة في رد فعل Electroporation للأو إذا تم استخدامها كفيت Electroporation للأملاح. تم فحص التعبير عن البروتينات الفيروسية في الخلايا transfected الحمض النووي الريبي المقايسات المناعي باستخدام أرنب مصل لمكافحة NS1 (الشكل 6B). كان إنتاج جزيئات فيروسية المتراكمة في supernatants من الخلايا transfected RNA لalyzed بواسطة فحوصات لوحة (الشكل 6C). نتائج هذه التجارب تشير بوضوح إلى أن الرنا الاصطناعية كدنا] المستمدة من معدية في متساهلة BHK-21 الخلايا، وتوليد عيار عال من الفيروسات المؤتلف.

النوكليوتيد تسلسل ل(5 'إلى 3') موقف ب قطبية
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 العقاقير
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		22/01 إحساس
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 العقاقير
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 نملةisense
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 إحساس
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 العقاقير
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 العقاقير
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 إحساس
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 العقاقير
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10952-10977 العقاقير
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 إحساس
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10956-10977 العقاقير
SP6F cataccccgcgtattcccac
تا 		إحساس
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		14/01 العقاقير
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		17/01 إحساس
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 العقاقير
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 إحساس
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 العقاقير
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 إحساس
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		العقاقير
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10670-10694 إحساس
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10954-10977 العقاقير
وأظهرت متواليات JEV بأحرف كبيرة، ويشار إلى تسلسل BAC بأحرف صغيرة.
موقف ب النكليوتيد يشير إلى التسلسل الجيني الكامل للJEV SA 14 -14-2 (بنك الجينات عدد الانضمام JN604986).

الجدول 1: [أليغنوكليوتيد] تستخدم لتخليق [كدنا، PCR التضخيم، وBAC الطفرات.

الشكل 1
الشكل 1.0؛ استراتيجية لبناء كدنا] بالطول من JEV SA 14 -14-2 بمثابة BAC (A) عزل RNA الفيروسي من الجسيمات JEV. أظهرت هو الرسم التخطيطي من الحمض النووي الريبي الجيني من JEV SA 14 -14-2. (B) التجميعي من أربعة أجزاء متداخلة كدنا] (F1 إلى F4) تغطي كامل الجينوم الفيروسي. (C) Subcloning من أربعة أجزاء كدنا] متداخلة في ناقلات BAC، وخلق pBAC / F1 إلى pBAC / F4. (D) تعديل cDNAs مستنسخة عن النسخ جولة الاعادة في المختبر. pBAC / F1 SP6 هو مشتق من pBAC / F1 الذي يحتوي على SP6 تسلسل المروج المنبع من الفيروسية 5'نهاية. pBAC / F3 KO هو مشتق من pBAC / F3 التي تحتوي على طفرة صامتة نقطة (A 9134 → T، النجمة). pBAC / F4 RO هو مشتق من pBAC / F4 يحتوي على الاصطناعي Xba I موقع الاعادة المصب من الفيروسية 3'نهاية. (E قوية>) جمعية كامل طول SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تجميع أربع شظايا [كدنا متداخلة (F1 إلى F4) تغطي كامل طول RNA الجيني من JEV SA 14 -14-2. يتم تقييم أربعة منتجات RT-PCR بواسطة الكهربائي في هلام الاغاروز 0.8٪. M، 1 كيلو بايت DNA سلم. يشار إلى أحجام المتوقع من شظايا [كدنا أربعة في الجزء السفلي من الصورة هلام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
الشكل 3. تنقية للBAC تحتوي على كدنا] بالطول من JEV SA 14 -14-2. يتم عزل البلازميد BAC من E. القولونية DH10B من طريقة تحلل SDS القلوية وتنقيته من جراء تباين في التدرج CSCL-EtBr. عرض مثال على التدرج CSCL-EtBr باستخدام 16 × 76 مم أنبوب البولي بروبلين قابل للغلق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. نظرة عامة على التعافي من الفيروسات المعدية من كامل طول JEV SA 14 -14-2 كدنا] تجميع في BAC. (A) الخطية من القالب كدنا]. ويتم قطع JEV BAC مع كامل طولXba أنا وتعامل مع MBN. (B) تجميع النصوص RNA. هو كتب [كدنا] خطي من قبل SP6 بوليميريز الحمض النووي الريبي في وجود م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') قبعة التناظرية. (C) الاسترداد من JEVs الاصطناعية. و transfected في المختبر الرنا كتب في BHK-21 الخلايا بواسطة الصعق الكهربائي، الذي يولد عيار عال من فيروس الاصطناعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. توليف الرنا التي كتبها النسخ في المختبر باستخدام JEV BAC كامل طول كقالب كدنا]. (A) الجيل من خطي طول الكامل JEV BAC، pBAC / SA 14 -14-2. اثنين من الحيوانات المستنسخة مستقلة pBAC/ وخطي SA 14 -14-2 (Cl.1 وCl.2) عن طريق الهضم مع Xba أنا ومعالجة لاحقة مع MBN. يتم فحص البكالوريا خطي من قبل الكهربائي في هلام الاغاروز 0.8٪. (B) إنتاج الرنا الاصطناعية التي كتبها الاعادة النسخ. يستخدم كل من اثنين من البكالوريا خطي كنموذج لSP6 RNA البلمرة الاعادة النسخ. يتم تشغيل aliquots من ردود الفعل النسخ اثنين على هلام الاغاروز 0.6٪. M، 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. العدوى محددة من الرنا الاصطناعية كتب من كامل طول JEV BAC واسترداد فيروس الاصطناعية. BHK-21 الخلايا هي وهمية electroporated (موك) أو electroporated مع النصوص RNA المستمدة الابام كل اثنين من الحيوانات المستنسخة مستقلة من كامل طول JEV BAC (Cl.1 وCl.2). (A) RNA العدوى. ومضافين الخلايا مع الاغاروز وملطخة البنفسجي الكريستال في 4 أيام بعد ترنسفكأيشن. يتم تحديد RNA العدوى عن طريق فحوصات مركز المعدية لتقدير كمية من الحمض النووي الريبي المعدية electroporated في الخلايا (اللوحة اليسرى). أيضا، وتظهر الصور التمثيلية مراكز المعدية (اللوحة اليمنى). (B) البروتين التعبير. كانت الخلايا المستزرعة في 4 جيدا الشرائح غرفة. ويتم تحليل الفيروسي التعبير البروتين في الخلايا electroporated RNA في 20 ساعة بعد ترنسفكأيشن (الرش) من خلال فحوصات المناعي باستخدام مصل الأرنب المضادة للNS1 الابتدائي والثانوي والماعز CY3 مترافق مفتش المضادة للأرنب (الحمراء). وcounterstained النوى مع 4، 6-diamidino-2-phenylindole (الأزرق). ومضافين الصور المناعي في المقابل الفرق صور التدخل النقيض بهم. (C) فيروس الغلة. ومثقف الخلايا في 150 الأطباق الثقافة مم. يتم فحص إنتاج virions المعدية المتراكمة في supernatants ثقافة الخلايا electroporated RNA في 22 و 40 الرش من قبل المقايسات البلاك. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد استخدم البروتوكول الحالي بنجاح لتوليد كامل طول استنساخ [كدنا] المعدية لمدة سلالات مختلفة (CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28) من JEV، والفيروسة المصفرة التي كدنا] وظيفية وقد ثبت أن من الصعب أصلا لبناء و نشر بسبب سمية الخلية المضيفة وعدم الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة 8،74-76 هذا البروتوكول يتضمن ثلاثة عناصر رئيسية هي: أولا، تحقيق أقصى قدر من تجميع / التضخيم من نسخة [كدنا المؤمنين من RNA الفيروسي باستخدام عالية الدقة عكس الناسخ / البلمرة DNA. ثانيا، استنساخ الفيروسية المنطقة PRM-E الترميز التي تحتوي على تسلسل السامة (بيانات غير منشورة) 74،77،78 في نسخ منخفضة جدا ناقلات عدد BAC من [كدنا الأولي subcloning لكامل طول الخطوات التجمع كدنا] النهائية؛ والثالث، وذلك باستخدام BAC ناقلات الاستنساخ التي يمكن أن تستوعب DNA الأجنبية بمتوسط ​​حجم 120-350 كيلوبايت، 19-21 التي تتسامح مع ما يبدو أكبر INSE DNAالمحطة المذكورة من القيام ناقلات الاستنساخ الأخرى. وهذا النهج الاستنساخ تكون قابلة للتطبيق بشكل عام إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا الأخرى، لا سيما تلك التي لديها جينوم الحمض النووي الريبي كبير من ~ 10-32 كيلوبايت. جيل من استنساخ [كدنا] المعدية هو خطوة رئيسية في تطوير نظام الوراثة العكسية للفيروسات RNA، وخاصة بالنسبة للفيروسات RNA إيجابية المنطلق، لأن الجينوم الفيروسي يعمل مرنا كما أن تترجم إلى بروتينات التي ريبوسوم الخلية المضيفة. وبالتالي، يمكن أن يبدأ تكاثر الفيروس عن طريق إدخال الجينوم طول جزيء RNA المستمدة كدنا] إلى الخلية المضيفة عرضة للإصابة. إن وجود المعدية JEV كدنا] استنساخ، عندما جنبا إلى جنب مع تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، ازداد فهمنا لمختلف جوانب دورة حياة الفيروس على المستوى الجزيئي، مثل التعبير الجيني 73،79 وتكرار الجينوم. 63،64 أيضا، وقد أثبتت كامل طول JEV كدنا] استنساخ ليكون أداة قيمة لتطوير لقاحات مضادة للفيروسات 28 وناقلات توصيل الجينات. <سوب> 80،81

كما هو الحال مع جميع فيروسات RNA إيجابية المنطلق، هناك خطوات حاسمة متعددة في بناء كدنا] وظيفية يمكن الاعتماد عليها لJEV التي الرنا شديدة العدوى ويمكن تصنيعه في المختبر. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون تسلسل الرنا الاصطناعية كتب من نسخة من كامل طول كدنا] متطابقة إلى أن من RNA الجيني الفيروسي، وخاصة 5'- و3'-محطة متواليات المطلوبة لبدء النسخ RNA الفيروسي . 60-62 في البروتوكول الحالي، الحجية 5'- وتم ضمان 3'نهايات من خلال وضع تسلسل SP6 المروج المنبع من أول النوكليوتيدات الأدينين من الجينوم الفيروسي وتحديد المواقع على الاصطناعي Xba I موقع قيود فريدة من نوعها المصب من الماضي الثايمين النوكليوتيدات من الجينوم الفيروسي، على التوالي. توج الرنا الاصطناعية مع أصيلة 5 'و 3' ينتهي من إنتاج النسخ جولة الاعادة من Xba I خطي وMBN المعاملة [كدنا الشركة المصرية للاتصالاتmplate باستخدام SP6 RNA البلمرة معبي مع م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') قبعة التناظرية. يمكن تعديل هذا البروتوكول في عدة طرق. لنسخ في المختبر، وآخر بوليميريز RNA عاثية (على سبيل المثال، T3 أو T7) يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع تسلسل المروج واضحة المعالم في 27 كموقع للجولة الاعادة، وهو موقع قيود مختلفة يمكن أن تستخدم إذا كان غير موجود في الجينوم الفيروسي RNA وإذا الاصطناعية من كدنا] خطي ينتهي مع 'نهاية 3 الأصيلة. وقد أثبتت أهمية تسلسل النوكليوتيدات 3'نهاية نقصان ~ 10 أضعاف في RNA العدوى عندما يحتوي RNA الاصطناعية ثلاثة أو أربعة النيوكليوتيدات الفيروسات لا علاقة لها في 'نهاية 3. 27 وفي النسخ في المختبر رد الفعل، على حد سواء م 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') ألف وم 7 G (5 ') تعادل القوة الشرائية (5') G غطاء التناظرية يمكن استخدامها على حد سواء بشكل جيد، على الرغم من أن الأماكن الأخيرة للا علاقة G النوكليوتيدات إضافية من المنبع الفيروسية 5 '-end، ولكن هذابالإضافة إلى ذلك لا يغير من العدوى أو تكرار RNA الاصطناعية. 27 وعلاوة على ذلك، وإزالة القالب كدنا] من النصوص التي كتبها RNA الدناز I الهضم ليست ضرورية لاجراء اختبارات الحمض النووي الريبي العدوى، لأن قالب [كدنا في حد ذاته ليس معديا. 27

وقد تم الآن تطبيق التكنولوجيا BAC لبناء استنساخ [كدنا] المعدية لحفنة من فيروسات RNA إيجابية حبلا، وهما، وهما JEVs، CNU / LP2 27 و SA 14 -14-2 28 (حجم الجينوم، ~ 11 كيلو بايت)؛ اثنين من فيروسات حمى الضنك، BR / 90 26 و NGC 29 (~ 11 كيلو بايت)؛ والبقري الفيروسي فيروس الإسهال، SD1 (~ 12 كيلو بايت) (25)؛ اثنان الكلاسيكية فيروسات حمى الخنازير، C وبادربورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس مرض الحدود، جيفهورن (~ 12 كيلو بايت)؛ 24 فيروس متلازمة الجهاز التنفسي والتناسلي الخنازير ، PL97-1 / LP1 (~ 15 كيلو بايت) (30)؛ وفيروس التهاب المعدة والأمعاء انتقال، PUR46-MAD (~ 29 كيلو بايت) (16)؛ والقطط فيروس الصفاق المعدي،DF-2 (~ 29 كيلو بايت) (32)؛ وشديد التاجى المتلازمة التنفسية الحادة، أورباني (~ 30 كيلو بايت)؛ 9 الشرق الأوسط التنفسي متلازمة التاجى، EMC / 2012 (~ 30 كيلو بايت) (17)؛ والتاجى البشري، OC43 (~ 31 كيلوبايت) 31 والميزة الرئيسية لاستخدام البكالوريا لبناء كدنا] هو الاستقرار الجيني عالية من كبيرة، 1- أو 2-نسخة البلازميدات BAC؛ ومع ذلك، فإن الطبيعة الجوهرية للرقم ونسخة منخفضة للغاية لها هي أيضا عيب كبير، بسبب العائدات المنخفضة جدا من الحمض النووي BAC وما يترتب عليه من انخفاض في نقاء DNA BAC مع الاحترام لاستضافة DNA الكروموسومات. في البروتوكول الحالي، يتم تكبير العائد من BAC DNA من خلال زراعة E. القولونية DH10B تحولت مع BAC pBAC المعدية / SA 14 -14-2 في وسط الغنية بالمغذيات، 2xYT. وعلى الرغم من هذه الجهود، ومتوسط ​​العائد هو فقط ~ 15 ميكروغرام من الحمض النووي BAC من 500 مل من مرق 2xYT. أيضا، فإن أفضل طريقة لتحقيق نقاء DNA BAC باستخدام CSCL-EtBr التدرج الكثافة الطرد المركزي لتنقيةبدلا من يشيع استخدامها على أساس العمود البلازميد العزلة. ومع ذلك، فمن المهم أن نأخذ في الاعتبار أن E.-تحولت BAC يجب القولونية لا كسا الأرض لأنه قد يعرض للخطر الاستقرار الجيني للكدنا] المستنسخة، ولا تؤدي زيادة النمو بالضرورة إلى زيادة الغلة أو DNA BAC-نقاء أعلى.

بروتوكول الموصوفة هنا هو والكفاءة، وطريقة مبسطة الأمثل لبناء ونشر مستقر وراثيا كامل طول كدنا] المعدية استنساخ باعتباره BAC لJEV، وهو إجراء يعتقد مرة واحدة مستحيلة عمليا. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الاستراتيجية استنساخ نفسها إلى العديد من الفيروسات RNA إيجابية حبلا أخرى. بشكل عام، استنساخ [كدنا] المعدية تمكننا من تقديم مجموعة متنوعة من الطفرات (على سبيل المثال، الحذف، الإدراج، والطفرات نقطة) في الجينوم الفيروسي RNA لدراسة الوظائف البيولوجية في تكاثر الفيروس والمرضية. هذا النظام الوراثة العكسية القائم على كدنا] يجعل من الممكن تطوير وقسم التدريب والامتحاناتلقاح ر والمرشحين العلاجية التي تستهدف عامل الفوعة (ق) من معين فيروس RNA إيجابية حبلا من الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذه التكنولوجيا كدنا] المعدية كناقل الفيروسي، قادرة على التعبير عن جينات غريبة (ق) من الفائدة للعديد من التطبيقات في مجال البحوث الطبية الحيوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

علم المناعة، العدد 106، عكس علم الوراثة، وكدنا] المعدية، كروموسوم اصطناعي بكتيريا، فيروسات RNA، بالمعنى الإيجابي احد الذين تقطعت بهم السبل، والعدوى، والنسخ، المرضية، الفيروسة المصفرة، وفيروس التهاب الدماغ الياباني
بكتيريا الاصطناعية الكروموسومات: أداة علم الجينوم وظيفية لدراسة الفيروسات RNA إيجابي حبلا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter