Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bakteriel kunstige kromosomer: En funktionel Genomics værktøj for Studiet af Positiv-RNA-vira

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

For RNA virologer, fremkomsten af rekombinant DNA-teknologi i slutningen af 1970'erne gjorde det muligt at omdanne virale RNA genomer til cDNA-kloner, som derefter kunne opformeres som plasmider i bakterier til genmanipulation af RNA-vira. 1 Den første RNA-virus for at være molekylært klonet var bakteriofag Qp, en positiv-strenget RNA-virus, der inficerer Escherichia coli. Et plasmid indeholdende en komplet cDNA-kopi af Qp genomisk RNA gav anledning til infektiøse fager Qp når den indføres i E. coli. 2 Kort tid efter blev denne teknik anvendes på poliovirus, en positiv-strenget RNA-virus hos mennesker og dyr. Et plasmid, der bærer et fuldlængde-cDNA af poliovirus genomisk RNA blev infektiøse, når de transficeres i pattedyrceller og i stand til at producere infektiøse virioner 3 I dette "DNA-lanceret" måde, skal de klonede cDNA'er transkriberes intracellulært at indlede viral RNA-replikation.;Det er imidlertid uklart, hvordan transkription initieres, og hvordan de transkripter behandlet til den korrekte virale sekvens. Denne bekymring har ført til udviklingen af en alternativ "RNA-lanceret" tilgang, hvor en komplet cDNA-kopi af det virale RNA-genom, klones under en promotor genkendt af en E. coli eller fag-RNA-polymerase til fremstilling af syntetiske RNA'er in vitro med defineret 5'- og 3'-termini, der undergår den fuldstændige virale replikationscyklus når det indføres i værtsceller. 4,5 Den første succes med denne fremgangsmåde blev rapporteret for brome mosaic virus 6,7 en positiv-strenget RNA-virus af planter. Siden da har den RNA-lanceret tilgang er udviklet til en lang række positive-RNA-vira, herunder calicivirus, alphavira, flavivirus, arterivirusser og coronavirusser. 1,4,5,8

I både DNA- og RNA-lanceret omvendt genetik systemer, opførelse af en full-længde cDNA-klon er nøglen til dannelse af infektiøs DNA eller RNA positiv-strengede RNA-vira, men det bliver en betydelig teknisk udfordring som størrelsen af det virale genom stiger. 9-17 Især et stort RNA-genom på ~ 10 -32 kb præsenteres tre vigtige hindringer for kloning af et fuldlængde-cDNA funktionelle. 18 Det første problem er syntesen af en trofast cDNA-kopi, eftersom nøjagtigheden af RT-PCR er omvendt proportional med længden af det virale RNA. Den anden hurdle er tilstedeværelsen af potentielt toksiske sekvenser, idet lange RNA-molekyler er mere tilbøjelige til at indeholde uventede sekvenser er i stand til at gøre cDNA-fragmentet i plasmider ustabile i E. coli. Den tredje og mest kritiske spørgsmål er tilgængeligheden af ​​en egnet vektor, da det er vanskeligt at finde en kloningsvektor, der kan rumme en viral cDNA insert på 10 kb>. I løbet af de seneste tre årtier, har disse barrierer overvundet af flere fremskridt inden enzymologi, metode, end vectorology. 1,4,5,8 Af disse er den mest lovende og nyskabende udvikling er kloning af store positive-RNA-vira som smittefarlige bakterielle kunstige kromosomer (BAC'er). BAC vektor er en kloning lav kopi plasmid (1-2 kopier / celle) baseret på E. coli fertilitet faktor, med en gennemsnitlig DNA-insert størrelse på ~ 120-350 kb 19-21 Et DNA-fragment indsættes i BAC vektor i en lignende måde til kloning i generelle kloningsvektorer.; de resulterende BAC kloner er stabile over mange generationer i E. coli. 22,23 Til dato har BAC teknologien blevet brugt til at skabe infektiøse cDNA kloner for> 10 medlemmer af tre positiv-RNA-virus familier, dvs. Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 og Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32

Brug japansk hjernebetændelse virus (JEV) som et eksempel, den nuværende arbejde rapporterer de detaljerede procedurer, der kan væreanvendes til at konstruere et genetisk stabile fuld længde infektiøse BAC for en række positive-strengede RNA-vira. JEV er en zoonotisk flavivirus 33, der overføres i naturen mellem fugle, svin og andre hvirveldyr af myg vektorer. 34,35 Hos mennesker kan JEV infektion kan forårsage den alvorlige ofte dødelig neurologisk sygdom japansk hjernebetændelse (JE), 36, der forekommer i Asien og dele af det vestlige Stillehav, 37,38 med en anslået årlig incidens af ~ kliniske 50,000-175,000 sager. 39,40 Genomet af JEV er en ~ 11 kb, enkeltstrenget, positiv-sense RNA-molekyle og består af en enkelt åben læseramme (ORF) flankeret af to ikke-kodende regioner (NCRs) ved 5'- og 3'-enderne. 41,42 ORF'en koder for et polyprotein, som spaltes af vært og virale proteaser for at generere 10 individuelle proteiner, betegnet C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B og NS5 i N- til C-terminal retning. 34,43,44 Også en eXtended form for NS1 (NS1 ') er udtrykt ved -1 ribosomale frameshifting ved codon 8-9 af NS2A. 45,46 Af disse 11 proteiner, de tre strukturelle proteiner (C, bevægelseshæmmede og E) er af afgørende betydning for dannelsen af infektiøse virioner, 47,48 og de ​​resterende otte ikke-strukturelle proteiner (NS1 til NS5 og NS1 ') er afgørende for virus-RNA replikation, 49-51 partikel samling, 52-56 og medfødte immunitet unddragelse. 57-59 Både 5' og 3 'NCRs indeholder konserverede primære sekvenser og form, RNA sekundær / tertiær strukturer, 60-62 som er vigtige for modulering af viral RNA-replikation. 63,64

Denne protokol beskriver de værktøjer, metoder og strategier til at generere en fuld-længde infektiøse BAC af JEV SA 14 -14-2. 28 Denne funktionelle BAC-klon indeholder en komplet cDNA kopi af JEV genomisk RNA, 65, der er omfattet af en promotor for SP6 RNA polymerase opstrømsaf det virale 5'-enden og et unikt Xbal restriktionssted nedstrøms for den virale 3'-enden til in vitro afstrømning transkription. Denne BAC teknologi kan anvendes til at konstruere en fuldt funktionel cDNA molekylære klon for en bred vifte af positiv-strengede RNA-vira.

Protocol

Bemærk: Figur 1 præsenterer en strategi for opførelsen af en fuld-længde infektiøse JEV cDNA som en BAC 28 Tabel 1 giver en oversigt over de oligonukleotider, der anvendes i denne protokol 28..

1. Uddrag Viral RNA fra JEV Partikler i cellekultursupernatanterne

  1. Start med cellekulturmediet indeholdende JEV SA 14 -14-2, en levende JE-vaccine virus, der kræver biosikkerhedsniveau 2 inddæmning.
    Bemærk: Den virale titer er ca. 1-3 × 10 6 plaquedannende enheder / ml.
  2. Tag biosikkerhed uddannelse er nødvendig for alle standard mikrobiologiske praksis, sikkerhedsudstyr og laboratoriefaciliteter før arbejdet med JEV SA 14 -14-2.
  3. Oprense virale RNA fra en portion af virusholdige cellekulturmedium under anvendelse af en enfaset opløsning af phenol og guanidinisothiocyanat 66 (figur 1A).
    1. Add 600 pi af monofasiske reagens til 200 pi af kultursupernatanten i en 1,7 ml mikrorør. Homogenisere blandingen ved hånden ryster røret kraftigt i 30 sek og inkubering i 5 minutter ved stuetemperatur.
    2. Tilføj 160 pi chloroform til den homogeniserede prøve. Bland grundigt med hånden ryster røret kraftigt i 15 sekunder og lade det i 2-3 minutter ved stuetemperatur.
    3. Centrifugeres samlede lysat ved 13.400 x g i 15 minutter ved 4 ° C, hvilket resulterer i en adskillelse af to væskefaser, dvs. en lavere organiske fase og en øvre vandig fase. Den øvre vandige fase (mindre end 200 pi) indeholdende RNA overføres til en ny mikrorør.
    4. Udfælde RNA ved tilsætning af 1 pi af 5 pg / pl glycogen og 400 pi 100% isopropanol og inkubering i 10 minutter ved stuetemperatur.
    5. Centrifuger blandingen ved 13.400 x g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten fjernes, og vask RNA-pelleten med 1 ml 75% ethanol ved puls-vortexing 04:57tider og centrifugering ved 13.400 x g i 5 minutter ved 4 ° C.
    6. Air-tørre RNA pellet i 10 min og opløse den i 40 pi dH 2 O. Opbevar det ekstraherede RNA ved -80 ° C indtil anvendelse.

2. syntetisere et sæt på fire overlappende cDNA Fragmenter (F1 til F4) spænder over hele Viral Genomisk-RNA ved revers transkription (RT) -PCR

  1. Udføre en 20 pi RT-reaktionen med en 10 pi alikvot af den oprensede virus-RNA som en skabelon og en modificeret form af Moloney murin leukæmivirus-revers transkriptase. 67
    1. Opsæt en 13 pi blanding indeholdende 10 pi af den rensede RNA, 1 gl 10 mM dNTP mix, 1 gl 4 pmol / ul primer og 1 pi dH 2 O. Brug fragment-specifikke primer for hver RT-reaktionen: 1RT for F1, F2 2RT for, 3RT for F3 og F4 4RT for.
    2. Inkuber blandingen ved 65 ° C i 5 minutter, sted på is i 1 min, og derefter hurtig-centrifugen for at samle Contents på bunden af ​​glasset.
    3. Tilføj 4 pi 5 x RT-puffer, 1 pi 0,1 M DTT, 1 pi 40 U / pl RNase inhibitor og 1 pi 200 U / pl revers transkriptase. Bland ved at pipettere op og ned tre til fem gange.
    4. Lad reaktionen forløbe ved 50 ° C i 1 time, derefter varme-inaktivering prøven ved 70 ° C i 15 minutter. Opbevar syntetiseret første streng cDNA ved -20 ° C indtil anvendelse.
  2. Udfør en 100 pi PCR-reaktion med en 5 pl portion af varmeinaktiveret RT-reaktionen som en skabelon og en high-fidelity termostabil DNA-polymerase 68 (figur 1B).
    1. Opsætning af en 100 pi PCR-reaktion på is, indeholdende 5 ul af RT-reaktionen, 20 pi 5 x PCR-buffer, 4 pi 10 mM dNTP-blanding, 5 pi 10 pM forward primer, 5 pi 10 pM reverse primer, 1 pi 2 U / pl DNA-polymerase, og 60 pi dH 2 O. Brug fragment-specifikke primerpar for hver PCR reaction: 1F + 1R for F1 (2573 bp), 2F + 2R for F2 (4171 bp), 3F + 3R for F3 (3922 bp), og 4F + 4R for F4 (1798 bp).
    2. Bland forsigtigt ved fingerlignende vende røret tre til fem gange og centrifugeres kort for at samle indholdet på bunden.
    3. Begynd termocycling med en indledende denatureringstrin på 30 sekunder ved 98 ° C, efterfulgt af 25-30 cyklusser med følgende PCR-profil: 10 sekunder ved 98 ° C, 30 sekunder ved 60 ° C og 1-2 min (30 s / kb) ved 72 ° C. Opbevar PCR-produkterne ved 4 ° C indtil analyse.
  3. Kør en 2-5 pi alikvot af hver PCR-reaktion på en 0,8% agarosegel indeholdende 0,5 ug / ml ethidiumbromid (EtBr) (figur 2).
    ADVARSEL: EtBr er en potent mutagen og kræver kitler, sikkerhedsbriller og handsker skal bæres og ekstrem forsigtighed skal overholdes ved dens anvendelse, opbevaring og bortskaffelse.

3. Subklon hver af de fire cDNA Fragmenter (F1 til F4) i en BAC Vector oprettes pBAC / F1 til pBAC / F4 by Molecular kloningsteknikker

  1. Fordøje vektoren og indsætte DNA med to passende restriktionsendonukleaser, som følger:
    1. Udfør en sekventiel fordøjelse af pBAC / PRRSV / FL (vektor), 30 et derivat af pBeloBAC11 plasmidet (7507 bp, GenBank accession nummer U51113), med Pmel og Not I i et samlet volumen på 60 pi (indeholdende ~ 500 ng DNA , 10 U enzym, 1x digestionspuffer og 1 × BSA) ved 37 ° C i 12-15 timer, hvilket giver den 15426-bp vektorfragmentet.
    2. Udfør en sekventiel fordøjelse af hver af de fire cDNA amplikoner (indsæt) med Smal og Not I i et samlet volumen på 60 pi (indeholdende ~ 1 ug DNA, 20 U enzym, 1 × digestionspuffer og 1 × BSA) ved 25 ° C (Smal) eller 37 ° C (Not I) for 12-15 timer, hvilket giver følgende insert fragmenter af den ønskede størrelse: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), og F4 (1784 bp).
  2. Oprensønskede vektor og indsætte DNA-fragmenter ved gel ekstraktion.
    1. Adskil dobbelt spaltede produkter på en 1% lavtsmeltende agarosegel indeholdende 0,5 ug / ml EtBr. Skære en bånd med den ønskede DNA-fragment med en minimal mængde agarose (normalt ~ 200 pi) under langbølget ultraviolet lys.
    2. Tilføj et lige volumen af TEM-buffer (10 mM Tris-CI, 1 mM EDTA og 10 mM MgCl2) til udskårne agarose i en 1,7 ml mikrorør. Prøven inkuberes ved 72 ° C i 10-15 min, med hvirvelbehandling hver 2-3 min, indtil agarosen er fuldstændigt smeltet.
    3. Tilføj et lige så stort volumen forvarmet buffer-mættet phenol, vortex kraftigt i 1 min, og der centrifugeres ved 13.400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
      Bemærk: Blandingen adskilles i en lavere organiske fase og en øvre vandig fase. Den øvre vandige fase indeholdende DNA til en ny mikrorør overføre.
    4. Tilsættes et lige så stort volumen chloroform: isoamylalkohol (24: 1), vortex i 1 min, og der centrifugeres ved 13,400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Den øvre vandige fase overføres til en ny mikrorør.
    5. Tilsæt 0,5 pi 10 pg / pl gær-tRNA, 1/10 volumen 3 M natriumacetat og 2,5 volumener 100% ethanol. Hold blandingen på is i 20 minutter.
    6. Centrifuger blandingen ved 13.400 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Fjern supernatanten og vask DNA-pelleten med 1 ml 70% ethanol ved puls-omhvirvling tre til fem gange, og centrifugering ved 13.400 x g i 10 min.
    7. Lufttørres DNA-pelleten i 10 minutter og opløse den i 20 pi TE-buffer (10 mM Tris-Cl og 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Ligere den ønskede vektor og indsætte DNA-fragmenter under anvendelse af T4 DNA-ligase.
    1. Opsætning af en 20 pi ligering reaktion indeholdende 50-100 ng af vektor-DNA, a ~ 3-fold molært overskud af insert-DNA'et, 400 U T4-DNA-ligase og 1 × ligering buffer. Inkubér ligeringsreaktionen ved 16 ° C i 12-15 timer.
      Bemærk: Medtag en negativ control reaktion, dvs. vektoren uden indsatsen, parallelt.
    2. Udfør fire separate ligeringer, hver sammenføjning af 15426 bp Pmel I- Not I fragment af pBAC / PRRSV / FL med 2559-bp (F1), 4157 bp (for F2), 3908 bp (for F3), eller 1784 bp (for F4) SmaI-Not I fragment af en af de fire cDNA amplikoner at generere subkloner pBAC / F1 til pBAC / F4.
  4. Transformer ligerede DNA i E. coli DH10B af CaCl2-varme shock metode.
    1. Tag 100 pi alikvoter af CaCl2-behandlede kompetente DH10B celler 69 opbevaret ved -80 ° C og optøs dem på is.
      Bemærk: Brug 100 ul celler pr transformation.
    2. Tilføj en 10 pi alikvot af DNA ligeringsreaktionen til 100 pi af de optøede celler i en 1,7 ml mikrorør, bland forsigtigt ved at banke på glasset, og holde på is i 30 minutter.
    3. Varmechok DNA-celleblandingen for 45 sekunder i et 42 ° C water bad, anbring på is i 2 minutter, og derefter tilføje 900 pi LB-medium opvarmet til RT.
    4. Inkubér varme-chokeret celler ved 35 ° C i 1 time med omrystning ved 225-250 rpm.
    5. Spred 50 til 200 pi alikvoter af de dyrkede celler på LB-agarplader indeholdende 10 ug / ml chloramphenicol (CML). Hold pladerne ved RT, højre side op, indtil de er tørre.
    6. Vend pladerne hovedet og inkuberes ved 35 ° C i 15 timer.
  5. Inddrive det klonede BAC DNA fra værtscellerne ved en kolonne-baseret oprensningsmetode (figur 1C).
    1. Pick seks til otte bakteriekolonier fra LB-agarplader CML og vaccinere dem i 3 ml 2 x YT-medium indeholdende 10 ug / ml CML. Inkuber kulturerne ved 35 ° C i 10 timer med kraftig omrystning (225-250 rpm).
    2. Isoler rekombinant BAC DNA'er fra 1-1,5 ml af bakterielle kulturer under anvendelse af spin-søjler, som anvist af fabrikanten. 70 elueres det ekstraherede DNA (typitisk 100-200 ng) i 20 ul TE-buffer.
    3. Udføre to analytiske restriktionsenzymfordøjelser af de isolerede BAC'er for ~ 6 timer i et totalvolumen på 10 ul, en at identificere tilstedeværelsen af ​​vektoren med en korrekte insert ved anvendelse af de samme enzymer, der anvendes til kloning (se protokol 3.1), og den anden at teste integriteten af de klonede BAC'er med et passende enzym (f.eks Bgl II, Nco I eller Pst I), der genererer en unik restriktionsfragment mønster.
    4. Udbrede korrekt klonede BAC'er ved podning 500 pi de positive bakteriekulturer (fra protokol 3.5.1) i 500 ml 2 x YT-medium CML og dyrkning af inokulum i 6 timer ved 35 ° C under omrystning ved 225-250 rpm. Oprense BAC DNA (typisk 10-20 ug) fra 500 ml kultur ved hjælp af filter kolonner, som anbefalet af fabrikanten. 71
      Bemærk: De første fire BAC subkloner, der hver indeholder et cDNA-fragment af JEV genomisk RNA, kan vise sig at have påe eller flere uønskede mutation (er) i forhold til konsensussekvensen af virusgenomet 42 (der tjener som reference sekvens). En sådan mutation skal korrigeres ved hjælp af PCR-baseret stedrettet mutagenese før samlingen af et fuldlængde-cDNA JEV. 27

4. Opret en fuld-længde JEV-cDNA med 5'SP6 promotoren og 3 'Run-off site

  1. Lav tre genetiske modifikationer (se nedenfor protokoller 4.1.1-4.1.3) i de klonede cDNA'er for at tillade in vitro afstrømning transkription af genomlængde RNA'er med autentiske 5'- og 3'-enderne af det virale genom.
    1. Indføre en SP6-promotor direkte opstrøms for 5'-enden af det virale genom ved overlap PCR (figur 1D, pBAC / F1 SP6).
      1. Forstærk to overlappende DNA-fragmenter via den første standard PCR af pBAC / F1 med de to primerpar SP6F + SP6R (produkt størrelse, 173 bp) og F1F + F1R (produkt size, 676 bp), hver i en 50 pi reaktion indeholdende 1 pi template-DNA (-200 pg / pl), 10 pi 5 x PCR-puffer, 2 pi 10 mM dNTP'er, 2,5 pi hver af 10 uM fremadrettede og bagudrettede primere, 0,5 pi 2 U / pl DNA-polymerase, 68 og 31,5 pi dH 2 O. Udfør PCR under anvendelse af følgende cykling profil: 98 ° C i 30 sekunder, og 25 cykler af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 20 sek.
      2. Gel-oprensning af to PCR-amplificerede DNA-fragmenter efter kører hver af de to PCR-produkter på en 1,5% lavtsmeltende agarosegel, som beskrevet i protokol 3.2.
      3. Fusionere de to gel-oprensede DNA-fragmenter via den anden fusion PCR under anvendelse af yderste primere SP6F + F1R (produktstørrelse, 821 bp) i en 100 pi reaktion, herunder 1 pi hver af de to oprensede DNA-fragmenter (~ 100 pg / pl), 20 pi 5 × PCR-buffer, 4 pi 10 mM dNTP'er, 5 pi af hver af 10 uM frem og reverse primere, 1 pi2 U / pl DNA-polymerase, 68 og 63 pi dH 2 O. Brug følgende termisk cykling profil: 98 ° C i 30 sekunder, og 25 cykler af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 30 sek.
      4. Gel-oprensning af smeltet PCR-amplikon fra en 1% lavtsmeltende agarosegel, som beskrevet i protokol 3.2.
      5. Udfør fem-trins kloning fremgangsmåden beskrevet i protokol 3,1-3,5 at ligere 760 bp Pac I-Bsi WI fragment af geloprenset fusioneret PCR-amplikon med 9532 bp Pac I-Bsi WI fragment af pBAC / F1 for at generere pBAC / F1 SP6.
    2. Fjern den allerede eksisterende, interne XbaI-sitet ved nukleotid 9131 ved at indføre en tavs punktmutation (A 9134 → T) via overlap PCR (figur 1D, pBAC / F3 KO).
      1. Amplificere to overlappende DNA-fragmenter ved den første standard PCR af pBAC / F3 med to primerpar X1F + X1R(produktstørrelse, 746 bp) og X2F + X2R (produktstørrelse, 316 bp) i en 50 pi reaktion under de beskrevne forsøgsbetingelser i protokol 4.1.1.1.
      2. Gel-oprensning af to PCR-amplificerede DNA-fragmenter efter elektroforetisk separation på 1,5% lavt smeltepunkt agarosegeler, som beskrevet i protokol 3.2.
      3. Fusionere de to gel-renset DNA-fragmenter via den anden fusion PCR ved hjælp af den yderste primere X1F + X2R (produkt størrelse, 1033 bp) i en 100 ul reaktion under de eksperimentelle betingelser, der er beskrevet i protokol 4.1.1.3.
      4. Gel-oprensning af smeltet PCR-amplikon fra en 1% lavtsmeltende agarosegel, som beskrevet i protokol 3.2.
      5. Udfør fem-trins kloning fremgangsmåden beskrevet i protokol 3,1-3,5 at ligere det 949 bp Avr II Not I fragment af geloprenset fusioneret PCR-amplikon med 16245 bp Not I- Bsi WI og 2141 bp Bsi W I - Avrll fragmenter af pBAC / F3 til at producere pBAC / F3 KO.
      </ li>
    3. Engineer en ny kunstig Xbal afstrømning sted lige nedstrøms for 3'-enden af det virale genom ved PCR-baseret stedrettet mutagenese (figur 1D, pBAC / F4 RO).
      1. Genererer en DNA-fragment ved PCR af pBAC / F4 med primere ROF + ROR (produktstørrelse, 324 bp) i en 100 pi reaktion indeholdende 1 pi template-DNA (-200 pg / pi), 20 pi 5 x PCR-buffer, 4 pi 10 mM dNTP'er, 5 pi hver på 10 uM frem og bak primere, 1 gl 2 U / ul DNA-polymerase, 68 og 64 pi dH 2 O. Udfør PCR under anvendelse af følgende cykling profil: 98 ° C i 30 sekunder, og 25 cykler af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 30 sek og 72 ° C i 15 sek.
      2. Gel-oprensning af PCR-amplificerede DNA-fragment fra en 1% lavtsmeltende agarosegel, som beskrevet i protokol 3.2.
      3. Udfør fem-trins kloning fremgangsmåden beskrevet i protokol 3,1-3,5 at ligere det 283 bp Sfi I- Not fragment af geloprenset PCR-amplikon med 16933 bp Sfi I- Not I fragment af pBAC / F4 for at skabe pBAC / F4 RO.
  2. Saml et sæt af de fire modificerede, overlappende cDNAer i en enkelt fuld længde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) ved at deltage på tre naturlige restriktionssteder (BSR GI, Bam HI, og Ava I ) på en sekventiel måde ved anvendelse af de fem trin kloning procedurerne i protokollerne 3,1-3,5 (figur 1E): F1 SP6 → F1 F2 SP6 (ved at erstatte BSR G I- Not I fragment af pBAC / F1 SP6 med den for pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (ved at erstatte Bam H I- Not I fragment af pBAC / F1 SP6 F2 med den for pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (ved at erstatte Ava I-Not I fragment af pBAC / F1 SP6 F2F3 KO med den for pBAC / F4 RO).

5. Forbered en høj renhed Maxi-prep af fuld længde SA 14 -14-2 BAC

  1. Dyrk en enkelt koloni af E. coli DH10B bærer pBAC / SA 14 -14-2 i 3 ml 2 x YT-medium af indeholdende 10 ug / ml CML i 10 timer ved 35 ° C med omrystning ved 225-250 rpm, og derefter skalere op ved at pode 500 pi af 10 timer bakteriekultur i 500 ml 2 x YT-medium CML og dyrkning af inokulum i 6 timer ved 35 ° C med kraftig omrystning.
  2. Centrifuger bakteriekulturen i to 250 ml flasker ved 3.107 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Resuspender hver pellet i 30 ml GTE (50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl og 10 mM EDTA [pH 8,0]), og derefter tilsættes 500 pi 60 mg / ml lysozym. Inkubér to cellesuspensioner på is i 10 minutter.
  3. 60 ml frisk gjort Lysis-opløsning (0,2 N NaOH og 1% SDS) til hver cellesuspension, bland godt indtil den var klar, og holde lysaterneved stuetemperatur i 10 minutter.
  4. Tilføj 45 ml neutraliseringsopløsning (100 ml, bestående af 60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml iseddike, og 28,5 ml dH2O) til hver flaske, der blandes grundigt ved at vende flaskerne, og inkuberes den neutraliserede lysater på is i 10 minutter.
  5. Centrifuger neutraliserede lysater ved 18.566 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten af ​​begge flasker i to nye 250 ml flasker; tilføje 0,6 volumen på 100% isopropanol til hver, og holde dem på is i 20 minutter.
  6. Spin ned præcipitaterne ved 18.566 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Hver pellet opløses i 5 ml TE-buffer, kombinere dem i en 50 ml rør (10 ml i alt), og udfælde RNA ved tilsætning af et lige så stort volumen 5 M lithiumchlorid. Inkuber blandingen på is i 10 min.
  7. Centrifuger RNA bundfaldet ved 14.636 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et nyt 250 ml rør og udfælde DNA ved tilsætning af 2 volumener 100% isopropanol.Inkuber blandingen på is i 20 minutter.
  8. Spin ned DNA-præcipitatet ved 18.566 x g i 20 minutter ved 4 ° C. Aspirer supernatanten, resuspender DNA pellet i 9,5 ml TE-buffer (pH 7,6), og der tilsættes 10 g cæsiumchlorid (CsCl), og 390 pi 10 mg / ml EtBr.
  9. Indlæse DNA-CsCI-EtBr opløsning i en 16 × 76 mm forsegles polypropylenrør ved hjælp af en sprøjte udstyret med en 18 G nål. Spin den forseglede CsCI-gradient i en ultracentrifuge ved 401.700 x g i 16 timer ved 20 ° C (figur 3).
  10. Saml en DNA-bånd af BAC plasmid fra CsCI-gradient under anvendelse af en 18 G nål for at skabe en luftkanal på toppen af ​​gradienten og en 20 G nål udstyret sprøjte for at hente BAC DNA fra siden af ​​gradienten.
  11. Tilføj 2,5 volumener dH2O-mættet butanol til EtBr-farvede BAC DNA-prøve og vortexes. Centrifuger blandingen ved 13.400 x g i 1 min og overføre det nedre vandige fase til et nyt 1,7 ml microtube. Gentag denne procedure seks gange.
  12. Udfældning af EtBr-fri BAC DNA ved tilsætning af 1/10 volumen 3 M natriumacetat og 2,5 volumener 100% ethanol til butanol-ekstraheret BAC DNA og inkubering i 10 minutter på is. Centrifuger bundfaldet ved 13.400 x g i 10 minutter, vaskes DNA-pelleten med 1 ml 70% ethanol, og re-pelletere det ved centrifugering.
  13. Lufttørres DNA-pelleten i 10 minutter og opløse den i 200 pi TE-buffer (pH 7,6).
    Bemærk: Figur 4 viser et overblik over revers genetik system til JEV SA 14 -14-2.

6. Transskribere Syntetiske RNA'er in vitro fra en lineariseret fuld længde JEV BAC-DNA

  1. Udfør en storstilet restriktionsenzymfordøjelse af pBAC / SA 14 -14-2 med Xbal i et samlet volumen på 100 pi (indeholdende 3 ug DNA, 60 enheder enzym, 1 × digestionspuffer og 1 × BSA) ved 37 ° C i 12-15 timer. Behandle et 3 pi alikvot af digestion reaktion på en 0,8% agarosegel indeholdende 0,5 ug / ml EtBr.
  2. Digereringsreaktionen inkuberes yderligere med 25 U af mungbønnenuklease (MBN) ved 30 ° C i 2 timer (figur 4A).
  3. Bringe volumenet af Xbal-fordøjet, MBN-behandlede prøve op til 300 pi med dH 2 O. Tilføj et lige volumen af ​​phenol: chloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1) til den fortyndede prøve, vortex kraftigt i 1 min, centrifugering ved 13.400 x g i 10 min, og derefter overføre den øvre vandige fase til en ny 1,7 ml mikrorør. Tilføj et lige så stort volumen chloroform og ekstraktionen gentages proceduren.
  4. Opsaml phenol / chloroform-ekstraheret, lineariseret BAC ved ethanoludfældning: Tilføj 1/10 volumen 3 M natriumacetat og 2,5 volumener 100% ethanol og inkuberes på is i 20 minutter. Centrifuger bundfaldet ved 13.400 x g i 10 minutter, vaskes DNA-pelleten med 1 ml 70% ethanol, og derefter dreje den ned ved fornyet centrifugering.
  5. Air-tørre DNA pellet i 10 min og opløse den i 30 ul dH 2 O. Undersøg en 1 pi alikvot af det udvundne BAC på en 0,8% agarosegel med 0,5 ug / ml EtBr (figur 5A).
  6. Udfør en afstrømning transkription af det lineariserede BAC DNA i et totalt volumen på 25 pi (indeholdende ~ 200 ng template-DNA, 0,8 mM cap-analog [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTP'er, 40 U RNase-inhibitor, 20 U SP6 RNA-polymerase, 72 og 1 × transkription buffer) ved 37 ° C i 1 time (figur 4B). Omfatter 0,5 uM [3H] UTP for RNA kvantificering på basis af [3H] UTP inkorporering, som overvåget ved adsorption til DE-81 filtrerpapir. 69
  7. Kør en 1-2 pi alikvot af afstrømning transkriptionsreaktion på en 0,6% agarosegel indeholdende 0,5 ug / ml EtBr (figur 5B).

7. Bestem RNA Smitteevne og Virus Udbytte

  1. Dyrk BHK-21 celler i 150 mm culture retter ved en densitet på 3 x 10 6 celler / skål i 24 timer ved 37 ° C med 5% CO2.
    Bemærk: Oprethold de BHK-21 celler i alfa minimalt essentielt medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, vitaminer og penicillin / streptomycin.
  2. Skyl cellemonolaget med 10 ml kold opløsning A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na 2 HPO 4, og 1,5 mM KH 2 PO 4). Frigør cellerne fra skålene ved behandling med 4 ml trypsin-EDTA (0,25%), og samle dem ved centrifugering ved 270 x g i en bordcentrifuge i 2 minutter.
  3. Resuspender cellepelleten med 50 ml kold opløsning A i et 50 ml konisk rør og centrifugeres cellesuspensionen ved 270 x g i 2 min. Gentag denne vaskeprocedure tre gange; Efter den sidste vask, resuspender cellepelleten ved en densitet på 2 x 10 7 celler / ml i Sol A.
  4. Bland en 400 ul aliquot af cellesuspensionen med 2 μg syntetisk RNA i en 2-mm hul kuvette, og straks elektroporere blandingen med en elektroporator under optimale elektroporeringsbetingelser: 980 V, 99 mikrosekunder pulslængde, og 5 impulser (Figur 4C).
    Bemærk: Brug 3 H-mærkede RNA syntetiseret i protokol 6.5 direkte for elektroporation uden yderligere rensning.
  5. Efterlad den elektroporerede celler ved stuetemperatur i 10 minutter og overføres til en 1,7 ml mikrorør indeholdende 600 pi komplet dyrkningsmedium.
  6. Der fremstilles en 10-fold seriefortynding af de elektroporerede celler i 1 ml komplet dyrkningsmedium og plade en 100 pi portion af hver fortynding på monolag af unelectroporated BHK-21 celler (5 x 10 5) i en 6-brønds plade.
  7. Efter 4-6 timers inkubation, overlay cellerne med 0,5% agarose i minimalt essentielt medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Pladerne inkuberes i 4 dage ved 37 ° C med 5% CO2.
  8. Visualiser den smitsomme centers (plaques) ved fiksering med 7% formaldehyd og farvning med 1% krystalviolet i 5% ethanol 27 (figur 6A).
    1. Valgfrit: Undersøg RNA-elektroporeret celler ved 18-20 timer efter transfektion for JEV protein ekspression ved immunofluorescensassays 27,73 (figur 6B), og høste supernatanterne fra RNA-elektroporeret celler ved 22 og 40 timer efter transfektion for virus titrering ved plaque-assays 27,63 (figur 6C).

Representative Results

For alle positive-strengede RNA-virusser, pålideligheden og effektiviteten af en revers genetik systemet afhænger genetiske stabilitet af et klonet fuldlængde-cDNA, hvis sekvens svarer til konsensussekvensen af viralt genomisk RNA. 27 Figur 1 viser en fem- trin for konstruktionen af et fuldlængde-infektiøs cDNA som BAC for JEV SA 14 -14-2 28: Trin 1, oprensning af virus-RNA fra cellekultursupernatanten af JEV-inficerede BHK-21 celler (figur 1A); Trin 2, syntese af fire overlappende cDNA amplikoner (F1 til F4), der dækker hele virusgenomet (figur 1B); Trin 3, subkloning af hver af de fire sammenhængende cDNA-fragmenter i en BAC-vektor, hvilket skaber pBAC / F1 til pBAC / F4 (figur 1C); Trin 4, ændring af de klonede cDNA'er for in vitro afstrømning transskription med SP6 RNA-polymerase, dvs at placere en SP6promotorsekvensen umiddelbart opstrøms for den virale 5'-enden (pBAC / F1 SP6), hvilket eliminerer en forud eksisterende interne XbaI-sitet ved nukleotid 9131 ved at indføre en tavs punktmutation, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), og indsættelse en ny kunstig Xbal afstrømning sted umiddelbart nedstrøms for den virale 3'-enden (pBAC / F4 RO) (figur 1D); og trin 5, samling af et fuldlængde SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figur 1E). Tabel 1 viser de anvendte oligonukleotider i denne kloningsprocedure. 28

Til konstruktion af et funktionelt JEV cDNA, det første vigtige skridt er syntesen af de fire overlappende cDNA-fragmenter under anvendelse af det oprensede virus-RNA som en skabelon til RT-PCR. Figur 2 giver et repræsentativt resultat for de fire RT-PCR-produkter, der var elektroforese på en 0,8%agarosegel. Denne gel viser klart, at en fuld-længde cDNA JEV forstærkes i fire overlappende cDNA-fragmenter. Lejlighedsvis, kan RT-PCR-reaktioner, hvilket gav en eller flere yderligere virusspecifikke eller uspecifikke produkter, er for det meste mindre end det forventede produkt, på grund af den ikke-specifikke annealing af primere under cDNA-syntese / amplifikation. På den anden side, lidt eller ingen forventede RT-PCR produkt ville blive forstærket på grund af utilsigtet RNase kontaminering under den virale RNA-isolering eller ukorrekt RT-PCR resultater.

Den næste tast trin er kloningen og ændring af en ikke- selvstændigt eller fuld længde JEV cDNA i BAC, hvilket er en relativt enkel procedure, der bruger standard rekombinant DNA-teknikker. 69 Figur 3 viser et repræsentativt resultat for oprensning af BAC klon indeholdende en fuld-længde cDNA af JEV SA 14 -14-2 ved banding i en CsCI-EtBr-gradient.I dette eksperiment efter centrifugering i 16 timer ved 401.700 x g, to distinkte bånd, dvs. E. coli kromosomalt DNA ovenfor og det supersnoede plasmid-DNA BAC nedenfor, er synlige i midten af røret under langbølget ultraviolet lys. En minimal volumen (~ 400 ul) af det nedre BAC DNA-bånd blev forsigtigt opsamlet ved at stikke et hul med en sprøjte på siden af ​​røret. Efterfølgende blev EtBr ekstraheret fra BAC DNA'et ved butanolekstraktion, og EtBr-fri BAC DNA blev koncentreret ved ethanolpræcipitation.

Det sidste trin er bestemmelse af den specifikke smitsomhed af de syntetiske RNA'er transskriberet in vitro fra fuld-længde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) efter RNA transfektion i tolerante celler (figur 4). Dette trin involverer tre sekventielle trin: Trin 1, linearisering af fuld længde SA 14 -14-2 cDNA ved 3'-enden af det virale genom (figur 4A); Trin 2, produktion af syntetiske RNA'er fra det lineariserede cDNA ved afstrømning transkription (figur 4B); og Trin 3, redning af de rekombinante vira i BHK-21-celler transficeret med de syntetiske RNA'er (figur 4C). Eksperimentelt blev to uafhængige kloner af pBAC / SA 14 -14-2 lineariseret med Xbal fordøjelse og behandlet med MBN at fjerne de fire-base-5'-overhæng genereret af XbaI fordøjelse. De lineariserede BAC'er blev renset ved phenol-chloroform-ekstraktion efterfulgt af ethanolfældning. Linearisering af de to oprensede BAC'er blev demonstreret på en 0,8% agarosegel (figur 5A). Phenol-chloroform-ekstraktion skal udføres omhyggeligt for at sikre, at de lineariserede BAC'er er RNase-fri. Hver af de to lineariserede BAC'er tjente som en skabelon for cDNA afstrømning transskription under anvendelse af SP6 RNA-polymerase i nærvær af m 7 G (5 ') ppp (5') En hætte analog. Integriteten af de syntetiske RNA'er blev vist ved at køre prøver af de to transskription reaktionsblandinger på en 0,6% agarosegel, sammen med en reference 1 kb DNA-stige (figur 5B). I denne enkle assay større fremtrædende RNA band altid migrerede lige under de 3 kb referere DNA-bånd og syntes at være skarpe. Imidlertid nedbrydes RNA ville have en smurt udseende på den samme gel.

En smitsom center analysen er den gyldne standard for at bestemme den specifikke smitsomhed af de syntetiske RNA'er. Dette assay blev udført ved elektroporering BHK-21 celler med RNA-prøver, podning lige portioner af 10-fold seriefortyndet elektroporerede celler i 6-brønds plader indeholdende naive BHK-21-celler (3 x 10 5 celler / brønd), og overlejring agarose på cellemonolagene. Efter inkubation i 4 dage blev overlevende celler fikseret med formaldehyd og farves med et krystalviolet solution at kvantificere antallet af infektiøse centre (plaques), hvilket svarer til antallet af infektiøse RNA-molekyler, der leveres ind i cellerne (figur 6A). Da cDNA skabelon til in vitro-transkription har vist sig at være ikke-infektiøse, blev 27 en alikvot af transskription reaktionsblandingen anvendes direkte til elektroporation. Elektroporation er den foretrukne metode til transfektion RNA; Alternativt kan RNA'er transficeres ved andre metoder under anvendelse af DEAE-dextran og kationiske liposomer. RNA elektroporering er meget effektiv, men "buedannelse" af den elektriske impuls sjældent forekommer, hvis salte er til stede i elektroporation reaktion eller hvis elektroporation cuvette genbruges. Ekspressionen af virale proteiner i RNA-transficerede celler blev undersøgt ved immunofluorescensassays anvendelse af et anti-NS1 kaninantiserum (figur 6B). Produktionen af ​​virale partikler akkumuleret i supernatanterne af RNA-transficerede celler var enalyzed ved plaque-assays (figur 6C). Resultaterne af disse forsøg viser klart, at de cDNA-afledte syntetiske RNA'er er infektiøse i tolerante BHK-21 celler, der genererer en høj titer af rekombinante vira.

Oligonucleotide Sekvens a (5 'til 3') Position b Polaritet
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		1-22 Følelse
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 MyreiSense
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Følelse
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Følelse
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10.952-10.977 Antisense
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Følelse
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956-10.977 Antisense
SP6F cataccccgcgtattcccac
ta 		Følelse
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		1-14 Antisense
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		1-17 Følelse
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Følelse
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Følelse
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10.670-10.694 Følelse
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10.954-10.977 Antisense
et JEV sekvenser er vist med store bogstaver, og BAC-sekvenser er angivet med små bogstaver.
b nucleotidposition refererer til det komplette genom sekvens af JEV SA 14 -14-2 (Genbank JN604986).

Tabel 1: Oligonukleotider anvendt til cDNA-syntese, PCR-amplifikation og BAC mutagenese.

Figur 1
Figur 1.0; for konstruktionen af et fuldlængde-cDNA af JEV SA 14 -14-2 som BAC (A) Isolering af viralt RNA fra JEV partikler.. Vist er et skematisk diagram af den genomiske RNA af JEV SA 14 -14-2. (B) Syntese af fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4), der dækker hele det virale genom. (C) Subkloning af fire overlappende cDNA-fragmenter i en BAC-vektor, hvilket skaber pBAC / F1 til pBAC / F4. (D) Ændring af de klonede cDNA'er for afstrømning transskription in vitro. pBAC / F1 SP6 er et derivat af pBAC / F1, der indeholder SP6 promotorsekvensen opstrøms for den virale 5'-enden. pBAC / F3 KO er et derivat af pBAC / F3, der indeholder en tavs punktmutation (A 9134 → T, asterisk). pBAC / F4 RO er et derivat af pBAC / F4, der indeholder en kunstig Xbal afstrømning nedstrøms af det virale 3'-enden. (E strong>) Montering af en fuld-længde SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Syntese af fire overlappende cDNA-fragmenter (F1 til F4) spænder fuldlængde genomisk RNA fra JEV SA 14 -14-2. De fire RT-PCR-produkter bedømmes ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA-stige. De forventede størrelser af de fire cDNA fragmenterne er angivet i bunden af gelen billedet. Klik her for at se en større version af dette tal.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Figur 3. Oprensning af BAC, der indeholder en fuld-længde cDNA af JEV SA 14 -14-2. Er BAC plasmid isoleret fra E. coli DH10B af SDS-alkalisk lyse fremgangsmåde og yderligere oprenset ved banding i en CsCI-EtBr-gradient. Præsenteret er et eksempel på den CsCI-EtBr gradient ved hjælp af en 16 × 76 mm rør forsegles polypropylen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Oversigt over inddrivelse af smitsomme vira fra en fuld-længde JEV SA 14 -14-2 cDNA samlet i en BAC. (A) Linearisering af cDNA skabelon. Fuldlængde JEV BAC skæres medXbal og behandlet med MBN. (B) Syntese af RNA-transkripter. Det lineariserede cDNA transskriberet af SP6 RNA-polymerase i nærvær af m 7 G (5 ') ppp (5') En hætte analog. (C) Inddrivelse af det syntetiske JEVs. In vitro transskriberede RNA er transficeret i BHK-21 celler ved elektroporation, som genererer en høj titer af syntetisk virus. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5. Syntese af RNA'erne ved in vitro transcription under anvendelse af en fuld-længde JEV BAC som cDNA skabelon. (A) Fremstilling af den lineariserede fuld længde JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. To uafhængige kloner af pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 og Cl.2) lineariseres ved fordøjelse med Xbal og efterfølgende behandling med MBN. De lineariserede BAC'er undersøges ved elektroforese i en 0,8% agarosegel. (B) Fremstilling af de syntetiske RNA'er ved afstrømning transskription. Hver af de to lineariserede BAC'er anvendes som en skabelon for SP6-RNA-polymerase afstrømning transkription. Portioner af de to transcription reaktioner kørt på en 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA-stigen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Specifik infektivitet af de syntetiske RNA'er transskriberet fra en fuld-længde JEV BAC og nyttiggørelse af syntetisk virus. BHK-21 celler er mock-elektroporeret (Mock) eller elektroporeret med de RNA-transkripter afledt from hver af de to uafhængige kloner af fuld længde JEV BAC (Cl.1 og Cl.2). (A) RNA infektivitet. Cellerne overlejret med agarose og farvet med krystalviolet 4 dage efter transfektion. RNA-infektivitet bestemmes af smitsomme center analyser til at estimere mængden af ​​infektiøst RNA elektroporeret ind i cellerne (venstre panel). Desuden er repræsentative billeder af infektiøse centre vist (højre panel). (B) Protein ekspression. Cellerne dyrkes i 4-brønds kammerobjektglas. Viralt protein ekspression i RNA-elektroporeret celler ved 20 timer post-transfektion (HPT) analyseres ved immunofluorescensassays anvendelse af en primær anti-NS1 kaninantiserum og et sekundært Cy3-konjugeret gede anti-kanin IgG (rød). Kernerne er modfarvet med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (blå). Immunofluorescens billeder overlejres på deres tilsvarende differentielle interferenskontrastudstyr billeder. (C) Virus udbytte. Cellerne dyrkes i 150 mm dyrkningsskåle. Produktionen af infektiøse virioner akkumuleret i dyrkningssupernatanterne af RNA-elektroporerede celler ved 22 og 40 HPT undersøges af plakanalyser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den nuværende protokol er med succes blevet brugt til at generere fuld længde infektiøse cDNA kloner for to forskellige stammer (CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28) JEV, et flavivirus hvis funktionelle cDNA har vist sig at være meget vanskeligt at konstruere og udbrede grund af værtscelle toksicitet og den genetiske ustabilitet af det klonede cDNA 8,74-76 Denne protokol omfatter tre hovedkomponenter:. første, maksimere syntesen / amplifikation af en tro cDNA-kopi af virus-RNA ved anvendelse af high-fidelity reverse transcriptase / DNA-polymerase; andet kloning af virale prM-E-kodende region indeholder toksiske sekvenser (upublicerede data) 74,77,78 i en meget lav kopiantal vektor BAC fra den oprindelige cDNA subkloning til det endelige cDNA monteringstrin i fuld længde; og for det tredje anvendelse af en kloningsvektor BAC, der kan rumme et fremmed DNA med en gennemsnitlig størrelse på 120-350 kb, 19-21 som tilsyneladende tåler større DNA Inserts end andre kloningsvektorer. Denne kloning tilgang vil være generelt gældende for mange andre positive-streng RNA-virus, især dem med en stor RNA genom ~ 10 til 32 kb. Dannelse af en infektiøs cDNA-klon er et vigtigt skridt i udviklingen af ​​et omvendt genetik for RNA-vira, især for positive-strengede RNA-virusser, fordi dens genom virker som viral mRNA, som translateres til proteiner ved værtscellelinier ribosomer. Således kan viral replikation initieres ved indføring af et cDNA-afledt genomlængde RNA-molekyle i en modtagelig værtscelle. Tilgængeligheden af et infektiøst cDNA-klon JEV, når de kombineres med rekombinant DNA-teknologi, har øget vores forståelse af forskellige aspekter af den virale livscyklus på det molekylære niveau, såsom genekspression 73,79 og genomreplikation. 63,64 Også en fuld længde JEV-cDNA-klon har vist sig at være et værdifuldt redskab til udvikling af antivirale vacciner 28 og gen-levering vektorer. <sup> 80,81

Som med alle positive-strengede RNA-virusser, der er flere kritiske trin i at konstruere en pålidelig funktionel cDNA for JEV hvorfra stærkt smitsomme RNA'er kan syntetiseres in vitro. Ideelt set bør sekvensen af ​​de syntetiske RNA'er transskriberet fra en klon af fuld-længde cDNA være identisk med det virale genomiske RNA, især de 5'- og 3'-terminale sekvenser, der er nødvendige til initiering af viral RNA-replikation . 60-62 I den nuværende protokol, det autentiske 5'- og 3'-ender blev sikret ved at placere SP6 promotorsekvensen opstrøms for den første adeninnukleotid af det virale genom og anbringelse af en unik kunstig XbaI restriktionssite nedstrøms for den sidste thyminnukleotid af det virale genom, henholdsvis. Udjævnede syntetiske RNA'er med autentiske 5'- og 3'-ender blev fremstillet ved afstrømning transkription af et Xba I-lineariseret og MBN-behandlede cDNA template hjælp SP6 RNA-polymerase primet med m 7 G (5 ') ppp (5') En hætte analog. Denne protokol kan modificeres på flere måder. For in vitro-transkription, kan en anden bakteriofag RNA-polymerase (fx T3 eller T7) anvendes i forbindelse med sin veldefineret promotorsekvens. 27 Som afstrømning site, kan et andet restriktionssted anvendes, hvis det ikke er til stede i det virale genom, og hvis syntetisk RNA fra det lineariserede cDNA ender med autentiske 3'-enden. Betydningen af 3'-enden nukleotidsekvensen er blevet påvist ved en ~ 10-fold fald i RNA-infektivitet, når et syntetisk RNA indeholder tre eller fire virus-relateret nukleotider i sin 3'-ende. 27 i en in vitro transkriptionsreaktion, både m 7 G (5 ') ppp (5') A og m 7 G (5 ') ppp (5') G cap analog kan anvendes lige godt, selv om de sidstnævnte steder en uafhængig ekstra G-nukleotid opstrøms for viral 5 '-end, menDesuden ændrer ikke infektivitet eller replikation af syntetisk RNA. 27 Endvidere fjernelse af cDNA-skabelon fra RNA-transkripter af DNase I fordøjelsen er ikke nødvendig for RNA infektivitet tests, fordi cDNA selve skabelonen ikke er infektiøse. 27

BAC-teknologi er nu blevet anvendt på konstruere infektiøse cDNA kloner for en håndfuld positiv-strengede RNA-vira, nemlig to JEVs, CNU / LP2 27 og SA 14 -14-2 28 (genom størrelse, ~ 11 kb); to denguevirusser, BR / 90 26 og NGC 29 (~ 11 kb); bovin virus diarré-virus, SD1 (~ 12 kb), 25 to klassisk svinepest virus, C og Paderborn (~ 12 kb), 24 grænsen disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 den porcint reproduktions- og respiratorisk syndrom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb), 30 den overførbar gastroenteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb), 16 af felin infektiøs peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb), 32 den alvorlige akut respiratorisk syndrom coronavirus, Urbani (~ 30 kb) 9 Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 og den menneskelige coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Den største fordel ved at anvende BAC'er til cDNA konstruktion er den høje genetiske stabilitet af de store, 1- eller 2-kopi BAC plasmider.; imidlertid er den iboende natur sin ekstremt lavt kopiantal også en stor ulempe, på grund af meget lave udbytter af BAC DNA og den deraf følgende reduktion i renheden af ​​BAC DNA med hensyn til værtens kromosomale DNA. I den nuværende protokol, er udbyttet af BAC-DNA maksimeret ved at dyrke E. coli DH10B transformeret med det infektiøse BAC pBAC / SA 14 -14-2 i en næringsrig medium, 2 x YT. På trods af denne indsats, det gennemsnitlige udbytte er kun ~ 15 ug BAC DNA fra 500 ml 2 x YT-medium. Desuden er renheden af ​​BAC DNA bedst opnås ved anvendelse af CsCl-EtBr densitetsgradientcentrifugering til oprensningSnarere end den almindeligt anvendte kolonne-baserede plasmid isolation. Det er imidlertid vigtigt at huske på, at BAC-transformerede E. coli bør ikke overgrow fordi det kan true den genetiske stabilitet af det klonede cDNA, og højere vækst ikke nødvendigvis føre til større udbytter eller højere renhed BAC DNA.

Den her beskrevne protokollen er et optimeret, effektiv og strømlinet metode til konstruktion og udbredelse af en genetisk stabil fuld længde infektiøse cDNA klon som BAC for JEV, en procedure, engang troede praktisk taget umuligt. Det samme kloningsstrategi kan også anvendes til mange andre positive-strengede RNA-vira. Generelt infektiøse cDNA-kloner gør det muligt at indføre en række mutationer (f.eks deletioner, insertioner og punktmutationer) i et viralt RNA-genom at studere deres biologiske funktioner i virusreplikation og patogenese. Denne cDNA-baseret revers genetik system gør det muligt at udvikle og TESt-vaccine og terapeutiske kandidater rettet mod en virulensfaktor (e) af en bestemt positiv-streng RNA-virus af interesse. Desuden kan denne smitsomme cDNA-teknologi også anvendes som en viral vektor, der kan udtrykke et fremmed gen (er) af interesse for mange anvendelser inden for biomedicinsk forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

Immunologi reverse genetik infektiøs cDNA bakteriel kunstige kromosom RNA-virus enkeltstrenget positiv forstand infektion replikation patogenese flavivirus japansk hjernebetændelse virus
Bakteriel kunstige kromosomer: En funktionel Genomics værktøj for Studiet af Positiv-RNA-vira
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter