Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53164
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Animal, Dairy, and Veterinary Sciences, Utah Science Technology and Research, College of Agriculture and Applied Sciences, Utah State University

Introduction

Voor RNA virologen de komst van recombinant DNA technologie in de late jaren 1970 maakte het mogelijk om virale RNA-genomen om te zetten in cDNA-klonen, die vervolgens kan worden vermeerderd zoals plasmiden in bacteriën voor de genetische manipulatie van RNA-virussen. 1 het eerste RNA-virus te zijn moleculair gekloond was bacteriofaag Qp, een positieve streng RNA virus dat Escherichia coli infecteert. Een plasmide dat een volledige cDNA kopie van de Qp-genoom RNA leidde tot infectieuze fagen QP wanneer ingebracht in E. coli. 2 Kort daarna deze techniek werd toegepast op poliovirus, een positieve streng RNA-virus van mens en dier. Een plasmide dat een cDNA van volledige lengte van het poliovirus genomische RNA infectieus wanneer getransfecteerd in zoogdiercellen en staat de productie van infectieuze virions 3 In deze "-DNA geïntroduceerd" werd de gekloneerde cDNAs moeten intracellulair getranscribeerd virale RNA replicatie te initiëren.;het is echter onduidelijk hoe de transcriptie wordt geïnitieerd en hoe de transcripten worden verwerkt om de juiste virale sequentie. Deze bezorgdheid heeft geleid tot de ontwikkeling van een alternatieve "-RNA gestart" benadering, waarbij een volledige cDNA-kopie van het virale RNA-genoom is gekloneerd onder een promoter herkend door een E. coli of faag RNA-polymerase voor het produceren van synthetische RNA's in vitro met gedefinieerde 5 'en 3' uiteinden, waarbij de volledige virale replicatiecyclus ondergaan wanneer ingebracht in gastheercellen. 4,5 Het eerste succes van deze benadering werd gerapporteerd brome mosaic virus 6,7 een positieve streng RNA-virus van planten. Sindsdien is de RNA-gelanceerd aanpak ontwikkeld voor een breed scala aan positieve streng RNA-virussen, waaronder calicivirussen, alfavirussen, flavivirussen, arterivirussen en coronavirussen. 1,4,5,8

In zowel de DNA- en RNA-gelanceerde reverse genetics systemen, de bouw van een vl-cDNA-kloon is de sleutel tot het genereren van infectieus DNA of RNA van positieve streng RNA virussen, maar het wordt een aanzienlijke technische uitdaging als de grootte van het virale genoom toeneemt. 17/09 met name een groot RNA-genoom van ~ 10 -32 kb bevat drie belangrijke obstakels voor het klonen van een full-length cDNA functioneel. 18 Het eerste probleem is de synthese van een cDNA getrouwe kopie, aangezien de betrouwbaarheid van RT-PCR is omgekeerd evenredig met de lengte van het virale RNA. De tweede hindernis is de aanwezigheid van potentieel toxische sequenties, al lang RNA moleculen vaker onverwachte sequenties die in staat is de cDNA-fragment in onstabiele plasmiden in E. bevatten coli. De derde en meest kritische punt is de beschikbaarheid van een geschikte vector, aangezien het moeilijk is een kloneringsvector die een virale cDNA-insert van> 10 kb kunnen onderbrengen vinden. In de afgelopen drie decennia hebben deze barrières overwonnen door een aantal ontwikkelingen in de enzymologie, methodologie, eend vectorology. 1,4,5,8 Van deze, de meest veelbelovende en innovatieve ontwikkeling is het klonen van grote positieve streng RNA-virussen zoals besmettelijke bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC). De BAC vector is een low-copy klonen plasmide (1-2 kopieën / cel) op basis van de E. coli vruchtbaarheid factor, met een gemiddelde grootte van insert DNA ~ 120-350 19-21 kb DNA-fragment wordt in de BAC vector op een gelijkaardige manier ingevoegd kloneren in algemene kloneringsvectoren.; de verkregen BAC klonen stabiel gedurende vele generaties E. coli. 22,23 Tot op heden heeft het RCB technologie gebruikt van infectieuze cDNA-klonen voor> 10 leden van drie positieve streng RNA virus families, namelijk Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 en Coronaviridae creëren. 9,16,17 , 31,32

Met behulp van Japanse encefalitisvirus (JEV) als voorbeeld, dit werk rapporteert de gedetailleerde procedures die kunnen wordengebruikt om een ​​genetisch stabiele full-length infectieuze BAC voor verschillende positieve streng RNA-virussen te construeren. JEV is een zoönotische flavivirus 33 die in de natuur tussen vogels, varkens en andere gewervelde gastheer wordt overgebracht door muggen vectoren. 34,35 Bij mensen JEV infectie kan het ernstige vaak dodelijke neurologische ziekte Japanse encefalitis (JE), 36 die optreedt in Azië en delen van de westelijke Stille Oceaan, 37,38 met een geschatte jaarlijkse incidentie van ~ 50,000-175,000 klinische gevallen. 39,40 Het genoom van JEV is een ~ 11-kb, enkelstrengs, positieve-sense RNA-molecuul en bestaat uit een enkel open leesraam (ORF) geflankeerd door twee niet-coderende regio (NCR) van het 5 'en 3' uiteinden. 41,42 Het ORF codeert voor een polyproteïne dat wordt gesplitst door gastheer en virale proteases tot 10 afzonderlijke eiwitten genereren aangewezen C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B en NS5 in de N- naar C-terminus. 34,43,44 Ook eXtended vorm van NS1 (NS1) wordt door -1 ribosomale frameshifting uitgedrukt in codons 8-9 van NS2A. 45,46 Van deze 11 eiwitten, de drie structurele eiwitten (C, prM en E) zijn essentieel voor de vorming van infectieuze virions, 47,48 en de resterende acht structurele eiwitten (NS1 tot NS5 en NS1 ") zijn noodzakelijk voor virale RNA-replicatie, 49-51 deeltje assemblage, 52-56 en aangeboren immuniteit fraude. 57-59 zowel de 5 'en 3 'NCRs bevatten geconserveerde primaire sequenties en vorm RNA secundaire / tertiaire structuren, 60-62 die belangrijk zijn voor het moduleren van viraal RNA replicatie. 63,64

Dit protocol beschrijft de gereedschappen, werkwijzen en strategieën voor het genereren van een full-length infectieuze BAC van JEV SA 14 -14-2. 28 Deze functionele BAC kloon bevat een volledig cDNA kopie van het RNA genoom JEV, 65 die is omgeven door een promoter de SP6 RNA polymerase upstreamvan de virale 5'-uiteinde en een unieke XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van het virale 3'-end in vitro run-off transcriptie. Deze BAC technologie is toepasbaar op het construeren van een volledig functionele cDNA-kloon moleculaire voor een serie van positieve streng RNA virussen.

Protocol

Opmerking: Figuur 1 geeft een strategie voor de bouw van een full-length besmettelijke JEV cDNA als een BAC 28 Tabel 1 geeft een overzicht van de oligonucleotiden die in dit protocol 28..

1. Extract Virale RNA van JEV Deeltjes in celkweeksupernatanten

  1. Begin met de celkweek medium dat JEV SA 14 -14-2, een levend JE vaccinvirus dat Biosafety Level 2 insluiting vereist.
    Opmerking: De virale titer ongeveer 1-3 x 10 6-plaque-vormende eenheden / ml.
  2. Neem de bioveiligheid opleiding die nodig is voor alle standaard microbiologische praktijken, veiligheidsuitrusting en laboratoriumfaciliteiten voorafgaand aan het werken met JEV SA 14 -14-2.
  3. Zuiver viraal RNA uit een monster van het virus-bevattende celkweek medium voor monofasische oplossing van fenol en guanidine isothiocyanaat 66 (Figuur 1A).
    1. Advertentied 600 ul van de monofasische reagens om 200 ul van het kweeksupernatant in 1,7 ml microbuisjes. Homogeniseer het mengsel met de hand schudden van de buis krachtig gedurende 30 seconden en incubatie gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Voeg 160 ul chloroform om het gehomogeniseerde monster. Meng met de hand schudden van de buis krachtig gedurende 15 seconden en laat het voor 2-3 min bij RT.
    3. Centrifugeer de totale lysaat bij 13.400 xg gedurende 15 min bij 4 ° C, waardoor een scheiding van twee vloeibare fasen, namelijk een onderste organische fase en een bovenste waterige fase. Breng de bovenste waterige fase (minder dan 200 pl) met het RNA een nieuwe microbuisjes.
    4. Neerslaan van de RNA door toevoeging van 1 pi 5 pg / pl glycogeen en 400 pi 100% isopropanol en incubatie gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
    5. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en was de RNA pellet met 1 ml 75% ethanol per puls-vortexen 4:57tijden en centrifugeren bij 13.400 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.
    6. Air-droog de ​​RNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 40 ul van dH 2 O. Bewaar de geëxtraheerde RNA bij -80 ° C tot gebruik.

2. Synthetiseren een set van vier overlappende cDNA Fragments (F1 tot F4) die de gehele virale genoom RNA door reverse transcriptie (RT) -PCR

  1. Voer een 20 ui RT reactie met een 10 pl aliquot van de gezuiverde virale RNA als een matrijs en een gemodificeerde vorm van Moloney murine leukemievirus reverse transcriptase. 67
    1. Opzetten van een 13 pi mengsel dat 10 ul van het gezuiverde RNA, 1 ui 10 mM dNTP mix, 1 ui 4 pmol / ul primer en 1 pl dH 2 O. Gebruik het fragment-specifieke primer voor elke RT-reactie: 1RT voor F1, 2RT voor F2, 3RT voor F3 en 4RT voor F4.
    2. Incubeer het mengsel bij 65 ° C gedurende 5 min, plaats op ijs gedurende 1 minuut, en vervolgens snel draai aan de conte verzamelennts op de bodem van de buis.
    3. Voeg 4 pi 5 x RT-buffer, 1 ui 0,1 M DTT, 1 gl 40 U / gl RNase-remmer en 1 pl 200 U / ul reverse transcriptase. Meng door op en neer pipetteren 3 om 5 keer.
    4. Laat de reactie verlopen bij 50 ° C gedurende 1 uur, vervolgens hitte-inactivatie van het monster bij 70 ° C gedurende 15 min. Bewaar de gesynthetiseerde eerste streng cDNA bij -20 ° C tot gebruik.
  2. Voer een 100 ui PCR-reactie met een 5 pl aliquot van het warmte geïnactiveerd RT-reactie als een matrijs en een high-fidelity thermostabiele DNA polymerase 68 (Figuur 1B).
    1. Stel een 100 ul PCR reactiemengsel op ijs, bevattende 5 ui van de RT-reactie, 20 ui 5 x PCR-buffer, 4 ui 10 mM dNTP mix, 5 pl 10 pM forward primer, 5 ul 10 uM reverse primer, 1 ui 2 U / ul DNA-polymerase en 60 pl dH 2 O. Gebruik de fragment-specifieke primer paar voor elke PCR keuze reactietijdn: 1F + 1R voor F1 (2573 bp), 2F + 2R voor F2 (4171 bp), 3F + 3R voor F3 (3922 bp), en 4F + 4R voor F4 (1798 bp).
    2. Meng voorzichtig door vingers flipping de buis 3 tot 5 maal en centrifuge kort om de inhoud te verzamelen op de bodem.
    3. Begin thermische cycli met een initiële denaturatie stap van 30 sec bij 98 ° C gevolgd door 25-30 cycli met de volgende PCR profiel: 10 sec bij 98 ° C, 30 sec bij 60 ° C en 1-2 min (30 s / kb) bij 72 ° C. Bewaar de PCR producten bij 4 ° C tot analyse.
  3. Voer een 2-5 pi aliquot van elke PCR reactie op een 0,8% agarosegel bevattende 0,5 ug / ml ethidiumbromide (EtBr) (Figuur 2).
    LET OP: EtBr is een krachtige mutagene stof en vereist lab jassen, veiligheidsbril en handschoenen te dragen en de uiterste voorzichtigheid tijdens het gebruik, de opslag en verwijdering in acht te nemen.

3. Subkloneer elk van de vier cDNA Fragments (F1 tot F4) in een BAC Vector om pBAC / F1 tot pBAC / F4 b Maaky Molecular Cloning Techniques

  1. Digest de vector en steek DNAs met twee geschikte restrictie-endonucleasen, zoals:
    1. Voer een sequentiële digestie van pBAC / PRRSV / FL (vector), 30 een derivaat van de pBeloBAC11 plasmide (7507 bp, GenBank toegangsnummer U51113), met PmeI en NotI in een totaal volume van 60 ui (met ~ 500 ng DNA , 10 eenheden enzym, 1x digestiebuffer en 1 x BSA) bij 37 ° C gedurende 12-15 uur, waarbij het 15.426 bp vectorfragment oplevert.
    2. Voer een sequentiële digestie van elk van de vier cDNA-amplicons (insert) met Smal en Notl in een totaal volume van 60 pl (met ~ 1 ug DNA, 20 eenheden enzym, 1 × digestiebuffer en 1 x BSA) en 25 ° C (Sma I) of 37 ° C (Notl) voor 12-15 uur, waarbij de volgende insert fragmenten van de gewenste grootte oplevert: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), en F4 (1784 bp).
  2. Zuiveren degewenste vector en insert-DNA-fragmenten door gel-extractie.
    1. Scheid de dubbel gedigereerde producten op een 1% laag smeltpunt agarose gel bevattende 0,5 ug / ml EtBr. Snijd een band van het gewenste DNA-fragment met een minimale hoeveelheid agarose (meestal ~ 200 ul) onder langgolvig ultraviolet licht.
    2. Voeg een gelijk volume van TEM-buffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA en 10 mM MgCl 2) naar de uitgesneden agarose in 1,7 ml microbuisjes. Incubeer het monster bij 72 ° C gedurende 10-15 min met vortexen elke 2-3 min totdat de agarose volledig gesmolten is.
    3. Voeg een gelijk volume van voorverwarmde buffer-verzadigde fenol, vortex krachtig gedurende 1 min en centrifugeer bij 13.400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Het mengsel scheidt in een lagere organische fase en een bovenste waterige fase. Breng de bovenste waterige fase die het DNA met een nieuwe microbuisjes.
    4. Voeg een gelijk volume chloroform: isoamylalcohol (24: 1), vortex gedurende 1 minuut, en centrifugeer bij 13,400 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe microbuisjes.
    5. Voeg 0,5 ul van 10 ug / ul tRNA, 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol. Houd het mengsel op ijs gedurende 20 min.
    6. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder de supernatant en was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol door vortexen pulse-3 om 5 maal en centrifugeren bij 13.400 xg gedurende 10 min.
    7. Lucht-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 20 ui TE-buffer (10 mM Tris-Cl en 1 mM EDTA [pH 7,6]).
  3. Afbinden de gewenste vector en insert-DNA-fragmenten onder toepassing van T4 DNA ligase.
    1. Opzetten van een 20 gl ligatiereactie met 50-100 ng van de vector DNA, een ~ 3-voudige molaire overmaat van het insert DNA, 400 U T4 DNA ligase en 1 x ligatiebuffer. Incubeer de ligatiereactie bij 16 ° C gedurende 12-15 uur.
      NB: Inclusief een negatief control reactie, dat wil zeggen, vector alleen zonder de insert, in parallel.
    2. Voeren vier afzonderlijke ligaties, elke toetreding tot de 15.426-bp Pme I- Niet fragment van pBAC / PRRSV / FL met de 2559-bp (F1), 4157-bp (voor F2), 3908-bp (voor F3), of 1784-bp (voor F4) SmaI-NotI fragment van een van de vier cDNA amplicons te subklonen pBAC / F1 tot pBAC / F4 genereren.
  4. Transformeren de geligeerde DNA in E. coli DH10B door de CaCl2 -Warmte schok-methode.
    1. Neem 100 gl aliquots van de CaCl2-behandelde competent DH10B cellen 69 bewaard bij -80 ° C en ontdooien ze op ijs.
      Opmerking: Gebruik 100 ul cellen per transformatie.
    2. Voeg 10 pi aliquot van het DNA ligatiereactie met 100 ul van de ontdooide cellen in 1,7 ml microbuisjes, meng voorzichtig door de buis te tikken en houden op ijs gedurende 30 min.
    3. Heat-shock DNA-cel mengsel gedurende 45 seconden in een 42 ° C water bad, plaats op ijs gedurende 2 minuten en voeg dan 900 ul van LB bouillon voorverwarmd tot kamertemperatuur.
    4. Incubeer de warmte geschokt cellen bij 35 ° C gedurende 1 uur met schudden bij 225-250 rpm.
    5. Verspreid 50 om 200 gl aliquots van de gekweekte cellen op LB-agarplaten die 10 ug / ml chlooramfenicol (CML). Houd de platen bij RT, de goede kant op, totdat ze droog zijn.
    6. Draai de platen om en incubeer bij 35 ° C gedurende 15 uur.
  5. Herstel het gekloneerde BAC DNA van de gastheercellen door kolommen gebaseerde zuiveringswerkwijze (figuur 1C).
    1. Pick 8 6 om bacteriekolonies van de LB-agarplaten Cml en beënt ze in 3 ml 2 x YT-bouillon die 10 ug / ml Cml. Incubeer de kweken bij 35 ° C gedurende 10 uur onder krachtig schudden (225-250 rpm).
    2. Isoleer recombinant BAC DNA 1-1,5 ml van de bacteriële culturen met behulp van spin-kolommen, zoals voorgeschreven door de fabrikant. 70 Elueer de geëxtraheerde DNA (Typitisch 100-200 ng) in 20 ui TE-buffer.
    3. Voer twee analytische restrictie-enzym digesties van de geïsoleerde BAC's voor ~ 6 uur in een totaal volume van 10 pi, een aan de aanwezigheid van de vector identificeren met een correcte insert met dezelfde enzymen die voor klonering (zie protocol 3,1), en de andere om de integriteit van het gekloneerde BACs testen met een geschikt enzym (bijvoorbeeld, Bgl II, Nco I, of Pst I), het genereren van een unieke restrictiefragmentenpatroon.
    4. Propageren juiste gekloneerde BACs door het enten 500 pl van de positieve bacterieculturen (van Protocol 3.5.1) in 500 ml 2xYT-Cml medium en kweken van de inoculum voor 6 uur bij 35 ° C onder schudden bij 225-250 tpm. Zuiver het BAC DNA (meestal 10-20 ug) uit de kweek 500 ml met behulp filter columns, zoals aanbevolen door de fabrikant. 71
      Opmerking: De eerste vier BAC-subklonen, die elk een cDNA-fragment van JEV genoom RNA kan blijken te hebben ope of meer ongewenste mutatie (s) in vergelijking met de consensus sequentie van het virale genoom 42 (die dient als referentie sequentie). Dergelijke mutatie moet worden gecorrigeerd door PCR-gebaseerde plaatsgerichte mutagenese voor de montage van een full-length JEV cDNA. 27

4. Maak een Full-length JEV cDNA met 5 'SP6 promotor en de 3' Run-off site

  1. Maak drie genetische modificaties (zie hieronder protocollen 4.1.1-4.1.3) in de gekloneerde cDNAs in vitro run-off transcriptie van genoom-RNA's length zodat de authentieke 5 'en 3' einden van het virale genoom.
    1. Algemeen gebruik van een SP6-promoter direct stroomopwaarts van het einde van het virale genoom van de 5 'van overlap extensie PCR (figuur 1D, pBAC / F1 SP6).
      1. Amplify twee overlappende DNA-fragmenten via de eerste standaard PCR van pBAC / F1 met de twee primerparen SP6F + SP6R (grootte product, 173 bp) en F1F + F1R (product size, 676 bp), elk in een 50 pi reactie die 1 pl matrijs-DNA (~ 200 pg / pl), 10 pi 5 x PCR-buffer, 2 ui 10 mM dNTP, 2,5 pi elk 10 uM voorwaartse en omgekeerde primers, 0,5 gl 2 U / ul DNA-polymerase, 68 en 31,5 pl dH 2 O. Voer de PCR met de volgende cycling profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 20 sec.
      2. Gel zuiveren de twee PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten na het uitvoeren van elk van de twee PCR-producten op een 1,5% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      3. Fuseren de twee-gel gezuiverde DNA-fragmenten via het tweede fusie PCR met de buitenste primers SP6F + F1R (productgrootte, 821 bp) in een 100 ui reactie met 1 gl elk van de twee gezuiverde DNA-fragmenten (~ 100 pg / pl), 20 ui 5 x PCR-buffer, 4 ui 10 mM dNTP, 5 pl 10 pM elk van voorwaartse en omgekeerde primers, 1 gl2 U / ul DNA-polymerase, 68 en 63 pl dH 2 O. Gebruik de volgende thermische cyclus profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 30 sec.
      4. Gel zuiveren het gefuseerde PCR amplicon van een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      5. Voer de vijf stappen procedure kloneren protocollen 3,1-3,5 beschreven om het 760-bp Pac I BsiWI fragment van de gel gezuiverd gefuseerd PCR amplicon ligeren met de 9532-bp Pac I BsiWI fragment van pBAC / F1 genereren pBAC / F1 SP6.
    2. Verwijder de bestaande interne XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie (A 9134 → T) via overlap extensie PCR (figuur 1D, pBAC / F3 KO).
      1. Amplify twee overlappende DNA-fragmenten door de eerste standaard PCR van pBAC / F3 met beide primer paren X1F + X1R(product grootte, 746 bp) en x2F + X2R (grootte product, 316 bp) in een 50 ul reactie onder de in protocol 4.1.1.1 beschreven experimentele omstandigheden.
      2. Gel zuiveren de twee PCR-geamplificeerde DNA-fragmenten na elektroforetische scheiding op 1,5% laag smeltpunt agarose gels, zoals in protocol 3,2.
      3. Fuseren de twee gel-gezuiverde DNA-fragmenten via de tweede fusie PCR met behulp van de buitenste primers X1F + X2R (product grootte, 1033 bp) in een 100 ul reactie onder de in protocol 4.1.1.3 beschreven experimentele omstandigheden.
      4. Gel zuiveren het gefuseerde PCR amplicon van een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      5. Voer de vijf stappen procedure kloneren protocollen 3,1-3,5 beschreven om het 949-bp Avr II NotI fragment van de gel gezuiverd gefuseerd PCR amplicon ligeren met 16.245 bp geen I- BsiWI en 2141-bp Bsi W I - AvrII fragmenten van pBAC / F3 om pBAC / F3 KO te produceren.
      </ li>
    3. Ingenieur een nieuwe kunstmatige XbaI afvloeiing plaats net stroomafwaarts van het 3'-uiteinde van het virale genoom door PCR-gebaseerde plaatsgerichte mutagenese (figuur 1D, pBAC / F4 RO).
      1. Genereer een DNA-fragment door PCR van pBAC / F4 met primers ROF + ROR (productgrootte, 324 bp) in een 100 pi reactie die 1 pl matrijs-DNA (~ 200 pg / pl), 20 pi 5 x PCR-buffer, 4 pl 10 mM dNTPs, 5 ui elk van 10 pM forward en reverse primers, 1 gl 2 U / ul DNA-polymerase, 68 en 64 pl dH 2 O. Voer de PCR met de volgende cycling profiel: 98 ° C gedurende 30 sec, en 25 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 sec en 72 ° C gedurende 15 sec.
      2. Gel-zuiveren het PCR-geamplificeerde DNA-fragment uit een 1% laag smeltpunt agarose gel, zoals beschreven in protocol 3,2.
      3. Voer de vijf stappen klonen procedure protocollen 3,1-3,5 beschreven ligeren de 283-bp Sfi I Not fragment van de gel gezuiverd PCR amplicon met 16.933 bp Sfi I-Not I fragment van pBAC / F4 tot pBAC / F4 RO creëren.
  2. Monteer een set van de vier gewijzigde, overlappende cDNA's in een enkele full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) door deel te nemen aan drie natuurlijke restrictie sites (BsrGI, Bam HI, en Ava I ) op een sequentiële wijze met vijf stappen klonering procedures beschreven in Protocols 3,1-3,5 (Figuur 1E): F1 SP6 SP6 → F1 F2 (door vervanging van de Bsr G I- NotI fragment van pBAC / F1 SP6 met die van pBAC / F2) → F1 SP6 F2F3 KO (door vervanging van de BamH I- NotI fragment van pBAC / SP6 F1 F2 met die van pBAC / F3 KO) → F1 SP6 F2F3 KO F4 RO (door vervanging van de Ava I-NotI fragment van pBAC / F1 SP6 F2F3 KO met die van pBAC / F4 RO).

5. Maak een hoge zuiverheid Maxi-prep van de Full-length SA 14 -14-2 BAC

  1. Kweek een enkele kolonie van E. coli DH10B uitvoering pBAC / SA 14 -14-2 in 3 ml 2 x YT-bouillon die 10 ug / ml Cml gedurende 10 uur bij 35 ° C met schudden bij 225-250 rpm, en vervolgens opgeschaald door het enten 500 pl van de 10 hr bacteriekweek in 500 ml 2xYT-Cml medium en kweken van de inoculum voor 6 uur bij 35 ° C onder krachtig schudden.
  2. Centrifugeer de bacteriële kweek in twee 250 ml flessen bij 3107 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. Resuspendeer elk pellet in 30 ml GTE-oplossing (50 mM glucose, 25 mM Tris-Cl en 10 mM EDTA [pH 8,0]), en voeg vervolgens 500 pl van 60 mg / ml lysozym. Incubeer de beide celsuspensies op ijs gedurende 10 min.
  3. Voeg 60 ml vers gemaakte Lysis oplossing (0,2 N NaOH en 1% SDS) aan elke celsuspensie, meng goed totdat duidelijk, en houdt de lysatenbij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  4. Voeg 45 ml Neutralisatie-oplossing (100 ml, bestaande uit 60 ml 5 M kaliumacetaat, 11,5 ml ijsazijn en 28,5 ml dH 2 O) aan elke fles, meng goed door omkeren van de flessen, en incubeer de geneutraliseerde lysaten op ijs gedurende 10 min.
  5. Centrifugeer de geneutraliseerde lysaten bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de supernatant van beide flessen in twee nieuwe flessen van 250 ml; Voeg 0,6 volume van 100% isopropanol aan elkaar, en houd ze op ijs gedurende 20 minuten.
  6. Spin down de precipitaten bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Oplossen elke pellet in 5 ml TE-buffer, combineren in een 50 ml buis (10 ml totaal) en neerslaan van de RNA door toevoeging van een gelijk volume 5 M lithiumchloride. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 10 min.
  7. Centrifugeer het RNA neerslag bij 14.636 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng het supernatant naar een nieuwe buis 250 ml precipiteren DNA door toevoeging van 2 volumes 100% isopropanol.Incubeer het mengsel op ijs gedurende 20 min.
  8. Spin down het DNA neerslag bij 18.566 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Zuig het supernatant, resuspendeer de DNA pellet in 9,5 ml TE-buffer (pH 7,6) en voeg 10 g cesiumchloride (CsCl) en 390 gl 10 mg / ml EtBr.
  9. Laad de DNA-CsCl-EtBr oplossing in een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis met behulp van een injectiespuit voorzien van een 18 G naald. Draai de afgedichte CsCl gradiënt in een ultracentrifuge bij 401.700 x g gedurende 16 uur bij 20 ° C (figuur 3).
  10. Verzamel een DNA-band van BAC plasmide uit de CsCl-gradiënt onder toepassing van een 18 G naald een ontluchter bovenaan de gradiënt en een 20 G-naald uitgeruste spuit het BAC DNA van de zijkant van het verloop ophalen creëren.
  11. Voeg 2,5 volumes van dH 2 O-verzadigde butanol aan de EtBr-gekleurde BAC DNA-monster en meng door vortexen. Centrifugeer het mengsel bij 13.400 x g gedurende 1 min en breng de onderste waterige fase naar een nieuwe 1,7 ml microtube. Herhaal deze procedure zes keer.
  12. Precipiteren de EtBr-vrije BAC DNA door het toevoegen van 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol om de butanol geëxtraheerd BAC DNA en incubatie gedurende 10 min op ijs. Centrifugeer het neerslag bij 13.400 xg gedurende 10 min, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en opnieuw pellet door centrifugeren.
  13. Lucht-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 200 ui TE-buffer (pH 7,6).
    Opmerking: Figuur 4 toont een overzicht van het reverse genetics systeem voor JEV SA 14 -14-2.

6. Transcribeer synthetische RNA's in vitro van een gelineariseerde Full-length JEV BAC DNA

  1. Voer een grootschalige restrictie-enzymdigestie van pBAC / SA 14 -14-2 met XbaI in een totaal volume van 100 pl (met 3 ug DNA, 60 eenheden enzym, 1 × digestiebuffer en 1 x BSA) bij 37 ° C gedurende 12-15 uur. Onderzoek een 3 pl aliquot van het digestion reactie op een 0,8% agarosegel bevattende 0,5 ug / ml EtBr.
  2. Incubeer de ontsluitingsreactie verder met 25 U van mungboonnuclease (MBN) bij 30 ° C gedurende 2 uur (Figuur 4A).
  3. Breng het volume van de XbaI gedigereerde, MBN-behandelde monster tot 300 gl met dH 2 O. Voeg een gelijk volume fenol: chloroform: isoamylalcohol (25: 24: 1) aan het verdunde monster vortex krachtig gedurende 1 min centrifugeren op 13400 x g gedurende 10 min, en vervolgens over de bovenste waterige fase naar een nieuwe 1,7 ml microbuisjes. Voeg een gelijk volume van chloroform en herhaal de extractie procedure.
  4. Herstel het fenol / chloroform geëxtraheerd, gelineariseerd BAC door ethanolprecipitatie Voeg 1/10 volume 3 M natriumacetaat en 2,5 volumes 100% ethanol en incubeer op ijs gedurende 20 min. Centrifugeer het neerslag bij 13.400 xg gedurende 10 min, was de DNA pellet met 1 ml 70% ethanol en vervolgens draai het door centrifugeren.
  5. Air-droog de DNA pellet gedurende 10 min en oplossen in 30 ul van dH 2 O. Onderzoek een 1 pi aliquot van het teruggewonnen BAC op een 0,8% agarosegel met 0,5 ug / ml EtBr (Figuur 5A).
  6. Voer een run-off transcriptie van het gelineariseerde BAC DNA in een totaal volume van 25 ui (met ~ 200 ng template-DNA, 0,8 mm dop analoge [m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 mM rNTPs, 40 U RNase-remmer, 20 U SP6 RNA polymerase, en 1 x 72 transcriptie buffer) bij 37 ° C gedurende 1 uur (figuur 4B). Omvat 0,5 pM [3 H] UTP voor RNA kwantificering op basis van [3 H] UTP incorporatie, zoals gemeten door adsorptie aan DE-81 filtreerpapier. 69
  7. Voer een 1-2 pi hoeveelheid van de run-off transcriptie reactie op een 0,6% agarosegel met 0,5 ug / ml EtBr (Figuur 5B).

7. Bepaal RNA Infectiviteit en Virus Yield

  1. Cultiveren BHK-21 cellen in 150 mm Culture gerechten in een dichtheid van 3 x 10 6 cellen / schaal van 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
    Opmerking: Handhaaf de BHK-21 cellen in alfa minimaal essentieel medium, aangevuld met 10% foetaal runderserum, 2 mM glutamine, vitaminen, en penicilline / streptomycine.
  2. Spoel de cel monolaag met 10 ml koude oplossing A (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 8,1 mM Na 2 HPO 4 en 1,5 mM KH 2PO 4). Maak de cellen van de gerechten door behandeling met 4 ml trypsine-EDTA (0,25%) en ze verzamelen door centrifugeren bij 270 x g in een desktop centrifuge gedurende 2 min.
  3. Resuspendeer de celpellet met 50 ml koude oplossing A in een 50 ml conische buis en centrifugeer de celsuspensie bij 270 x g gedurende 2 min. Herhaal deze procedure wassen drie keer; na de laatste wasbeurt, resuspendeer de celpellet bij een dichtheid van 2 x 10 7 cellen / ml in Sol A.
  4. Meng 400 ul aliquot van celsuspensie met 2 μg synthetische RNA in een 2-mm gap cuvette en onmiddellijk electroporate het mengsel met een elektroporator onder optimale elektroporatie omstandigheden: 980 V, 99 psec pulslengte en 5 pulsen (figuur 4C).
    Opmerking: Gebruik de 3-H gelabelde RNA gesynthetiseerd in Protocol 6.5 rechtstreeks voor elektroporatie zonder verdere zuivering.
  5. Verlaat de geëlektroporeerde cellen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en overbrengen naar een 1,7 ml microbuisjes met 600 ul compleet cultuurmedium.
  6. Bereid een 10-voudige seriële verdunning van de geëlektroporeerde cellen in 1 ml compleet cultuurmedium en een plaat 100 pi aliquot van elke verdunning op monolagen van BHK unelectroporated-21-cellen (5 x 10 5) in een 6-wells plaat.
  7. Na 4-6 uur incubatie, bedekken de cellen met 0,5% agarose in minimaal essentieel medium met 10% foetaal runderserum. Incubeer de platen gedurende 4 dagen bij 37 ° C met 5% CO2.
  8. Visualiseer de besmettelijke centrums (plaques) van fixatie met 7% formaldehyde en kleuring met 1% kristalviolet in 5% ethanol 27 (figuur 6A).
    1. Optioneel: Onderzoek-RNA geëlektroporeerd cellen bij 18-20 uur na transfectie voor JEV eiwit expressie door immunofluorescentie assays 27,73 (figuur 6B), en de oogst van de supernatanten van de RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 uur na transfectie voor virus titratie door plaque assays 27,63 (figuur 6C).

Representative Results

Voor alle positieve streng RNA-virussen, de betrouwbaarheid en efficiëntie van reverse genetics systeem afhankelijk van de genetische stabiliteit van een gekloneerde cDNA van volledige lengte, waarvan de sequentie overeenkomt met de consensus sequentie van viraal genoom RNA. 27 Figuur 1 toont een vijf- stap strategie voor de constructie van een full-length infectieus cDNA als een BAC voor JEV SA 14 -14-2 28: Stap 1, zuivering van viraal RNA uit de celkweek supernatant van JEV geïnfecteerde BHK-21-cellen (Figuur 1A); Stap 2 synthese van vier overlappende cDNA-amplicons (F1 tot F4) verspreid over de hele virale genoom (Figuur 1B); Stap 3, subkloneren van elk van de vier aangrenzende cDNA fragmenten in een BAC vector creëren pBAC / F1 tot pBAC / F4 (figuur 1C); Stap 4, wijziging van de gekloneerde cDNA's in vitro run-off transcriptie met SP6 RNA polymerase, dat wil zeggen, het plaatsen van een SP6promoter sequentie direct stroomopwaarts van de virale 5'-uiteinde (pBAC / F1 SP6), waardoor een bestaand inwendige XbaI bij nucleotide 9131 door invoeging van een stille puntmutatie, A 9134 → T (pBAC / F3 KO), en invoegen een nieuwe kunstmatige XbaI- run-off site onmiddellijk stroomafwaarts van het virale 3'-end (pBAC / F4 RO) (figuur 1D); en stap 5, samenstel van een full-length SA 14 -14-2 cDNA BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (figuur 1E) tabel. 1 worden de oligonucleotiden in deze kloneringswerkwijze. 28

Voor de constructie van een functionele JEV cDNA, de eerste belangrijke stap is de synthese van de vier overlappende cDNA-fragmenten met gezuiverde virale RNA als een matrijs voor RT-PCR. Figuur 2 geeft een representatief resultaat voor de vier RT-PCR producten die werden geëlektroforeerd op een 0,8%agarosegel. Deze gel blijkt duidelijk dat een full-length JEV cDNA wordt geamplificeerd in vier overlappende cDNA-fragmenten. Soms kan RT-PCR reacties op één of meer additionele virus-specifieke of niet-specifieke producten die meestal kleiner is dan het verwachte product, vanwege de niet-specifieke hybridisatie van de primers tijdens cDNA-synthese / amplificatie. Anderzijds, weinig of geen verwachte RT-PCR produkt zou worden versterkt door RNase toevallige besmetting tijdens het virale RNA isolatie of onjuist RT-PCR prestaties.

De volgende belangrijke stap is het kloneren en aanpassen van een partiële of volledige lengte JEV cDNA in BAC, wat een relatief eenvoudige procedure die standaard recombinant DNA technieken gebruikt. 69 Figuur 3 toont een representatief resultaat voor de zuivering van de BAC kloon die een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2 door strepen in een CsCl-EtBr verloop.In dit experiment werd na centrifugatie gedurende 16 uur bij 401.700 x g, twee verschillende banden, dat wil zeggen, de E. coli chromosomaal DNA boven en sterk gedraaide BAC plasmide-DNA hieronder, zijn zichtbaar in het midden van de buis onder langgolvig ultraviolet licht. Een minimale volume (~ 400 ul) van de onderste BAC DNA-band werd zorgvuldig verzameld door prikken van een gat met een spuit op de zijkant van de buis. Vervolgens de EtBr werd uit de BAC DNA door butanolextractie en de EtBr vrije BAC DNA werd geconcentreerd door ethanolprecipitatie.

De laatste stap is het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA's in vitro getranscribeerd vanaf de full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2) na RNA-transfectie in gevoelige cellen (Figuur 4). Deze stap omvat drie opeenvolgende stappen: Stap 1, linearisatie van de full-length SA 14 -14-2 cDNA aan het 3'-einde van het virale genoom (Figuur 4A); Stap 2, de productie van synthetische RNA's van de gelineariseerde cDNA door de run-off transcriptie (Figuur 4B); en stap 3, redding van de recombinante virussen in BHK-21-cellen getransfecteerd met de synthetische RNA's (figuur 4C). Experimenteel twee onafhankelijke klonen van pBAC / SA 14 -14-2 werden gelineariseerd met XbaI digestie en behandeld met MBN de vier basen 5 'overhang die door het XbaI-digestie verwijderd. De gelineariseerde BACs werden gereinigd door fenol-chloroform extractie gevolgd door ethanol precipitatie. De linearisatie van de twee gezuiverde BACs werd gedemonstreerd op een 0,8% agarosegel (Figuur 5A). De fenol-chloroform extractie moet zorgvuldig gebeuren zodat het gelineariseerde BACs zijn RNase-free. Beide gelineariseerde BACs diende als een template voor cDNA run-off transcriptie met behulp SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 ') ppp (5) Dop analoog. De integriteit van de synthetische RNA's werd aangetoond door het uitvoeren van aliquots van de twee transcriptie-reactiemengsels op een 0,6% agarose gel, samen met een referentie 1 kb DNA ladder (Figuur 5B). In deze eenvoudige bepaling, de belangrijkste prominente RNA band altijd slechts migreerde onder de 3 kb DNA-band en leek scherp te zijn. Echter, gedegradeerd RNA zou uitgesmeerd verschijning op dezelfde gel hebben.

Een infectieuze center assay is de gouden standaard voor het bepalen van de specifieke infectiviteit van de synthetische RNA's. Deze test werd uitgevoerd door electroporating BHK-21 cellen met RNA-monsters, zaaien gelijke hoeveelheden van de 10-voudig serieel verdund geëlektroporeerde cellen in 6-well platen met naïeve BHK-21 cellen (3 x 10 5 cellen / putje), en bedekken agarose op de cel monolagen. Na incubatie gedurende 4 dagen werden de overlevende cellen gefixeerd met formaldehyde en gekleurd met kristalviolet sPLOSSING het aantal infectieuze centra (plaques), dat overeenkomt met het aantal infectieuze RNA-moleculen afgegeven in de cellen (Figuur 6A) te kwantificeren. Aangezien de cDNA template voor in vitro transcriptie bewezen niet besmettelijk, werd 27 een hoeveelheid van de transcriptie reactiemengsel direct gebruikt voor elektroporatie. Elektroporatie is de voorkeurswerkwijze voor transfectie van RNA; Als alternatief kan RNA worden getransfecteerd met behulp van andere werkwijzen DEAE-dextran en kationische liposomen. RNA elektroporatie is zeer effectief, maar "vonkontlading" van de elektrische puls treedt zelden of zouten aanwezig in de elektroporatie reactie of de elektroporatie cuvette wordt hergebruikt zijn. De expressie van virale eiwitten in RNA-getransfecteerde cellen werd onderzocht door immunofluorescentie assays gebruik van een anti-NS1 konijnen antiserum (figuur 6B). De productie van virale deeltjes verzameld in de supernatanten van RNA-getransfecteerde cellen wasalyzed door plaque assays (figuur 6C). De resultaten van deze experimenten tonen duidelijk aan dat de cDNA-afgeleide synthetische RNA infectieus permissief BHK-21-cellen, het genereren van een hoge titer van recombinant virus.

Oligonucleotide Sequentie een (5 'tot 3') Stand b Polariteit
1RT TAGGGATCTGGGCGTTTCTG
GCAAAT 		2578-2603 Antisense
1F aatcccgggAGAAGTTTATC
TGTGTGAACTT 		22/01 Zin
1R attgcggccgcCCACGTCGT
TGTGCACGAAGAT 		2532-2553 Antisense
2RT TTCTGCCTACTCTGCCCCTC
CGTTGA 		5975-6000 Mierik voel
2F aatcccgggTCAAGCTCAGT
GATGTTAACAT 		1800-1821 Zin
2R attgcggccgcGATGGGTTT
CCGAGGATGACTC 		5929-5950 Antisense
3RT ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC
AGGTCT 		9426-9451 Antisense
3F aatcccgggGAGGATACATT
GCTACCAAGGT 		5500-5521 Zin
3R attgcggccgcGTAAGTCAG
TTCAATTATGGCT 		9380-9401 Antisense
4RT AGATCCTGTGTTCTTCCTCA
CCACCA 		10.952-10.977 Antisense
4F aatcccgggAGTGGAAGGCT
CAGGCGTCCAA 		9200-9221 Zin
4R attgcggccgcAGATCCTGT
GTTCTTCCTCACC 		10.956-10.977 Antisense
SP6F cataccccgcgtattcccac
ta 		Zin
SP6R ACAGATAAACTTCTctatag
tgtcccctaaa 		14/01 Antisense
F1F aggggacactatagAGAAGT
TTATCTGTGTG 		17/01 Zin
F1R TGGATCATTGCCCATGGTAA
GCTTA 		638-662 Antisense
X1F CGAATGGATCGCACAGTGTG
GAGAG 		8403-8427 Zin
X1R AAAGCTTCAAACTCAAGATA
CCGTGCTCC 		9120-9148 Antisense
X2F GGAGCACGGTATCTTGAGTT
TGAAGCTTT 		9120-9148 Zin
X2R cacgtggacgagggcatgcc
tgcag 		Antisense
ROF CCAGGAGGACTGGGTTACCA
AAGCC 		10.670-10.694 Zin
ROR agggcggccgctctagAGAT
CCTGTGTTCTTCCTCACCAC 		10.954-10.977 Antisense
een JEV sequenties worden weergegeven in hoofdletters, en BAC sequenties zijn aangegeven in kleine letters.
b Nucleotide positie verwijst naar de volledige genoomsequentie van JEV SA 14 -14-2 (Genbank nummer JN604986).

Tabel 1: Oligonucleotiden gebruikt voor cDNA-synthese, PCR-amplificatie en mutagenese BAC.

Figuur 1
Figuur 1.0, Strategie voor de constructie van een full-length cDNA van JEV SA 14 -14-2 als BAC (A) Isolatie van viraal RNA van JEV deeltjes.. Getoond is een schematisch diagram van het genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. (B) Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) voor de gehele virale genoom. (C) Subklonering van vier overlappende cDNA-fragmenten in een BAC vector, het creëren van pBAC / F1 aan pBAC / F4. (D) Wijziging van de gekloonde cDNA's voor run-off transcriptie in vitro. pBAC / F1 SP6 is een derivaat van pBAC / F1 de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de virale 5'-uiteinde bevat. pBAC / F3 KO is een derivaat van pBAC / F3 die een stille puntmutatie (A 9134 → T, asterisk) bevat. pBAC / F4 RO is een derivaat van pBAC / F4 dat een kunstmatige XbaI afvloeiing stroomafwaarts van het virale 3'-uiteinde bevat. (E strong>) Vergadering van een full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Synthese van vier overlappende cDNA-fragmenten (F1 tot F4) verspreid over de volledige lengte genomische RNA van JEV SA 14 -14-2. De vier RT-PCR producten worden geëvalueerd door elektroforese in een 0,8% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. De verwachte grootte van de vier cDNA-fragmenten worden aangegeven aan de onderkant van het beeld van de gel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

/ftp_upload/53164/53164fig3.jpg "/>
Figuur 3. Zuivering van de BAC met een volledige lengte cDNA van JEV SA 14 -14-2. Is de BAC plasmide geïsoleerd uit E. coli DH10B door de SDS-alkalische lysismethode en verder gezuiverd door middel van strepen in een CsCl-EtBr verloop. Gepresenteerd is een voorbeeld van de CsCl-EtBr gradiënt met behulp van een 16 × 76 mm afsluitbare polypropyleen buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Overzicht van de terugwinning van infectieuze virussen uit een full-length JEV SA 14 -14-2 cDNA geassembleerd in een BAC. (A) Linearisatie van de cDNA template. De full-length JEV BAC wordt gesneden metXbaI en behandeld met MBN. (B) Bereiding van de RNA-transcripten. De gelineariseerde cDNA getranscribeerd door SP6 RNA polymerase in aanwezigheid van de m 7 G (5 ') ppp (5') Dop analoog. (C) Herstel van de synthetische JEVs. De in vitro getranscribeerd RNA worden getransfecteerd in BHK-21 cellen door elektroporatie, die een hoge titer van synthetische virus genereert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Synthese van RNA van in vitro transcriptie met behulp van een full-length BAC JEV cDNA als matrijs. (A) Vorming van het gelineariseerde full-length JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Twee onafhankelijke klonen van pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 en Cl.2) worden gelineariseerd door digestie met XbaI en daaropvolgende behandeling met MBN. De gelineariseerde BACs worden onderzocht door elektroforese in een 0,8% agarosegel. (B) De productie van de synthetische RNA's door de run-off transcriptie. Beide gelineariseerde BACs wordt gebruikt als een matrijs voor SP6 RNA-polymerase run-off transcriptie. Porties van de twee transcriptie-reacties worden uitgevoerd op een 0,6% agarosegel. M, 1 kb DNA ladder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Specifieke besmettelijkheid van de synthetische RNA getranscribeerd van een full-length JEV BAC en het herstel van de synthetische virus. BHK-21 cellen zijn mock-geëlektroporeerd (Mock) of geëlektroporeerd met de RNA-transcripten afgeleid frOM elk van de twee onafhankelijke klonen van de volledige lengte JEV BAC (Cl.1 en Cl.2). (A) RNA infectiviteit. De cellen bedekt met agarose en gekleurd met kristalviolet in 4 dagen na transfectie. RNA infectiviteit wordt bepaald door infectieuze midden assays voor de hoeveelheid infectieus RNA geëlektroporeerd in cellen (linker paneel) te schatten. Ook representatieve beelden van besmettelijke centra worden weergegeven (rechter paneel). (B) Eiwitexpressie. De cellen worden gekweekt in 4 putjes objectglaasjes kamer. Virale eiwitexpressie in RNA-geëlektroporeerde cellen op 20 uur na transfectie (HPT) wordt geanalyseerd door immunofluorescentie assays Een primair anti-NS1 konijnen antiserum en een secundair Cy3-geconjugeerd geiten anti-konijnen IgG (rood). De kernen worden tegengekleurd met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (blauw). De immunofluorescentie beelden worden bedekt op de bijbehorende differentiële interferentie contrast beelden. (C) virusopbrengst. De cellen worden gekweekt in 150 mm cultuur gerechten. De productie van infectueuze virionen opgebouwd in de kweeksupernatanten van RNA-geëlektroporeerde cellen op 22 en 40 HPT wordt onderzocht door plaque assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het huidige protocol is met succes gebruikt om full-length infectieuze cDNA-klonen van twee verschillende stammen (CNU / LP2 SA 27 en 14 -14-2 28) van JEV, een flavivirus waarvan de functionele cDNA bleek inherent moeilijk samen te stellen is en genereren propageren vanwege toxiciteit gastheercel en de genetische instabiliteit van gekloneerde cDNA 8,74-76 Dit protocol omvat drie hoofdcomponenten. eerste, het maximaliseren van de synthese / amplificatie van cDNA een getrouwe kopie van het virale RNA met behulp van high-fidelity reverse transcriptase / DNA polymerase; tweede, het kloneren van de virale prM-E coderend gebied dat toxische sequenties (ongepubliceerde gegevens) 74,77,78 in een zeer lage kopieaantal vector BAC uit de oorspronkelijke cDNA subkloneren tot de uiteindelijke volledige lengte cDNA montagestappen; en de derde, gebruik van een kloneringsvector die BAC kan een vreemd DNA met een gemiddelde grootte van 120-350 kb, 19-21 die blijkbaar tolereert grotere DNA inserts dan andere kloneringsvectoren. Deze klonering wordt algemeen toepasbaar op vele andere positieve streng RNA-virussen, met name die met een groot RNA-genoom van ~ 10 tot 32 kb. Genereren van een infectieuze cDNA-kloon is een belangrijke stap in de ontwikkeling van een reverse genetics voor RNA-virussen, met name positieve streng RNA-virussen, omdat het genoom treedt virale mRNA dat vertaald in eiwitten door gastheercel ribosomen. Aldus kan virale replicatie worden gestart door de introductie van een cDNA-afgeleide genoom-lengte RNA molecuul in een vatbare gastheercel. De beschikbaarheid van een infectieus JEV cDNA-kloon, in combinatie met recombinant DNA-technologie, heeft ons begrip van verschillende aspecten van de virale levenscyclus verhoogd op moleculair niveau, zoals genexpressie 73,79 en genoomreplicatie. 63,64 ook een full-length JEV cDNA-kloon blijkt een waardevol instrument voor de ontwikkeling van antivirale vaccins 28 en gentherapie vectoren. <sup> 80,81

Zoals bij alle positieve streng RNA virussen er meerdere kritische stappen bij het ​​construeren van een betrouwbare functionele cDNA voor JEV waaruit zeer besmettelijke RNAs kunnen worden gesynthetiseerd in vitro. Idealiter zou de sequentie van de synthetische RNA getranscribeerd van een kloon van volledige lengte cDNA identiek zijn aan die van het virale genomische RNA, met name de 5'- en 3'-terminale sequenties die nodig zijn voor de initiatie van virale RNA replicatie . 60-62 In het huidige protocol, de authentieke 5'- en 3'-uiteinden werden verzekerd door het plaatsen van de SP6-promotersequentie stroomopwaarts van de eerste adenine nucleotide van het virale genoom en positioneren van een unieke kunstmatige XbaI-restrictieplaats stroomafwaarts van de laatste thymine nucleotide van het virale genoom, respectievelijk. Capped synthetische RNAs met authentieke 5 'en 3' uiteinden werden geproduceerd door run-off transcriptie van een XbaI-gelineariseerd en MBN behandelde cDNA template gebruik SP6 RNA polymerase geprimed met m 7 G (5 ') ppp (5') Dop analoog. Dit protocol kan worden gemodificeerd op verschillende manieren. Voor in vitro transcriptie kan een bacteriofaag RNA-polymerase (bijvoorbeeld T3 of T7) worden gebruikt in combinatie met een goed gedefinieerde promotorsequentie. 27 als run-off site, kan een andere restrictieplaats worden toegepast als het niet presenteren het virale genoom en als synthetische RNA van de gelineariseerde cDNA eindigt met de authentieke 3 'uiteinde. Het belang van het 3'-uiteinde nucleotidesequentie werd aangetoond door een ~ 10-voudige afname in infectiviteit RNA wanneer een synthetisch RNA bevat drie of vier-verbonden-virus nucleotiden aan het 3 'uiteinde. 27 In een in vitro transcriptie reactie, zowel de m 7 G (5 ') ppp (5') A en m 7 G (5 ') ppp (5') G cap analoog kan evengoed gebruikt, hoewel deze plaatsen een ongerelateerde extra G nucleotide stroomopwaarts van het virale 5 '-end, maar datBovendien neemt niet weg infectiviteit of replicatie van synthetisch RNA. 27 Bovendien is het verwijderen van de matrijs cDNA van het RNA transcripten met DNase I digestie is niet noodzakelijk RNA infectiviteit testen, omdat de cDNA sjabloon zelf is niet besmettelijk. 27

De BAC-technologie is nu toegepast op de bouw van infectueuze cDNA-klonen voor een handvol positieve streng RNA-virussen, namelijk twee JEVs, CNU / LP2 27 en SA 14 -14-2 28 (genoomgrootte, ~ 11 kb); twee dengue virussen, BR / 90, 26 en NGC 29 (~ 11 kb); het bovine virale diarree virus, SD1 (~ 12 kb), 25 twee klassieke varkenspest virussen, C en Paderborn (~ 12 kb), 24 de border disease virus, Gifhorn (~ 12 kb), 24 het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 de overdraagbare gastro-enteritis virus, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 de feline infectieuze peritonitis virus,DF-2 (~ 29 kb); 32 het Severe Acute Respiratory Syndrome coronavirus, Urbani (~ 30 kb); 9 het Midden-Oosten respiratoir syndroom coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), 17 en het menselijk coronavirus, OC43 (~ 31 kb) 31 Het belangrijkste voordeel van het gebruik van BAC's voor cDNA constructie is het hoge genetische stabiliteit van de grote, 1- of 2-kopie plasmiden BAC.; De intrinsieke aard van zijn extreem lage aantal kopieën is ook een groot nadeel, omdat zeer lage opbrengsten van BAC DNA en de daaruit voortvloeiende verlaging van de zuiverheid van het BAC DNA opzichte van chromosomaal DNA gastheer. In het huidige protocol is de opbrengst van BAC DNA gemaximaliseerd door groeiende E. coli DH10B getransformeerd met de besmettelijke BAC pBAC / SA 14 -14-2 in een voedselrijke medium, 2xYT. Dit neemt de gemiddelde opbrengst slechts ~ 15 pg BAC DNA van 500 ml 2xYT bouillon. Tevens is de zuiverheid van het BAC DNA best bereikt door CsCl-dichtheidsgradiënt centrifugatie EtBr voor zuiveringIn plaats van de gebruikelijke kolommen gebaseerde plasmide-isolatie. Het is echter belangrijk om in gedachten te houden dat de BAC-getransformeerde E. coli mag niet overwoekeren, omdat het de genetische stabiliteit van het gekloonde cDNA in gevaar kan brengen, en een hogere groei leidt niet noodzakelijk tot een grotere opbrengst of hogere zuiverheid BAC DNA.

De hier beschreven protocol is een geoptimaliseerde, efficiënte en gestroomlijnde werkwijze voor de constructie en vermeerdering van een genetisch stabiele full-length infectueuze cDNA-kloon als een BAC voor JEV, een procedure ooit gedacht praktisch onmogelijk. Dezelfde klonen strategie kan ook worden toegepast op vele andere positieve streng RNA virussen. In het algemeen infectieuze cDNA-klonen kunnen wij verschillende mutaties (bijvoorbeeld deleties, inserties en puntmutaties) introduceren in een viraal RNA-genoom van hun biologische functies te bestuderen virale replicatie en pathogenese. Deze cDNA-gebaseerde reverse genetics systeem maakt het mogelijk om de ontwikkeling en test vaccins en therapeutische kandidaten richten een virulentiefactor (en) van een bepaalde positieve streng RNA-virus van belang. Bovendien kan deze infectieuze cDNA techniek ook worden gebruikt als een virale vector, in staat is tot expressie van een vreemd gen (en) van belang voor vele toepassingen in biomedisch onderzoek.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Molecular Cloning
2xYT Broth Sigma-Aldrich Y2377
[3H]UTP PerkinElmer NET380250UC Radioactive
50 ml Tube Thermo Scientific (Nalgene) 3114-0050
250 ml Bottle Beckman Coulter 356011
Agarose Lonza 50004
Agarose (Low Melting Point) Life Technologies (Invitrogen) 16520-100
AvaI New England BioLabs R0152S
AvrII New England BioLabs R0174S
BamHI New England BioLabs R0136S
BsiWI New England BioLabs R0553S
BsrGI New England BioLabs R0575S
Butanol Fisher Scientific A399-1 
Cesium Chloride Fisher Scientific BP1595-1
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Chloroform Sigma-Aldrich C2432 Carcinogenic
DE-81 Filter Paper GE Healthcare Life Sciences 3658-023
dNTP mix Life Technologies (Invitrogen) 18427-088
E. coli DH10B  Life Technologies (Invitrogen) 18297-010
EDTA Sigma-Aldrich E5134
Ethanol  Sigma-Aldrich E7023
Ethidium Bromide Sigma-Aldrich E7637 Toxic and highly mutagenic
Filter Column (Plasmid Maxiprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-26
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283 Irritating
Glucose Sigma-Aldrich G5400
Glycogen  Roche 10901393001
High-fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0491S
Isoamyl Alcohol Sigma-Aldrich I9392 Flammable
Isopropanol  Amresco 0918 Flammable
LB Broth Life Technologies (Invitrogen) 12795-027
Lithium Chloride Sigma-Aldrich L9650
Lysozyme Amresco 0663
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M8266
M-MLV Reverse Transcriptase Life Technologies (Invitrogen) 18080-044
Mung Bean Nuclease New England BioLabs M0250S
Needle (18G, 20G) BD 305196, 305175 Biohazardous (Sharps waste)
NotI New England BioLabs R0189S
Oligonucleotide Integrated DNA Technologies Custom Oligonucleotide Synthesis
PacI New England BioLabs R0547S
pBeloBAC11 New England BioLabs ER2420S (E4154S)
Phenol (Buffer-Saturated) Life Technologies (Invitrogen) 15513-039 Toxic and highly corrosive
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol Life Technologies (Invitrogen) 15593-031 Toxic and highly corrosive
Phenol:Guanidine Isothiocyanate Life Technologies (Ambion) 10296-010 Toxic, corrosive, and irritating
Pme I New England BioLabs R0560S
Potassium Acetate Amresco 0698
RNase Inhibitor Life Technologies (Invitrogen) 10777-019
rNTP Set GE Healthcare Life Sciences 27-2025-01
Sealable Polypropylene Tube (16 × 76 mm)  Beckman Coulter 342413
SfiI New England BioLabs R0123S
Sma I New England BioLabs R0141S
Sodium Acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium Dodecyl Sulfate Amresco 0227
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
SP6 RNA Polymerase New England BioLabs M0207S
Spin Column (Plasmid Miniprep Kit) Life Technologies (Invitrogen) K2100-11
Syringe HSW NORM-JECT 4200.000V0
T4 DNA Ligase New England BioLabs M0202S
Tris Amresco 0826
tRNA (yeast) Life Technologies (Invitrogen) 15401-011
XbaI  New England BioLabs R0145S
Name Company Catalog Number Comments
2. Cell Culture
Alpha Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 12561-049
Conical Tube (50 mL) VWR 21008-242
Crystal Violet  Sigma-Aldrich C0775
Culture Dish (150 mm)  TPP 93150 
Cuvette (2-mm Gap) Harvard Apparatus 450125 
Fetal Bovine Serum  Life Technologies (Gibco) 16000-044
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Toxic and carcinogenic
Glutamine Life Technologies (Gibco) 25030-081
Minimal Essential Medium Life Technologies (Gibco) 61100-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies (Gibco) 15070-063
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791
Six-Well Plate TPP 92006
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich S3264
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies (Gibco) 25200-056
Vitamins Sigma-Aldrich M6895
Name Company Catalog Number Comments
3. Equipment
Agarose Gel Electrophoresis System Mupid MPDEXU-01
CO2 Incubator Thermo Scientific Heracell 150i
Desktop Centrifuge  Thermo Scientific ST16R
Electroporator Harvard Apparatus ECM 830
Longwave Ultraviolet Lamps (Handheld) UVP UVGL-58
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 368826
Thermocycler Life Technologies (Applied Biosystems) GeneAmp PCR System 9700
Vortexer Scientific Industries G-560
Water Bath Jeio Tech WB-10E

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bridgen, A. Reverse genetics of RNA viruses: applications and perspectives. , Wiley-Blackwell. West Sussex, UK. (2013).
  2. Taniguchi, T., Palmieri, M., Weissmann, C. QB DNA-containing hybrid plasmids giving rise to QB phage formation in the bacterial host. Nature. 274 (5668), 223-228 (1978).
  3. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  4. Stobart, C. C., Moore, M. L. RNA virus reverse genetics and vaccine design. Viruses. 6 (7), 2531-2550 (2014).
  5. Boyer, J. C., Haenni, A. L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology. 198 (2), 415-426 (1994).
  6. Ahlquist, P., French, R., Janda, M., Loesch-Fries, L. S. Multicomponent RNA plant virus infection derived from cloned viral cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (22), 7066-7070 (1984).
  7. Ahlquist, P., Janda, M. cDNA cloning and in vitro transcription of the complete brome mosaic virus genome. Mol Cell Biol. 4 (12), 2876-2882 (1984).
  8. Ruggli, N., Rice, C. M. Functional cDNA clones of the Flaviviridae: strategies and applications. Adv Virus Res. 53, 183-207 (1999).
  9. Almazan, F., et al. Construction of a severe acute respiratory syndrome coronavirus infectious cDNA clone and a replicon to study coronavirus RNA synthesis. J Virol. 80 (21), 10900-10906 (2006).
  10. Yount, B., Denison, M. R., Weiss, S. R., Baric, R. S. Systematic assembly of a full-length infectious cDNA of mouse hepatitis virus strain A59. J Virol. 76 (21), 11065-11078 (2002).
  11. Yount, B., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of severe acute respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12995-13000 (2003).
  12. Masters, P. S., Rottier, P. J. Coronavirus reverse genetics by targeted RNA recombination. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 133-159 (2005).
  13. Thiel, V., Siddell, S. G. Reverse genetics of coronaviruses using vaccinia virus vectors. Curr Top Microbiol Immunol. 287, 199-227 (2005).
  14. Donaldson, E. F., et al. Systematic assembly of a full-length infectious clone of human coronavirus NL63. J Virol. 82 (23), 11948-11957 (2008).
  15. Scobey, T., et al. Reverse genetics with a full-length infectious cDNA of the Middle East respiratory syndrome coronavirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16157-16162 (2013).
  16. Almazan, F., et al. Engineering the largest RNA virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5516-5521 (2000).
  17. Almazan, F., et al. Engineering a replication-competent, propagation-defective Middle East respiratory syndrome coronavirus as a vaccine candidate. MBio. 4 (5), e00650-e00613 (2013).
  18. Lai, M. M. The making of infectious viral RNA: No size limit in sight. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5025-5027 (2000).
  19. O'Connor, M., Peifer, M., Bender, W. Construction of large DNA segments in Escherichia coli. Science. 244 (4910), 1307-1312 (1989).
  20. Shizuya, H., et al. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).
  21. Stone, N. E., et al. Construction of a 750-kb bacterial clone contig and restriction map in the region of human chromosome 21 containing the progressive myoclonus epilepsy gene. Genome Res. 6 (3), 218-225 (1996).
  22. Monaco, A. P., Larin, Z. YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as research tools. Trends Biotechnol. 12 (7), 280-286 (1994).
  23. Preston, A. Choosing a cloning vector. Methods Mol Biol. 235, 19-26 (2003).
  24. Rasmussen, T. B., et al. Generation of recombinant pestiviruses using a full-genome amplification strategy. Vet Microbiol. 142 (1-2), 13-17 (2010).
  25. Fan, Z. C., Bird, R. C. An improved reverse genetics system for generation of bovine viral diarrhea virus as a BAC cDNA. J Virol Methods. 149 (2), 309-315 (2008).
  26. Suzuki, R., de Borba, L., Duarte dos Santos, C. N., Mason, P. W. Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of dengue virus type 1: characterization of a temperature-sensitive mutation in NS1. Virology. 362 (2), 374-383 (2007).
  27. Yun, S. I., Kim, S. Y., Rice, C. M., Lee, Y. M. Development and application of a reverse genetics system for Japanese encephalitis virus. J Virol. 77 (11), 6450-6465 (2003).
  28. Yun, S. I., et al. A molecularly cloned, live-attenuated Japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij hairpin of the viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS Pathog. 10 (7), e1004290 (2014).
  29. Usme-Ciro, J. A., Lopera, J. A., Enjuanes, L., Almazan, F., Gallego-Gomez, J. C. Development of a novel DNA-launched dengue virus type 2 infectious clone assembled in a bacterial artificial chromosome. Virus Res. 180, 12-22 (2014).
  30. Choi, Y. J., Yun, S. I., Kang, S. Y., Lee, Y. M. Identification of 5' and 3' cis-acting elements of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus: acquisition of novel 5' AU-rich sequences restored replication of a 5'-proximal 7-nucleotide deletion mutant. J Virol. 80 (2), 723-736 (2006).
  31. St-Jean, J. R., et al. Recovery of a neurovirulent human coronavirus OC43 from an infectious cDNA clone. J Virol. 80 (7), 3670-3674 (2006).
  32. Balint, A., et al. Molecular characterization of feline infectious peritonitis virus strain DF-2 and studies of the role of ORF3abc in viral cell tropism. J Virol. 86 (11), 6258-6267 (2012).
  33. Thiel, H. J., et al. Family Flaviviridae. Virus taxonomy: eighth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., Mayo, M. A., Maniloff, J., Desselberger, U., Ball, L. A. , Elsevier Academic Press. San Diego, CA. 981-998 (2005).
  34. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis virus: molecular biology and vaccine development. Molecular biology of the flavivirus. Kalitzky, M., Borowski, P. , Horizon Scientific Press. Norwich, UK. 225-271 (2006).
  35. Gubler, D. J., Kuno, G., Markoff, L., et al. Flaviviruses. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1153-1252 (2007).
  36. Solomon, T. Control of Japanese encephalitis-within our grasp? N Engl J Med. 355 (9), 869-871 (2006).
  37. Halstead, S. B., Jacobson, J. Japanese encephalitis. Adv Virus Res. 61, 103-138 (2003).
  38. Endy, T. P., Nisalak, A. Japanese encephalitis virus: ecology and epidemiology. Curr Top Microbiol Immunol. 267, 11-48 (2002).
  39. Campbell, G. L., et al. Estimated global incidence of Japanese encephalitis: a systematic review. Bull World Health Organ. 89 (10), 766-774 (2011).
  40. Tsai, T. F. New initiatives for the control of Japanese encephalitis by vaccination: minutes of a WHO/CVI meeting, Bangkok, Thailand, 13-15 October 1998. Vaccine. 18, Suppl 2. 1-25 (2000).
  41. Sumiyoshi, H., et al. Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA. Virology. 161 (2), 497-510 (1987).
  42. Yun, S. I., et al. Molecular characterization of the full-length genome of the Japanese encephalitis viral strain K87P39. Virus Res. 96 (1-2), 129-140 (2003).
  43. Yun, S. I., Lee, Y. M. Japanese encephalitis: the virus and vaccines. Hum Vaccin Immunother. 10 (2), 263-279 (2014).
  44. Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. Flaviviridae: the viruses and their replication. Fields virology. Knipe, D. M., et al. , 5th edn, Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Philadelphia, PA. 1101-1152 (2007).
  45. Firth, A. E., Atkins, J. F. A conserved predicted pseudoknot in the NS2A-encoding sequence of West Nile and Japanese encephalitis flaviviruses suggests NS1' may derive from ribosomal frameshifting. Virol J. 6, 14 (2009).
  46. Melian, E. B., et al. NS1' of flaviviruses in the Japanese encephalitis virus serogroup is a product of ribosomal frameshifting and plays a role in viral neuroinvasiveness. J Virol. 84 (3), 1641-1647 (2010).
  47. Mukhopadhyay, S., Kim, B. S., Chipman, P. R., Rossmann, M. G., Kuhn, R. J. Structure of West Nile virus. Science. 302 (5643), 248 (2003).
  48. Kuhn, R. J., et al. Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion. Cell. 108 (5), 717-725 (2002).
  49. Gillespie, L. K., Hoenen, A., Morgan, G., Mackenzie, J. M. The endoplasmic reticulum provides the membrane platform for biogenesis of the flavivirus replication complex. J Virol. 84 (20), 10438-10447 (2010).
  50. Brinton, M. A. Replication cycle and molecular biology of the West Nile virus. Viruses. 6 (1), 13-53 (2014).
  51. Welsch, S., et al. Composition and three-dimensional architecture of the dengue virus replication and assembly sites. Cell Host Microbe. 5 (4), 365-375 (2009).
  52. Pijlman, G. P., Kondratieva, N., Khromykh, A. A. Translation of the flavivirus Kunjin NS3 gene in cis but not its RNA sequence or secondary structure is essential for efficient RNA packaging. J Virol. 80 (22), 11255-11264 (2006).
  53. Kummerer, B. M., Rice, C. M. Mutations in the yellow fever virus nonstructural protein NS2A selectively block production of infectious particles. J Virol. 76 (10), 4773-4784 (2002).
  54. Leung, J. Y., et al. Role of nonstructural protein NS2A in flavivirus assembly. J Virol. 82 (10), 4731-4741 (2008).
  55. Patkar, C. G., Kuhn, R. J. Yellow fever virus NS3 plays an essential role in virus assembly independent of its known enzymatic functions. J Virol. 82 (7), 3342-3352 (2008).
  56. Liu, W. J., Chen, H. B., Khromykh, A. A. Molecular and functional analyses of Kunjin virus infectious cDNA clones demonstrate the essential roles for NS2A in virus assembly and for a nonconservative residue in NS3 in RNA replication. J Virol. 77 (14), 7804-7813 (2003).
  57. Robertson, S. J., Mitzel, D. N., Taylor, R. T., Best, S. M., Bloom, M. E. Tick-borne flaviviruses: dissecting host immune responses and virus countermeasures. Immunol Res. 43 (1-3), 172-186 (2009).
  58. Morrison, J., Aguirre, S., Fernandez-Sesma, A. Innate immunity evasion by dengue virus. Viruses. 4 (3), 397-413 (2012).
  59. Diamond, M. S. Mechanisms of evasion of the type I interferon antiviral response by flaviviruses. J Interferon Cytokine Res. 29 (9), 521-530 (2009).
  60. Gebhard, L. G., Filomatori, C. V., Gamarnik, A. V. Functional RNA elements in the dengue virus genome. Viruses. 3 (9), 1739-1756 (2011).
  61. Markoff, L. 5'- and 3'-noncoding regions in flavivirus RNA. Adv Virus Res. 59, 177-228 (2003).
  62. Paranjape, S. M., Harris, E. Control of dengue virus translation and replication. Curr Top Microbiol Immunol. 338, 15-34 (2010).
  63. Yun, S. I., Choi, Y. J., Song, B. H., Lee, Y. M. 3' cis-acting elements that contribute to the competence and efficiency of Japanese encephalitis virus genome replication: functional importance of sequence duplications, deletions, and substitutions. J Virol. 83 (16), 7909-7930 (2009).
  64. Song, B. H., et al. A complex RNA motif defined by three discontinuous 5-nucleotide-long strands is essential for Flavivirus RNA replication. RNA. 14 (9), 1791-1813 (2008).
  65. Song, B. H., Yun, G. N., Kim, J. K., Yun, S. I., Lee, Y. M. Biological and genetic properties of SA14-14-2, a live-attenuated Japanese encephalitis vaccine that is currently available for humans. J Microbiol. 50 (4), 698-706 (2012).
  66. TRIzol LS Reagent [package insert]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/trizol_ls_reagent.pdf. (2010).
  67. SuperScript III Reverse Transcriptase [package insert]. , Invitrogen. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/superscriptIII_man.pdf. (2004).
  68. PCR Using Q5 High-Fidelity DNA Polymerase [package insert]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/protocols/2013/12/13/pcr-using-q5-high-fidelity-dna-polymerase-m0491?device=pdf (2013).
  69. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2001).
  70. PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits [Quick Reference]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_quick_plasmid_qrc.pdf (2011).
  71. PureLink HiPure Plasmid Filter Purification Kits [User Guide]. , Life Technologies. Carlsbad, CA. Available from: https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/purelink_hipure_plasmid_filter_purification_man.pdf (2011).
  72. SP6 RNA Polymerase [product information]. , New England Biolabs. Ipswich, MA. Available from: https://www.neb.com/products/m0207-sp6-rna-polymerase#tabselect0 (2015).
  73. Kim, J. K., et al. Profiling of viral proteins expressed from the genomic RNA of Japanese encephalitis virus using a panel of 15 region-specific polyclonal rabbit antisera: implications for viral gene expression. PLoS One. 10 (4), e0124318 (2015).
  74. Sumiyoshi, H., Hoke, C. H., Trent, D. W. Infectious Japanese encephalitis virus RNA can be synthesized from in vitro-ligated cDNA templates. J Virol. 66 (9), 5425-5431 (1992).
  75. Mishin, V. P., Cominelli, F., Yamshchikov, V. F. A 'minimal' approach in design of flavivirus infectious DNA. Virus Res. 81 (1-2), 113-123 (2001).
  76. Sumiyoshi, H., Tignor, G. H., Shope, R. E. Characterization of a highly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J Infect Dis. 171 (5), 1144-1151 (1995).
  77. Pu, S. Y., et al. Successful propagation of flavivirus infectious cDNAs by a novel method to reduce the cryptic bacterial promoter activity of virus genomes. J Virol. 85 (6), 2927-2941 (2011).
  78. Yamshchikov, V., Mishin, V., Cominelli, F. A new strategy in design of +RNA virus infectious clones enabling their stable propagation in E. coli. Virology. 281 (2), 272-280 (2001).
  79. Kim, J. M., et al. A single N-linked glycosylation site in the Japanese encephalitis virus prM protein is critical for cell type-specific prM protein biogenesis, virus particle release, and pathogenicity in mice. J Virol. 82 (16), 7846-7862 (2008).
  80. Yun, S. I., et al. Engineering the Japanese encephalitis virus RNA genome for the expression of foreign genes of various sizes: implications for packaging capacity and RNA replication efficiency. J Neurovirol. 13 (6), 522-535 (2007).
  81. Yun, S. I., et al. Japanese encephalitis virus-based replicon RNAs/particles as an expression system for HIV-1 Pr55 Gag that is capable of producing virus-like particles. Virus Res. 144 (1-2), 298-305 (2009).

Tags

Immunology reverse genetics infectieuze cDNA bacterieel kunstmatig chromosoom virus RNA enkelstrengs positieve zin infectie replicatie pathogenese flavivirus Japanse encefalitisvirus
Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., … More

Yun, S. I., Song, B. H., Kim, J. K., Lee, Y. M. Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses. J. Vis. Exp. (106), e53164, doi:10.3791/53164 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter