Protocol
Les procédures d'utilisation des animaux décrits ci-dessous ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l'utilisation (IACUC) à l'école de médecine vétérinaire de l'Université de Ross et Florida Atlantic University. Bien que les techniques stériles et des gants sont nécessaires, l'environnement RNase-free est pas nécessaire lors de l'utilisation de ce protocole.
1. Préparation
- Préparation des tissus et de sectionnement
- Attribuer des rats au hasard en trois groupes: les frais / solution saline (SAL; NaCl 0,9%), le préfixe / SAL et préfixés / 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA; voir détails dans le tableau 1).
- Administrer trois doses de 1 ml / kg SAL et 10 mg / kg par voie intrapéritonéale MDMA, respectivement, pour les groupes SAL et MDMA à intervalle de 2 h. Permettre aux animaux de survivre le traitement pendant 6 jours.
- Au jour 7, administrer 100 mg / kg de kétamine en combinaison de 5 mg / kg par voie intrapéritonéale xylazine aux rats pour une anesthésie profonde (ie, la perte de clignotement de la cornée et tail pincer réflexes).
- Pour le groupe frais / SAL, décapiter rapidement rats et enlever le cerveau pour le test de cerveau frais (voir les détails dans la référence 5).
- Pour les groupes / MDMA préfixés / SAL et préfixés, faire une coupe le long du sternum environ 10 -12 cm et ensuite exposer l'extrémité du sternum.
- Maintenez l'extrémité du sternum avec une pince hémostatique et couper la membrane latéralement des deux côtés avec des ciseaux pointus et ensuite coupé vers le haut à travers les côtes et en parallèle vers les poumons.
- Avec une main, tenir la pointe ventrale du cœur avec une petite pince. Avec l'autre main, percer le ventricule gauche avec une aiguille de calibre 18 de la seringue (noter le côté de l'adaptateur de l'aiguille est reliée à un tuyau de silicium en forme de Y Sal et paraformaldéhyde conteneurs glacées et les pompes péristaltiques, voir la référence 9).
- Tournez sur la pompe de SAL au niveau moyen de la vitesse d'écoulement (~ 5 ml / min) et à la perforation de l'oreillette droite avec la pince pour permettre l'évasion de retour circulation. Maintenir SAL perfusion pendant 30 min.
- Tournez sur la pompe de paraformaldéhyde au niveau moyen et laissez la glace-paraformaldéhyde 4% froid pour perfuser l'animal pendant 30 min.
- Retirer l'instrument de perfusion et de décapiter l'animal. Faire un postéro couper à travers la ligne médiane du crâne, puis battre le crâne pour exposer la cavité du crâne 10.
- Retirer le cerveau avec une spatule à partir de la cavité du crâne et du cerveau placer dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de paraformaldehyde à 4%. Gardez le cerveau dans le tube contenant paraformaldéhyde à 4 ºC réfrigérateur pendant 24 h.
- Déplacer le cerveau dans un tube centrifuge de 50 ml contenant 25 ml de solution de saccharose à 30% à 4 ° C pendant 3 jours. Enfin, stocker le cerveau dans les sacs en plastique à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Montez le cerveau sur un mandrin avec intégration des médias et de geler les médias enrobage contenant cerveau dans un cryostat à une température de -26 ºC. Couper le gelé fraisn cerveau cerveau en 20 sections um et le paraformaldéhyde-préfixés en sections de 10 um. Transférer la section à une lame de microscope RT en touchant la diapositive à la section.
- Air sec à température ambiante pendant 4 h. Conserver les diapositives de section dans un sac étanche scellée à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Déshydration
- Prenez diapositives de la -80 ° C congélateur et attribuer des sections dans une des trois tests: HT2A, PPIB (contrôle positif) ou dapB (contrôle négatif); marque et sections de l'étiquette avec un stylo à bille (ne pas utiliser un crayon). Plonger les lames dans 100% d'alcool à la température ambiante pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans une hotte.
- Prétraitement
- Pipette 20 pl du réactif de prétraitement-1 (inactivation de la phosphatase alcaline) aux coupes sur des lames. Placer les lames sur un rail de support d'une plaque à l'humidité (à noter que le plateau est recouvert d'un couvercle afin de maintenir une humidité élevée pour empêcher l'évaporation à partir de la réaction de solution).
- Secouer doucement le plateau de l'humidité sur un agitateur horizontal à basse vitesse pendant 10 min. Laver les lames à deux reprises avec de l'eau distillée deux fois (ddH 2 O) pendant 2 min. Immerger la lame dans un bécher de 200 ml contenant 150 ml du réactif de prétraitement-2 (rupture des liaisons transversales induites par paraformaldéhyde fixation). Faire bouillir les diapositives pour un total de 5 min à 100 ° C (de restauration induite par la chaleur de la structure de l'ARN 11).
- Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min. Placer les lames dans alcool à 100% pendant 5 min. Sécher les lames pendant 5 min dans la hotte. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section de tissu (par exemple, des structures non-corticales, y compris le thalamus et l'hypothalamus comme indiqué dans la figure 2).
- Pipette 10 ul du prétraitement-3 réactif (augmentation du taux de pénétration de la sonde) à chaque zone sélectionnée, et couvrent le plateau de l'humidité avec le couvercle. Placer le plateau dans le four à hybridationéquipé du agitateur horizontal et régler la température du four à 40 ºC; secouer doucement le plateau pendant 30 min. Laver les lames à deux reprises avec le trou DDH 2 O pendant 2 min.
2. L'hybridation et d'amplification
- Pipette 10 ul de TR2A, PPIB et dapB réactifs de sonde, respectivement, sur les zones sélectionnées. Couvrir le bac d'humidité avec le couvercle pour empêcher l'évaporation du réactif. Secouer doucement sur l'agitateur horizontal réglé à une vitesse faible. Incuber les lames à 40 ° C dans le four pendant 2 heures.
- Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif d'amplification-1 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min.
- Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-2 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min.
- Laver les lames à deux reprises wvec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-3 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 30 min.
- Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-4 de chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ° C pendant 15 min.
- Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-5 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 30 min.
- Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes. Pipette 10 ul du réactif Amplification-6 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à température ambiante pendant 15 min. Laver les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 minutes.
3. Signal Detection
- Introduire à la pipette 10 ul du réactif rouge à chaque région sélectionnée (A noter que le réactif est un mélange de rouge et rouge-B-A dans un rapport 1:60 et doit être utilisé immédiatement). Placer la lame dans le bac d'humidité sur le agitateur horizontal à température ambiante et agiter doucement à basse vitesse pendant 10 min.
- Laver les lames deux fois avec (ddH 2 O) pendant 10 min. Sécher les lames à 60 ° C dans le four pendant 15 min. Placer les lames dans le xylène sous la hotte pendant 5 min. Pipette 20 ul de milieu de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et couvrir avec une lamelle.
4. Capture d'image
- Prenez microphotographies numériques des zones sélectionnées (par exemple, l'hypothalamus, les figures 1 et 3) avec un grossissement de 4 × 20 × et des lentilles d'objectif. Enregistrez le fichier d'image.
5. Analyse des particules de l'image
- Glissez et déposez le fichier de l'image dans la fenêtre principale de ImageJ. Allez à la barre de menu et sélectionnez 'Image', suivant, sélectionnez "Type" dans le menu déroulant, puis sélectionnez '8-bit'.
- Sélectionnez «Réglage», puis sélectionnez «Threshold 'pour ouvrir la boîte de dialogue. Réglez la valeur de barre inférieure dans la boîte de dialogue afin que le fond indésirable est retiré. Allez à la barre de menu et sélectionnez «Analyser», puis sélectionnez «analyser des particules 'pour ouvrir une deuxième boîte de dialogue.
- Régler la taille des particules à 10, sélectionner la prochaine 'Show présente »et sélectionnez« Afficher les résultats »et« boîtes Résumer'. Enfin, cliquez sur «OK» pour afficher les données de particules dans les boîtes de dialogue.
6. Calcul Spreadsheet
- Saisissez les données dans la feuille Excel et en moyenne le nombre de particules dans le groupe SAL comme base de référence. Calculer le niveau de pourcentage de chaque section et faire un graphique en conséquence (Figure 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En utilisant les sondes d'ARN oligonucléotidique (<25 nt), l'hybridation peut être détectée sous forme de points rouges dans les cellules de l'hypothalamus préparés à partir de cerveaux congelés paraformaldehyde préfixée et frais. Les molécules d'ARNm HTR2A sont présents dans certaines cellules (indiquées par les flèches solides), mais pas d'autres (flèches ouvertes). Nous avons observé qu'il n'y a pas de différence entre le paraformaldehyde préfixée et les tissus congelés frais (figure 1). Une hybridation réussie peut être évaluée en premier à l'oeil nu (figure 2). Nous avons constaté que la zone sélectionnée (marquée avec des cercles) hybride avec la sonde dapB n'a pas montré un signal visible à l'œil nu (Figures 2A-B). En revanche, la zone hybride avec la sonde a montré PPIB signaux distribués de façon homogène dans toute la région examinée (figures 2C-D). Alors que dans le test de HTR2A, des signaux sont présents dans certains noyaux (indiqué par les flèches;
En conclusion, nos résultats ont montré que l'utilisation d'oligosondes nucléotidiques est spécifique et adaptée au tissu cérébral préfixé. En outre, des procédures de protocole, y compris l'hybridation in situ, l'analyse de détection de signal et de données peuvent être effectuées dans les deux jours.
Figure 1. Comparaison des tissus congelés frais et préfixés. Les procédures utilisées pour les cerveaux frais congelés ont été décrites ailleurs 5. Notez que les sections frais congelés ont été coupés à 20 um d'épaisseur tandis que les sections congelés fixé à 10 um. La sonde oligonucléotidique a été hybride HTR2A que la 5-HT de l'ARNm du récepteur de la figure 2A dans l'hypothalamus. Les flèches pleines indiquent les cellules contenant des molécules d'ARNm TR2A dans le surgelé (A) et les tissus préfixés (B). Flèches ouvertes, pas de molécules d'ARNm HTR2A détectés. Bar: 20 pm. Utilisation NIHAnalyse ImageJ, HTR2A a été compté. Nombre de chiffres de TR2A ne sont pas différents entre les tissus congelés frais et paraformaldéhyde préfixée (C). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Une vue à l'œil nu des signaux d'hybridation. Les tissus ont été préfixé avec paraformaldéhyde chez les rats anesthésiés profondément préalablement traités avec du sérum physiologique (SAL) et 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA). Les lignes en pointillés indiquent blanche de la région hybridée avec des sondes oligonucléotidiques. La couleur rouge indique les signaux d'ARNm à l'œil nu. Aucun signal rouge est observée en utilisant la sonde dapB hybridé à des sections de SAL-prétraité (A) ou des rats de MDMA prétraité (B PPIB (CD). Fait intéressant, les signaux rouges produits par la sonde de HTR2A ne sont que dans certaines régions (EF; flèches indiquent la zone hypothalamique). Coordonnées stéréotaxiques: -3.50 -3.80 ~ par rapport au bregma. 3V, le troisième ventricule. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Une vue microscopique lumineuse des signaux d'hybridation. Les tissus ont été préfixé avec paraformaldéhyde chez les rats anesthésiés profondément préalablement traités avec du sérum physiologique (SAL) et 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA). Sondes oligonucléotides sont dapB (AB), ppiB (CD) et HTR2A (EF). Les signaux d'hybridation sont identifiés comme des points rouges en utilisant les pouvoirs de grossissement de l'objectif 4 × allant de (Bars: 200 um). 20 × (microphotographies en médaillon) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Effet sur l'expression des HTR2A hypothalamique chez le rat traité au préalable avec MDMA. Échantillons ont été dosés en double et répétés trois fois. Les données sont exprimées en tant que pourcentage de la moyenne ± sem le groupe SAL (un total de 8 rats utilisés dans cette étude). * P <0,05 vs. le groupe SAL en utilisant le test t de Student.
| Nouveau | Paraformaldéhyde préfixée une | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Sonde de cible (HTR2A) | √ | √ | √ | |
| Sonde positive (PPIB) | - | √ | √ | |
| Sonde négative (dapB) | - | √ | √ | |
√, indique le groupe a examiné avec une sonde d'oligonucléotide dans cette étude.
-, Pas examiné;
un, chaque groupe de 4 animaux différents;
b, le groupe prétraité par voie intrapéritonéale avec une solution saline physique (SAL; NaCl à 0,9%);
c, prétraité par voie intraperitoneale avec 10 mg / kg MDMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la subvention du NIH (R15DA029863), la subvention Florida Atlantic University de recherche de premier cycle (M30014) et de l'École de médecine vétérinaire de subvention de recherche Ross University. Nous tenons à remercier l'Institut national sur l'abus des drogues (Rockville, MD) pour fournir (±) 3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ±) pour ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).
