Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

מהיר Published: September 23, 2015 doi: 10.3791/53165
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Protocol

נהלי שימוש בבעלי חיים מתוארים להלן אושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC) באוניברסיטת רוס לרפואת וטרינרית ואוניברסיטת פלורידה אטלנטיק. למרות טכניקות וכפפות סטריליות נדרשות, הסביבה נטול RNase אין צורך בעת השימוש בפרוטוקול זה.

1. הכנה

  1. הכנת רקמה וחתך
    1. הקצאת חולדות באופן אקראי לשלוש קבוצות: טרי / מלוח (SAL; 0.9% NaCl), ולפניה / SAL וקידומת / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ראה פירוט בטבלת 1).
    2. לנהל שלושה מינונים של 1 מיליליטר / קילוגרם SAL ו -10 מ"ג / קילוגרם MDMA intraperitoneally, בהתאמה, לקבוצות SAL וMDMA במרווח 2 שעות. הרשה בעלי חיים כדי לשרוד את הטיפול במשך 6 ימים.
    3. ביום 7, לנהל 100 מ"ג / קילוגרם קטמין בשילוב של 5 מ"ג / קילוגרם xylazine intraperitoneally לחולדות להרדמה עמוקה (כלומר, הפסד של מצמוץ בקרנית ות"אil לצבוט רפלקסים).
    4. לקבוצה הטרי / SAL, לערוף מהירות חולדות ולהסיר את המוח לבדיקת המוח הטרי (ראה פירוט בהתייחסות 5).
    5. לקבוצות / MDMA קידומת / SAL וקידומת, לעשות חתך לאורך עצם החזה על 10 -12 סנטימטרים ולאחר מכן לחשוף את הסוף של עצם החזה.
    6. החזק את הקצה של עצם החזה עם hemostat ולחתוך את הסרעפת רוחבית בשני הצדדים עם מספריים חדים ולאחר מכן לחתוך כלפי מעלה על פני הצלעות ומקבילות לריאות.
    7. ביד אחת, מחזיק את קצה הגחון של הלב עם מלקחיים קטנים. ביד השנייה, פירס החדר השמאלי עם מחט מזרק G 18 (שים לב לצד המתאם של המחט מחוברת עם צינור סיליקון בצורת אות V למכולות SAL וparaformaldehyde קר כקרח ומשאבות peristaltic; ראה התייחסות 9).
    8. הפעל את משאבת SAL ברמה בינונית של קצב הזרימה (~ 5 מיליליטר / דקה) ולנקב את אטריום ימין עם המלקחיים כדי לאפשר הבריחה של circ התמורהulation. לשמור זלוף SAL למשך 30 דקות.
    9. הפעל את משאבת paraformaldehyde ברמה בינונית ולאפשר paraformaldehyde 4% קרים כקרח לינקב את החיה במשך 30 דקות.
    10. הסר מכשיר זלוף ולערוף את החיה. הפוך posteroanterior לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, ואז לנפנף את הגולגולת כדי לחשוף את חלל גולגולת 10.
    11. הסר את המוח עם מרית מחלל הגולגולת ולמקם את המוח בצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 4% paraformaldehyde. שמור את המוח בתוך הצינור המכיל paraformaldehyde ב 4 מעלות צלזיוס מקרר למשך 24 שעות.
    12. הזז את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של 30% תמיסת סוכרוז ב 4 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לבסוף, לאחסן המוח בתוך שקיות פלסטיק ב -80 ° C עד שימוש.
    13. הר המוח על צ'אק עם תקשורת הטבעה ולהקפיא את תקשורת ההטבעה מכילה מוח בcryostat בטמפרטורה של -26 מעלות צלזיוס. חותך את קפא הטרימוח n ל -20 מיקרומטר חלקים וparaformaldehyde-התחילית מוח לסעיפים 10 מיקרומטר. העבר את הסעיף לשקופית מיקרוסקופ RT על ידי נגיעה בשקופית לסעיף.
    14. אוויר יבש ב RT במשך 4 שעות. אחסן את שקופיות הסעיף בשקית אטומה הדוק ב -80 ° C עד שימוש.
  2. התייבשות
    1. קח שקופיות מהמקפיא -80 ° C ולהקצות חלקים לאחת משלוש בדיקות: HT2A, ppiB (ביקורת חיובית) או dapB (שליטה שלילית); סימן וחתכים תווית עם עט כדורי (לא להשתמש בעיפרון). לצלול שקופיות באלכוהול 100% ב RT במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף.
  3. טיפול מקדים
    1. פיפטה 20 μl של המגיב לפני הטיפול-1 (איון של phosphatase אלקליין) בסעיפים בשקופיות. מניחים את השקופיות על רכבת מתלה במגש לחות (שים לב שהמגש מכוסה במכסה כדי לשמור על לחות גבוהה למניעת אידוי מsolutio התגובהn).
    2. נער בעדינות את מגש הלחות על שייקר אופקי במהירות נמוכה במשך 10 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים כפולים (DDH 2 O) במשך 2 דקות. להטביע את השקופיות בכוס 200 מיליליטר המכילה 150 מיליליטר של המגיב לפני הטיפול-2 (שבירה של הקשרים בין-הנגרמים על ידי קיבוע paraformaldehyde). מרתיחים את השקופיות עבור הסכום כולל של 5 דקות ב 100 מעלות צלזיוס (שיקום מושרה חום של מבנה RNA 11).
    3. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות. מניחים את השקופיות באלכוהול 100% במשך 5 דקות. ייבש את השקופיות במשך 5 דקות במנדף. השתמש בעט הידרופובי לצייר מעגל מסביב לאזור שנבחר בסעיף הרקמות (למשל, מבנים שאינן בקליפת המוח, כוללים התלמוס וההיפותלמוס כפי שמתוארים באיור 2).
    4. פיפטה 10 μl של המגיב לפני הטיפול-3 (עלייה בחדירת בדיקה) לכל אזור שנבחר, ולכסות את מגש הלחות עם המכסה. מניחים את המגש בתנור ההכלאהמצויד בייקר האופקי ולהגדיר את טמפרטורת התנור ב -40 מעלות צלזיוס; נער בעדינות את המגש למשך 30 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם DDH 2 O 2 דקות.

2. הכלאה והגברה

  1. פיפטה 10 μl של htr2a, ריאגנטים בדיקה ppiB וdapB, בהתאמה, באזורים הנבחרים. מכסה את מגש הלחות עם המכסה כדי למנוע אידוי של המגיב. נער בעדינות על שייקר האופקי להגדיר במהירות נמוכה. דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס בתנור למשך 2 שעות.
  2. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-1 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-2 על כל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  4. שטוף את השקופיות פעמיים wה- i כביסה חיץ במשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-3 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  5. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-4 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב 40 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-5 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT למשך 30 דקות.
  7. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות. פיפטה 10 μl של מגיב הגברה-6 בכל אזור שנבחר, לנער דגירה השקופיות ב RT במשך 15 דקות. שטוף את השקופיות פעמיים עם חיץ כביסה למשך 2 דקות.

3. גילוי אותות

  1. פיפטה 10 μl של המגיב האדום לכל אזור שנבחר (שים לב שמגיב היא תערובת של אדום-B ואדום-ביחס 1:60 ויש להשתמש ביmmediately). מניחים את השקף במגש הלחות על שייקר האופקי ב RT וללחוץ בעדינות במהירות נמוכה במשך 10 דקות.
  2. שטוף את השקופיות פעמיים עם (DDH 2 O) במשך 10 דקות. ייבש את השקופיות על 60 מעלות צלזיוס בתנור במשך 15 דקות. מניחים את השקופיות בקסילן מתחת למכסת מנוע קטר במשך 5 דקות. פיפטה 20 μl של תקשורת הרכבה מבוססת קסילן בכל אזור שנבחר ולכסות עם coverslip.

לכידת 4. תמונה

  1. קח microphotographs הדיגיטלי של האזורים הנבחרים (לדוגמא, ההיפותלמוס, איורים 1 ו 3) עם הגדלה של 4 × 20 × ועדשות אובייקטיביות. שמור את קובץ התמונה.

ניתוח חלקיקים 5. תמונה

  1. גרור ושחרר את קובץ התמונה בחלון ImageJ העיקרי. עבור לשורת תפריטים ובחרו 'תמונה', הבא לבחור "סוג" מהתפריט הנפתח, ובחר '8 סיביות ".
  2. בחירה 'התאם', ולאחר מכן בחר 'Threshold 'כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח. התאם את ערך הסרגל התחתון בתיבת הדו שיח כדי שהרקע לא רצוי יוסר. עבור לשורת תפריטים ובחרו 'לנתח', ולאחר מכן בחר 'לנתח חלקיקים' כדי לפתוח תיבה דו-שיח שנייה.
  3. הגדר את גודל חלקיקים בגיל 10, הבא בחר 'הצג מתווה' ובחר 'צג תוצאות "ו'קופסות' לסכם. לבסוף, לחץ על 'אישור' כדי להציג נתונים חלקיקים בתיבות דו-שיח.

חישוב 6. גיליון אלקטרוני

  1. הזן את הנתונים לגיליון Excel וממוצע המספרים של חלקיקים בקבוצת SAL כבסיס. לחשב את האחוז של כל קטע ולעשות גרף בהתאם (איור 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שימוש בבדיקות RNA oligonucleotide (<25 NT), הכלאה יכולה להתגלות כנקודות אדומות בתאי ההיפותלמוס הוכנו מהמוח הקפוא-התחילית paraformaldehyde וטרי. מולקולות mRNA htr2a נמצאות בכמה תאים (המסומנים בחצים מוצקים), אך לא לאחרים (חיצים פתוחים). הבחנו כי אין הבדל בין-התחילית paraformaldehyde והרקמות קפואים (איור 1). הכלאה מוצלחת ניתן להעריך ראשון בעין בלתי מזוינת (איור 2). מצאנו שהאזור שנבחר (מסומן בעיגולים) הכלאה עם הבדיקה dapB לא הראה אות גלויה לעין בלתי מזוינת (2 א-B דמויות). לעומת זאת, באזור הכלאה עם הבדיקה ppiB הראה אותות המופצים homogenously בכל האזור שנבדק (איורים 2C-D). בעוד שבבדיקת htr2a, אותות נמצאים בגרעינים מסוימים (המסומנים בחצים; htr2a. מעניין לציין, כי האותות בשקופיות MDMA היו חלשים יחסית בהשוואה לשקופיות SAL. פרטים מהותיים של אותות הכלאה ניתן להעריך במכשיר מיקרוסקופי. אין נקודה אדומה (איור 3 א-B) בתאי הכלאה עם הבדיקה dapB ואילו אותות ניתן לראות בכל רחבי השדה המיקרוסקופי הכלאה עם הבדיקה ppiB (איור 3 ג-ד). אותות htr2a ממוקמים בעיקר בגרעינים מסוימים של ההיפותלמוס (איור 3E-F). צפינו ירידה באותות htr2a ברקמות המוח שטופלו בעבר עם MDMA המערכתי ב 10 מ"ג / קילוגרם, אשר יכול להיות כמותית נקבעה באמצעות ניתוח ImageJ. כפי שניתן לראות באיור 4, מצאנו ירידה של 20% בביטוי htr2a.

לסיכום, התוצאות שלנו הראו כי שימוש באוליגובדיקות נוקלאוטיד היא ספציפית, ומתאים לרקמת המוח ולפניה. יתר על כן, נהלי פרוטוקול, כולל הכלאה באתר, ניתוח נתונים וזיהוי אותות יכולים להסתיים בתוך יומיים.

איור 1
נהלי איור 1. השוואה של הרקמות קפואים וקידומת. משמשים למוח קפואים תוארו במקום אחר 5. שים לב כי החלקים קפואים נחתכו ב 20 מיקרומטר בעובי תוך קבוע סעיפים קפוא ב -10 מיקרומטר. הבדיקה oligonucleotide הייתה htr2a שhybridizes mRNA קולט 2A 5-HT בהיפותלמוס. חצים מוצקים מצביעים על תאים המכילים מולקולות mRNA htr2a בקפואים () ורקמות התחילית (B). חיצים פתוחים, אין מולקולות mRNA htr2a זוהו. בר: 20 מיקרומטר. באמצעות NIHניתוח ImageJ, htr2a נספר. מספרים של ספירת htr2a אינם שונים בין הרקמות טריות ו- התחילית paraformaldehyde הקפואות (C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. מבט בעין בלתי מזוינת של אותות הכלאה. רקמות התחילית paraformaldehyde בחולדות מורדמות עמוק שטופלו בעבר עם מי מלח (SAL) ו3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). קווים מקווקווים הלבנים-מצביעים אזור הכלאה עם בדיקות oligonucleotide. הצבע האדום מציין אותות mRNA לעין בלתי מזוינת. אין אות אדומה נצפתה בעת השימוש בבדיקת dapB הכלאה סעיפים של SAL-pretreated () או חולדות-pretreated MDMA (B ppiB (CD). מעניין לציין, אותות אדומים המיוצרים על ידי הבדיקה htr2a הם רק באזורים מסוימים (EF; חצים מצביעים על אזור ההיפותלמוס). Stereotaxic קואורדינטות: -3.50 ~ -3.80 ביחס לגבחת. 3V, החדר השלישי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. מבט מיקרוסקופי אור של אותות הכלאה. רקמות התחילית paraformaldehyde בחולדות מורדמות עמוק שטופלו בעבר עם מי מלח (SAL) ו3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). בדיקות oligonucleotide הן dapB (AB), מדד המחירים ליצרןB (CD) וhtr2a (EF). אותות הכלאה מזוהים כנקודות אדומות באמצעות כוחות אובייקטיביים הגדלה נעים בין 4 × (ברים: 200 מיקרומטר). 20 × (microphotographs הבלעה) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. השפעה על ביטוי htr2a ההיפותלמוס בחולדות שטופלה בעבר עם MDMA. דוגמאות היו assayed בכפילויות וחזרו שלוש פעמים. הנתונים מבוטאים באחוזים ממוצעים ± SEM של קבוצת SAL (בסך הכל 8 חולדות ששמשו במחקר זה). * P <0.05 לעומת. קבוצת SAL באמצעות מבחן t של הסטודנט.

ד>
טרי התחילית-paraformaldehyde
SAL ב SAL ב MDMA ג
בדיקה יעד (htr2a) √ √ √
בדיקה חיובית (ppiB) - √ √
בדיקה שלילית (dapB) - √ √

√, מציין את הקבוצה בחנה עם הבדיקה oligonucleotide במחקר זה.
-, לא נבדק;
, כל קבוצה מכילה 4 חיות שונות;
ב, הקבוצה pretreated intraperitoneally עם מי מלח פיזי (SAL; 0.9% NaCl);
ג, pretreated intraperitoneally עם 10 מ"ג / קילוגרם MDMA.

1. עיצוב ניסיוני jove_content "> לוח

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R15DA029863), מענק אוניברסיטת פלורידה אטלנטיק מחקר לתואר ראשון (M30014) ואוניברסיטת רוס של מענק מחקר לרפואת הווטרינרית. ברצוננו להודות למכון הלאומי לשימוש בסמים (Rockville, MD) למתן (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) עבור עבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAscope Negative Control Probe-DapB Advanced cell diagnostic, INC 310098
RNAscope Pretreat 4 Advanced cell diagnostic, INC 320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red Advanced cell diagnostic, INC 310036
RNAscope Probe - Rn-Ppib Advanced cell diagnostic, INC 313921
Rat Htr2a Advanced cell diagnostic, INC 300031
Cryostat Leica CM 1850
Horizontal shaker VWR 88032-088
Hybridization oven Thermo Fisher Scientific 222000
Superfrost Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Hydrophobic pen Vector H-4000
Microscope Olympus Provis AX70

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
  3. Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
  4. Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
  5. Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
  6. Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
  7. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
  8. Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
  9. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
  10. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
  11. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
  12. Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
  13. Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
  14. Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
  15. Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
  16. Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
  17. Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
  18. Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).

Tags

Neuroscience גיליון 103 תסמונת סרוטונין, רעילות MDMA 5-HT ביטוי גנים שימוש בסמים
מהיר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה באמצעות oligonucleotide בדיקות במוח-התחילית Paraformaldehyde של חולדות עם סרוטונין תסמונת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shokry, I. M., Callanan, J. J.,… More

Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. J. Vis. Exp. (103), e53165, doi:10.3791/53165 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter