Protocol
Procedure per l'uso degli animali descritti di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) Ross University School di Medicina Veterinaria e Florida Atlantic University. Anche se sono necessarie tecniche sterili e guanti, l'ambiente privo di RNasi non è necessario durante l'utilizzo di questo protocollo.
1. Preparazione
- Preparazione dei tessuti e sezionamento
- Assegnare i ratti a caso in tre gruppi: fresco / salina (SAL; 0,9% NaCl), il prefisso / SAL e prefissati / 3,4-metilene (MDMA; vedi dettagli nella tabella 1).
- Somministrare tre dosi di 1 ml / kg SAL e 10 mg / kg per via intraperitoneale MDMA, rispettivamente, ai gruppi SAL e MDMA a intervalli 2 ore. Lasciare gli animali a sopravvivere il trattamento per 6 giorni.
- Il giorno 7, somministrare 100 mg / kg di ketamina in combinazione di 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina ai ratti per una anestesia profonda (cioè, perdita di lampeggio corneale e tail pizzico riflessi).
- Per il gruppo fresco / SAL, decapitate rapidamente ratti e rimuovere il cervello per il test del cervello fresco (vedi dettagli nel riferimento 5).
- Per i gruppi / MDMA prefissati / SAL e prefissati, effettuare un taglio lungo lo sterno circa 10 -12 cm e quindi esporre l'estremità dello sterno.
- Tenere l'estremità dello sterno con una pinza emostatica e tagliare il diaframma lateralmente da entrambi i lati con forbici affilate e poi tagliare verso l'alto attraverso le costole e paralleli ai polmoni.
- Con una mano, tenere la punta ventrale del cuore con piccole pinze. Con l'altra mano, perforare il ventricolo sinistro con una G siringa 18 (notare il lato dell'adattatore dell'ago è collegato con un tubo flessibile di silicio a forma di Y per SAL e paraformaldeide contenitori ghiacciate e pompe peristaltiche, vedere il riferimento 9).
- Accendere la pompa SAL al livello medio della portata (~ 5 ml / min) e forare l'atrio destro con la pinza per consentire la fuoriuscita di ritorno circlamento. Mantenere SAL perfusione per 30 min.
- Accendere la pompa paraformaldeide al livello medio e consentire il ghiacciata 4% paraformaldeide per defluire in all'animale per 30 min.
- Rimuovere strumento perfusione e decapitare il animali. Fare un postero tagliare la linea mediana del cranio, e poi sbattere il cranio per esporre la cavità del cranio 10.
- Rimuovere il cervello con una spatola dalla cavità cranio e posizionare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di 4% paraformaldeide. Mantenere il cervello all'interno del tubo-paraformaldeide contenente 4 ºC frigorifero per 24 ore.
- Spostare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C per 3 giorni. Infine, conservare il cervello in sacchetti di plastica a -80 ° C fino all'uso.
- Montare il cervello su un mandrino con i media embedding e congelare i media incorporamento contenenti cervello in un criostato ad una temperatura di -26 ° C. Tagliare il congelato frescon cervello in 20 sezioni micron e il cervello paraformaldeide-preceduti in sezioni di 10 micron. Trasferire la sezione di un vetrino da microscopio RT toccando la slitta alla sezione.
- Asciugare a temperatura ambiente per 4 ore. Conservare i vetrini sezione in un sacchetto stretto sigillato a -80 ° C fino all'uso.
- Disidratazione
- Prendere diapositive dal -80 ° C freezer e assegnare sezioni in una delle tre prove: HT2A, ppiB (controllo positivo) o dapB (controllo negativo); marchio e le sezioni di etichette con una penna a sfera (non usare una matita). Immergere i vetrini in 100% di alcol a temperatura ambiente per 5 minuti. Asciugare i vetrini per 5 minuti in una cappa aspirante.
- Pretrattamento
- Pipettare 20 ml di pretrattamento-1 (reagente inattivazione della fosfatasi alcalina), alle sezioni su vetrini. Porre i vetrini su una cremagliera in un vassoio di umidità (notare che il vassoio è coperta con un coperchio per mantenere una elevata umidità per prevenire evaporazione dal solutio reazionen).
- Agitare delicatamente il vassoio di umidità su un agitatore orizzontale a bassa velocità per 10 min. Lavare i vetrini due volte con acqua bidistillata (DDH 2 O) per 2 min. Immergere il vetrino in un becher da 200 ml contenente 150 ml del pretrattamento-2 reagente (rottura dei legami trasversali indotte da fissazione paraformaldeide). Lessare i vetrini per un totale di 5 min a 100 ° C (ripristino indotta dal calore della struttura dell'RNA 11).
- Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min. Porre i vetrini in 100% di alcol per 5 min. Essiccare i vetrini per 5 min in cappa. Utilizzare una penna idrofobico per disegnare un cerchio attorno all'area selezionata nella sezione di tessuto (ad esempio, strutture non corticali, tra talamo e ipotalamo come delineate nella figura 2).
- Pipettare 10 ml di pretrattamento-3 reagente (aumenti di penetrazione della sonda) per ogni area selezionata, e coprire il vassoio di umidità con il coperchio. Posizionare il vassoio nel forno di ibridazioneequipaggiato con lo shaker orizzontale e impostare la temperatura del forno a 40 ° C; scuotere delicatamente il cassetto per 30 min. Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min.
2. Ibridazione e Amplificazione
- Pipettare 10 ml di HTR2A, ppiB e dapB reagenti sonda, rispettivamente, sulle aree selezionate. Coprire il vassoio di umidità con il coperchio per evitare l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente l'agitatore orizzontale impostato a bassa velocità. Incubare i vetrini a 40 ° C in forno per 2 ore.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-1 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-2 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte with un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-3 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-4 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-5 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-6 su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 min. Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min.
3. Rilevamento segnale
- Pipettare 10 ml di reagente Red a ciascuna area selezionata (Si noti che il reagente è una miscela di rosso-B e Red-A con un rapporto 1:60 e deve essere utilizzato imediatamente). Posizionare il vetrino nel cassetto umidità sulla agitatore orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 min.
- Lavare i vetrini due volte con (DDH 2 O) per 10 min. Essiccare i vetrini a 60 ° C in forno per 15 min. Porre i vetrini in xilene sotto la cappa per 5 min. Dispensare 20 ml di mezzo di montaggio a base di xilene, su ogni area selezionata e coprire con un coprioggetto.
4. Acquisizione Immagine
- Prendere microfotografie digitali delle aree selezionate (ad esempio, ipotalamo, le figure 1 e 3) con un ingrandimento di 4 × 20 × e lenti dell'obiettivo. Salvare il file di immagine.
Analisi Particle 5. Immagine
- Trascinare e rilasciare il file immagine nella finestra di ImageJ principale. Vai alla barra dei menu e selezionare 'Immagine', successiva selezionare 'Tipo' dal menu a discesa, quindi selezionare '8-bit'.
- Seleziona 'Regola', quindi selezionare 'Threshold 'per aprire la finestra di dialogo. Regolare il valore barra inferiore della finestra di dialogo in modo che il fondo indesiderato viene rimosso. Vai alla barra dei menu e selezionare 'Analizza', quindi selezionare 'Analizza Particelle' per aprire una seconda finestra di dialogo.
- Impostare la dimensione delle particelle a 10, prossimo selezionare 'Mostra delinea' e selezionare 'Mostra risultati "e" scatole Riassumere'. Infine, fare clic su 'OK' per visualizzare i dati delle particelle nelle finestre di dialogo.
6. Foglio di calcolo
- Inserire i dati nel foglio Excel e la media dei numeri di particelle nel gruppo SAL come linea di base. Calcolare il livello percentuale di ogni sezione e fare un grafico di conseguenza (Figura 4).
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Representative Results
Usando le sonde oligonucleotidi RNA (<25 nt), ibridazione può essere rilevato come punti rossi nelle cellule dell'ipotalamo preparate dal cervello paraformaldeide-prefissato e freschi congelati. Le molecole di mRNA HTR2A sono presenti in alcune cellule (indicati dalle frecce solidi), ma non altri (frecce aperti). Abbiamo osservato che non vi è alcuna differenza tra la paraformaldeide-prefissato e tessuti freschi congelati (Figura 1). Un ibridazione successo può essere valutato per primo occhio nudo (Figura 2). Abbiamo trovato che l'area selezionata (contrassegnata con cerchi) ibridato con la sonda dapB non ha mostrato un segnale visibile ad occhio nudo (Figure 2A-B). Al contrario, l'area ibridato con la sonda ppiB presenta segnali omogeneamente distribuite in tutta la regione in esame (figure 2C-D). Mentre nel test HTR2A, segnali sono presenti in alcuni nuclei (indicata dalle frecce;
In conclusione, i nostri risultati hanno dimostrato che utilizzando oligosonde nucleotidiche è specifica, e adatti per il tessuto cerebrale prefissato. Inoltre, le procedure di protocollo, anche in ibridazione in situ, l'analisi dei dati e il rilevamento del segnale può essere completato nel giro di due giorni.
Figura 1. Confronto dei tessuti freschi e congelati prefissati. Le procedure utilizzate per cervelli freschi congelati, sono state descritte altrove 5. Si noti che le sezioni freschi congelati sono stati tagliati a 20 micron di spessore, mentre le sezioni congelate fissato a 10 micron. La sonda oligonucleotide era HTR2A che ibrida il 5-HT mRNA del recettore 2A nell'ipotalamo. Frecce continue indicano cellule contenenti molecole di mRNA HTR2A nel fresco congelato (A) e tessuti prefissate (B). Frecce Open, non molecole di mRNA HTR2A rilevati. Bar: 20 micron. Utilizzando NIHAnalisi ImageJ, HTR2A è stato contato. Numero di conteggi HTR2A non sono diversi tra i tessuti congelati freschi e paraformaldeide-prefisso (C). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Una vista ad occhio nudo di segnali di ibridazione. I tessuti sono stati preceduti dal prefisso paraformaldeide in ratti anestetizzati profondamente precedentemente trattati con soluzione salina (SAL) e 3,4-Metilendiossinaetanfetamina (MDMA). Le linee bianche tratteggiate indicano la regione ibridato con sonde oligonucleotidiche. Il colore rosso denota segnali di mRNA a occhio nudo. Nessun segnale rosso si osserva mentre si utilizza la sonda dapB ibridato alle sezioni di SAL-pretrattati (A) o topi pre-trattati con MDMA (B ppiB (CD). È interessante notare che i segnali rossi prodotti dalla sonda HTR2A sono solo in alcune regioni (EF, frecce indicano l'area ipotalamica). Coordinate stereotassica: -3.50 ~ -3,80 rispetto al bregma. 3V, il terzo ventricolo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Una vista microscopico luce di segnali di ibridazione. I tessuti sono stati preceduti dal prefisso paraformaldeide in ratti anestetizzati profondamente precedentemente trattati con soluzione salina (SAL) e 3,4-Metilendiossinaetanfetamina (MDMA). Sonde oligonucleotidiche sono dapB (AB), ppiB (CD) e HTR2A (EF). Segnali di ibridazione sono identificati come punti rossi con poteri di ingrandimento oggettivi che vanno da 4 × (bar: 200 micron). A 20 × (microfotografie inserto) Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetti sul espressione HTR2A ipotalamo nei ratti precedentemente trattati con MDMA. I campioni sono stati analizzati in duplicato e ripetuti tre volte. I dati sono espressi come percentuale media ± SEM del gruppo SAL (un totale di 8 ratti utilizzati in questo studio). * P <0,05 vs. il gruppo SAL mediante test t di Student.
| Fresco | Paraformaldeide prefissa un | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Sonda Target (HTR2A) | √ | √ | √ | |
| Sonda positiva (ppiB) | - | √ | √ | |
| Sonda negativo (dapB) | - | √ | √ | |
√, indica il gruppo in esame con sonda oligonucleotide in questo studio.
-, Non esaminati;
un, ciascun gruppo contiene 4 animali diversi;
b, il gruppo pretrattato con soluzione salina per via intraperitoneale fisica (SAL; 0,9% NaCl);
c, pretrattati per via intraperitoneale con 10 mg / kg di MDMA.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH (R15DA029863), la concessione Florida Atlantic University di ricerca triennale (M30014) e la Scuola di Medicina Veterinaria assegno di ricerca Ross University. Vorremmo ringraziare il National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) per la fornitura di (±) 3,4-metilene (± MDMA) per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).
