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Neuroscience

빠른 Published: September 23, 2015 doi: 10.3791/53165
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

Protocol

아래에 설명 된 동물 사용 절차는 동물 용 의약품의 로스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)와 플로리다 애틀랜틱 대학에 의해 승인되었다. 멸균 기술과 장갑이 필요하지만이 프로토콜을 사용하는 동안의 RNase없는 환경이 필요하지 않습니다.

1. 준비

  1. 조직 준비와 절편
    1. 세 그룹으로 무작위로 쥐를 할당 :,, SAL / 접두사 및 / 3,4-methylenedioxymethamphetamine 접두사 신선한 / 식염수 (0.9 % NaCl을 SAL) (MDMA를 표 1에서 자세한 내용을 참조).
    2. 2 시간 간격으로 SAL 및 MDMA 그룹, 복강, 각각 1 ㎖ / ㎏ SAL 및 10 ㎎ / ㎏ MDMA의 세 가지 용량을 관리합니다. 동물 6 일 동안 치료 살아남을 수 있습니다.
    3. 7 일에, 5 mg의 조합에 100 ㎎ / ㎏ 케타민을 관리 / 복강 깊은 마취에 대한 쥐 (에 자일 라진을 kg 즉, 각막 깜짝 및 타 손실김정일이) 반사 신경을 꼬집어.
    4. 신선한 / SAL 그룹의 경우, 신속하게 쥐 목을 벨과 (기준 5에서 세부 사항을 참조) 신선한 뇌 테스트 뇌를 제거합니다.
    5. SAL / 접두사와 접두사 / MDMA 그룹의 경우, 흉골 약 10 -12 cm 따라 절단을 한 후 흉골의 끝을 노출.
    6. 지혈제와 흉골의 끝을 잡고 날카로운 가위로 양쪽 측면 다이어프램을 절단 한 후 폐에 갈비와 병렬을 통해 위로 잘라.
    7. 한 손으로, 작은 집게로 마음의 복부 끝을 잡고. 다른 한편으로, 18 G 주사기 바늘 좌심실 피어스 (빙냉 SAL과 파라 포름 알데히드 및 용기 연동 펌프에 Y 자형 실리콘 호스와 연결되어 바늘 어댑터 측에 유의 참조 기준 9).
    8. 유량 (~ 5 ml / 분)의 중간 수준에서 SAL 펌프를 켜고 반환 CIRC의 탈출을 할 수 있도록 집게로 우심방에 구멍위험률. 30 분 동안 SAL 관류를 유지한다.
    9. 중간 수준에서 파라 포름 알데히드 펌프를 켜고 얼음처럼 차가운 4 % 파라 포름 알데히드는 30 분 동안 동물을 관류 할 수 있습니다.
    10. 관류 악기를 제거하고 동물의 목을 벨. 두개골의 정중선을 통해 절단 후 전방을 확인하고 두개골 캐비티 (10)를 노출하는 두개골 플랩.
    11. 두개골 캐비티에서 주걱으로 뇌를 제거하고 25 ml를 4 % 파라 포름 알데히드를 포함하는 50 ML의 원심 분리기 튜브에 두뇌를 놓습니다. 24 시간 동안 4 ºC 냉장고에서 파라 포름 알데히드 함유 튜브 내 뇌를 유지합니다.
    12. 3 일 4 ºC에서 30 % 자당 용액 25 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 원심 분리 튜브로 이동 뇌. 마지막으로, 사용까지 -80 ° C에서 비닐 봉지 내 뇌를 저장합니다.
    13. 내장 미디어 척에 두뇌를 탑재하고 -26 ºC의 온도에서 저온 유지 장치에 뇌가 포함 된 내장 미디어를 동결. 신선한 동결을 잘라n 개의 20 μm의 섹션으로 뇌와 10 μm의 섹션으로 뇌를 파라 포름 알데히드는-접두사. 섹션에 슬라이드를 터치하여 RT 현미경 슬라이드에 섹션을 전송합니다.
    14. 공기 건조 4 시간 동안 실온에서. 사용까지 -80 ° C에서 꽉 밀봉 된 봉투에 섹션 슬라이드를 저장합니다.
  2. 탈수
    1. -80 ° C의 냉동고에서 슬라이드를 타고 1 ~ 3의 시험에 섹션을 할당합니다 HT2A, ppiB (양성 대조군) 또는 dapB (음성 대조군); 마크와 공 펜 라벨 섹션 (연필을 사용하지 마십시오). 5 분 동안 실온에서 100 % 알코올에 슬라이드를 담근다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조.
  3. 전처리
    1. 피펫 슬라이드 부분에 전처리-1 시약 20 μL (알칼리 포스 파타 아제의 불 활성화). 수분 트레이 선반 레일에 슬라이드를 배치 (트레이 반응 solutio로부터 증발을 방지하기위한 높은 습도를 유지하는 덮개로 덮여 있음에 유의N).
    2. 조심스럽게 10 분 동안 저속으로 수평 통에 습기 트레이를 흔들. 2 분 동안 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. (파라 포름 알데히드 고정에 의한 가교 결합의 파괴) -2- 전처리 시약을 150 ㎖을 함유하는 200 ml의 비이커에 슬라이드를 담근다. 100 ºC (RNA 구조 (11)의 열 - 유도 복원)에서 5 분의 총 슬라이드를 끓인다.
    3. 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 5 분 동안 100 % 알코올에 슬라이드를 놓습니다. 흄 후드에서 5 분 동안 슬라이드를 건조. 조직 섹션에서 선택된 영역 주위에 원을 그릴 소수성 펜을 사용하여 (예를 들어, 그림 2에 설명 된대로 시상과 시상 하부를 포함한 비 대뇌 피질의 구조).
    4. 피펫 전처리-3 시약 선택한 각 영역 (프로브 침투의 증가)의 10 μL, 그리고 뚜껑 수분 트레이 커버. 하이브리드 오븐에서 트레이를 배치수평 교반기 장착 40 ºC 오븐 온도를 설정; 부드럽게 30 분 동안 트레이를 흔들. 2 분 동안 DDH 2 O로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.

2. 하이브리드 및 증폭

  1. 피펫 선택된 영역에 각각 htr2a, ppiB 및 dapB 프로브 시약 10 μL,,. 시약의 증발을 방지하기 위해 뚜껑 수분 트레이 커버. 부드럽게 저속으로 설정 수평 진탕 기에서 흔들어. 2 시간 동안 오븐에서 40 ºC에서 슬라이드를 배양한다.
  2. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-1 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  3. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-2 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  4. 두 번 W 슬라이드를 씻으2 분 동안 세척 버퍼 번째. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-3 시약 10 μL, 흔들어 30 분간 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  5. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-4 시약 10 μL, 흔들어 15 분 40 ºC에서 슬라이드를 품어.
  6. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫은 각각의 선택된 영역 상에 증폭 -5- 시약 10 μL, 진탕​​하고, 30 분간 RT에서 슬라이드를 배양한다.
  7. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 피펫 선택한 각 지역의 증폭-6 시약 10 μL, 흔들 실온에서 15 분 동안 슬라이드를 품어. 2 분 동안 세척 버퍼로 두 번 슬라이드를 씻으십시오.

3. 신호 감지

  1. 각 선택 영역에 레드 시약의 피펫 10 μL은 (시약 레드-B와 레드의 혼합물이 1:60 비율로 내가 사용되어야합니다mmediately). 실온에서 수평 통에 습기 트레이에 슬라이드를 삽입하고 10 분 동안 저속으로 부드럽게 흔들어.
  2. 10 분 동안 (DDH 2 O)로 두 번 슬라이드를 씻으십시오. 15 분 동안 오븐에서 60 ºC에서 슬라이드를 건조. 5 분 흄 후드에서 크실렌의 슬라이드를 놓습니다. 피펫 (20) 선택한 각 지역에 크실렌 기반 설치 미디어의 μL 및 커버 슬립 커버.

4. 이미지 캡처

  1. 4 × 20 × 대물 렌즈의 배율 선택 영역 (예, 시상 하부는, 1과 3도)의 디지털 현미경 사진을 가져 가라. 이미지 파일을 저장합니다.

5. 이미지의 입자 분석

  1. 드래그하여 주 ImageJ에 창에 이미지 파일을 놓습니다. 메뉴 표시 줄로 이동하여 '이미지'를 선택, 다음 드롭 다운 메뉴에서 '형식'을 선택하고 '8 비트'를 선택합니다.
  2. 선택한 다음 '의 Thr를 선택,'조정 'eshold은 '대화 상자를 엽니 다. 원치 않는 배경이 제거되도록 대화 상자에서 낮은 바 값을 조정합니다. 다음 두 번째 대화 상자를 엽니 다 '입자 분석'을 선택, 메뉴 표시 줄로 이동하여 '분석'을 선택합니다.
  3. (10)에서 입자 크기를 설정, 다음 '쇼 개요'를 선택하고 '결과 표시'와 '요약한다'상자를 선택합니다. 마지막으로, 대화 상자에 입자 데이터를 볼 수있는 '확인'을 클릭합니다.

6. 스프레드 시트 계산

  1. 엑셀 시트에 데이터를 입력하고 기준으로 SAL 그룹에 입자의 수​​를 평균. 각 섹션의 백분율 레벨을 계산하고 그에 따라 그래프 (도 4)를 만든다.

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Representative Results

올리고 뉴클레오티드 RNA 프로브 (<25 NT)를 사용하여, 하이브리드는 파라 포름 알데히드 - 접두사 및 냉동 뇌에서 준비 시상 하부 세포에서 빨간 점으로 검출 할 수있다. htr2a mRNA의 분자 (실선 화살표로 표시됨) 일부 셀에 존재하는, 그러나 기타 (개방 화살표). 우리는 파라 포름 알데히드 접두어 및 냉동 조직 (도 1) 사이에 차이가없는 것을 관찰했다. 성공적인 하이브리드는 육안 (그림 2)에 의해 처음으로 평가 될 수있다. 우리는 dapB 프로브와 하이브리드 (원 표시) 선택된 영역이 육안 (도 2A-B)에 보이는 신호를 표시하지 않은 것으로 나타났다. 대조적으로, ppiB 프로브와 하이브리드 영역은 균일하게 조사 영역 (도 2C-D)에 걸쳐 분산 신호를 보여 주었다. htr2a 테스트 중에, 신호는 화살표로 나타낸 특정 핵 (존재한다; htr2a 프로브와 하이브리드 하였지만. 흥미롭게도, MDMA 슬라이드의 신호는 SAL 슬라이드에 비해 상대적으로 약한했다. 혼성화 신호의 실질적인 세부 사항은 현미경 하에서 기기 평가 될 수있다. ppiB 프로브 (그림 3C-D)와 하이브리드 현미경 분야에 걸쳐 볼 수있는 신호 반면 dapB 프로브와 하이브리드 세포에는 빨간색 점 (그림 3A-B)는 없다. htr2a 신호는 주로 시상 하부 (그림 3E-F)의 특정 핵에 있습니다. 우리는 ImageJ에 정량적 분석을 사용하여 결정될 수있다 이전에 10 ㎎ / ㎏로 MDMA 전신 치료 뇌 조직에서 htr2a 신호의 감소를 관찰 하였다. 도 4에 도시 된 바와 같이, 우리는 htr2a 발현의 20 % 감소를 알았다.

결론적으로, 우리의 결과는 올리고을 사용하는 것으로 나타났다뉴클레오티드 프로브는 접두사 뇌 조직에 대한 구체적인, 그리고 적합하다. 또한, 반응계에 포함 혼성화 프로토콜 절차는, 신호 검출 및 분석 데이터 2 일 이내에 완료 될 수있다.

그림 1
냉동 두뇌 사용도 신선하고 접두어 냉동 조직 1. 비교. 절차는 다른 곳에서 5 설명 하였다. 10 μm의에서 동결 절편을 고정하면서 신선한 동결 절편 두께 20 μm의에서 절단합니다. 올리고 뉴클레오티드 프로브는 시상 하부에서의 5-HT 2A 수용체의 mRNA를 혼성화 htr2a이었다. 실선 화살표는 냉동 (A)에 htr2a의 mRNA 분자를 함유하는 세포와 조직 접두어 (B)를 나타낸다. 열기 화살표, 더 htr2a mRNA의 분자가 검출되지. 바 : 20 μm의. NIH 사용ImageJ에 분석, htr2a 세었다. htr2a 카운트의 숫자가 신선하고 파라 포름 알데히드 - 접두사 냉동 조직 (C) 사이의 차이가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
하이브리드 신호 그림 2. 맨눈으로보기. 조직은 이전에 생리 식염수 (SAL)와 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA)로 처리 깊이 마취 된 쥐에서 파라 포름 알데히드로 시작되었다. 흰 점선은 올리고 뉴클레오티드 프로브와 하이브리드 영역을 나타냅니다. 붉은 색은 육안으로 mRNA의 신호를 나타낸다. SAL-전처리 (A)의 섹션이나 MDMA 전처리 쥐에 하이브리드 dapB 프로브를 사용하는 동안 어떤 빨간 신호는 B (관찰되지 ppiB 프로브 (CD)를 사용하는 동안 반대로, 빨간 신호가 균일하게 시상 하부 지역에 분포되어있다. 흥미롭게도, htr2a 프로브에 의해 생성 된 빨간 신호는 일부 지역에 (EF, 화살표 시상 하부 영역을 나타낸다). 정위 좌표 : 브레 그마에 -3.50 ~ -3.80 상대를. 3V, 제 3 뇌실이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 하이브리드 신호의 광학 현미경보기. 조직은 이전에 생리 식염수 (SAL)와 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA)로 처리 깊이 마취 된 쥐에서 파라 포름 알데히드로 시작되었다. 올리고 뉴클레오티드 프로브는 dapB (AB), PPI 있습니다B (CD) 및 htr2a (EF). (바 : 200 μm의) 하이브리드 신호가 4 × 이르기까지 목적 배율의 힘을 사용하여 빨간색 점으로 식별됩니다. 20 × (삽입 된 현미경 사진)에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
래트의 시상 하부 htr2a 발현에 미치는 영향도 4는 이전 MDMA로 처리 하였다. 샘플을 세 번 중복으로 분석하고 반복 하였다. 데이터는 SAL 그룹 평균 ± SEM 백분율 (본 연구에 사용 된 8 래트의 합계)로 표현된다. * P <0.05 대. 스튜던트 t 검정을 이용 SAL 기.

D>
신선한 파라 포름 알데히드 - 접두사
SAL의 B SAL의 B MDMA의 C
대상 프로브 (htr2a) √ √ √
긍정적 인 프로브 (ppiB) - √ √
음의 프로브 (dapB) - √ √

√, 본 연구에서 올리고 뉴클레오티드 프로브와 검사 그룹을 나타냅니다.
- 조사하지;
각 그룹은 4 가지 동물을 포함,
B, 물리적 식염수로 복강 전처리 그룹 (SAL 0.9 %의 NaCl);
C, 10 ㎎ / ㎏ MDMA 복강 전처리.

"jove_content> 표 1. 실험 설계

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Disclosures

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

본 연구는 NIH 보조금 (R15DA029863)에 의해 지원되었다, 플로리다 애틀랜틱 대학의 학부 연구 보조금 (M30014) 및 동물 용 의약품의 연구 보조금의 로스 대학. 우리는이 일을 위해 (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA)를 제공하는 국립 약물 남용 연구소 (락빌, MD)에 감사의 말씀을 전합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RNAscope Negative Control Probe-DapB Advanced cell diagnostic, INC 310098
RNAscope Pretreat 4 Advanced cell diagnostic, INC 320046
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red Advanced cell diagnostic, INC 310036
RNAscope Probe - Rn-Ppib Advanced cell diagnostic, INC 313921
Rat Htr2a Advanced cell diagnostic, INC 300031
Cryostat Leica CM 1850
Horizontal shaker VWR 88032-088
Hybridization oven Thermo Fisher Scientific 222000
Superfrost Plus microscope slide Fisher Scientific 12-550-15
Hydrophobic pen Vector H-4000
Microscope Olympus Provis AX70

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References

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신경 과학 문제 (103) 세로토닌 증후군, MDMA 독성 5-HT 약물 남용
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Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome. J. Vis. Exp. (103), e53165, doi:10.3791/53165 (2015).

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