Protocol
Animal bruke prosedyrene beskrevet nedenfor ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Ross University School of Veterinary Medicine og Florida Atlantic University. Selv om sterile teknikker og hansker er nødvendig, er det RNase-fritt miljø ikke nødvendig ved bruk av denne protokollen.
1. Forberedelse
- Tissue forberedelse og seksjonering
- Tildele rotter tilfeldig inn i tre grupper: Frisk / saltvann (SAL; 0,9% NaCl), innledes / SAL og prefiks / 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA, se detaljer i tabell 1).
- Administrere tre doser med 1 ml / kg SAL og 10 mg / kg MDMA intraperitonealt, henholdsvis til de SAL og MDMA grupper på to timers intervall. Tillat dyr for å overleve ved behandling i 6 dager.
- På dag 7, administreres 100 mg / kg ketamin i kombinasjon med 5 mg / kg xylazin intraperitonealt til rotter i en dyp anestesi (dvs. tap av hornhinne blink og tail klype reflekser).
- For den ferske / SAL gruppe, raskt halshogge rotter og fjerne hjernen for den friske hjernen test (se detaljer i referanse 5).
- For innledes / SAL og prefiks / MDMA grupper, lage et kutt langs brystbenet ca 10 -12 cm og deretter utsette slutten av sternum.
- Hold enden av sternum med pinsetten og kutte mellomgulvet lateralt på begge sider med skarp saks og deretter kutte oppover over ribbeina og parallelt med lungene.
- Med den ene hånden, hold ventral spissen av hjertet med små tang. Med den andre hånden, stikke hull på venstre ventrikkel med en 18 G sprøytespissen (merk adapter siden av nålen er forbundet med en Y-formet silikon slange til iskalde SAL og paraformaldehyd containere og peristaltiske pumper, se referansen 9).
- Slå på SAL pumpen ved middels nivå av strømningshastighet (~ 5 ml / min) og punktering høyre atrium med pinsett for å tillate utslipp av returkretserlet. Oppretthold SAL perfusjon i 30 min.
- Slå på paraformaldehyd pumpen ved middels nivå og la iskald 4% paraformaldehyd til perfuse dyret i 30 minutter.
- Fjern perfusjon instrument og halshogge dyret. Lag en posteroanterior skjære gjennom midtlinjen av skallen, og deretter klaff skallen for å avsløre skallen hulrom 10.
- Fjern hjernen med en spatel fra skallen hulrommet og plassere hjernen hos et 50 ml sentrifugerør inneholdende 25 ml av 4% paraformaldehyd. Hold hjernen innenfor paraformaldehyd-inneholdende rør ved 4 ° C kjøleskap i 24 timer.
- Flytt hjernen til et 50 ml sentrifugerør inneholdende 25 ml 30% sukroseoppløsning ved 4 ° C i 3 dager. Til slutt lagrer hjernen innen plastposer ved -80 ° C til bruk.
- Monter hjernen på en chuck med innebygging media og fryse embedding medier som inneholder hjernen i en kryostat ved temperatur på -26 ºC. Skjær friske frøsn hjernen til 20 mikrometer seksjoner og paraformaldehyde-prefiks hjernen til 10-mikrometer seksjoner. Overfør delen til en RT objektglass ved å berøre lysbildet til seksjonen.
- Lufttørke ved romtemperatur i 4 timer. Oppbevar seksjons lysbilder i en tett forseglet pose ved -80 ° C til bruk.
- Dehydrering
- Ta lysbilder fra -80 ° C fryser og tildele deler i en av tre tester: HT2A, ppiB (positiv kontroll) eller dapB (negativ kontroll); mark og label seksjoner med en kulepenn (ikke bruk en blyant). Senk glir i 100% alkohol ved RT i 5 min. Tørk lysbildene i 5 min i en avtrekkshette.
- Forbehandling
- Pipetter 20 mL av Forbehandling-en reagens (inaktivering av alkalisk fosfatase) til avsnittene om skred. Plasser lysbilder på et stativ jernbane i fukt brett (merk at skuffen er dekket med et lokk for å opprettholde en høy luftfuktighet for å hindre fordamping fra reaksjonen løsning;n).
- Rist fuktighet skuffen på en horisontal rystemaskin ved lav hastighet i 10 minutter. Vask objektglassene to ganger med dobbeltdestillert vann (DDH 2 O) i 2 min. Senk sleiden i et 200 ml begerglass som inneholdt 150 ml av Forbehandling-2-reagens (bryte av tverrbindinger som induseres av paraformaldehyd fiksering). Kok lysbildene i totalt 5 minutter ved 100 ° C (varme-indusert restaurering av RNA struktur 11).
- Vask lysbildene to ganger med DDH 2 O for 2 min. Plasser lysbildene i 100% alkohol i 5 min. Tørk lysbildene i 5 min i avtrekksskap. Bruk en hydrofob penn til å tegne en sirkel rundt det valgte området i vevet delen (f.eks, ikke-kortikale strukturer, inkludert thalamus og hypothalamus som skissert i figur 2).
- Pipetter 10 mL av Forbehandling-3 reagent (økninger i sonde penetrasjon) til hvert valgte området, og dekker fuktighet skuffen med lokk. Plasser skuffen i hybridisering ovnenutstyrt med den horisontale shaker og stille inn temperaturen på 40 grader, rist skuffen i 30 min. Vask lysbildene to ganger med DDH 2 O for 2 min.
2. Hybridisering og Amplification
- Pipetter 10 mL av htr2a, ppiB og dapB probe reagenser, henholdsvis på de utvalgte områdene. Dekk fuktighet skuffen med lokk for å forhindre fordamping av reagensen. Rist forsiktig på den horisontale risteren innstilt på en lav hastighet. Inkuber lysbilder på 40 ºC i ovnen i 2 timer.
- Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-1 reagens på hver valgte området, rist og inkuber ved 40 ° C lysbildene i 30 min.
- Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-2-reagens på hver valgte området, rist og inkuber ved 40 ° C lysbildene i 15 min.
- Vask lysbildene to ganger wed en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-3-reagens på hver valgte område, rist og inkuber ved 40 ° C lysbildene i 30 min.
- Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-4-reagens på hver valgte området, rist og inkuber ved 40 ° C lysbildene i 15 min.
- Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-5-reagens på hver valgte område, rist og inkuber skinnene ved RT i 30 min.
- Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min. Pipetter 10 mL av Amplification-6-reagens på hver valgte området, rist og inkuber skinnene ved RT i 15 min. Vask objektglassene to ganger med en vaskebuffer i 2 min.
3. Signal Detection
- Pipetter 10 mL av Røde reagens til hver valgte området (Merk at reagensen er en blanding av Red-B og Red-A på en 1:60 ratio og bør brukes immediately). Plasser raset i fuktighet skuffen på den horisontale shaker ved RT og rist forsiktig på lav hastighet i 10 min.
- Vask objektglassene to ganger med (DDH 2 O) i 10 min. Tørk lysbilder ved 60 ºC i ovnen i 15 min. Plasser lysbildene i xylen under avtrekkshette i 5 min. Pipetter 20 mL xylen-basert montering media på hver valgte området og dekk med et dekkglass.
4. Image Capture
- Ta digitale mikrofotografier av utvalgte områder (f.eks hypothalamus, Figur 1 og 3) med en forstørrelse på 4 × og 20 × objektiv. Lagre bildefilen.
5. Bilde Partikkelanalyse
- Dra og slipp bildefilen inn i hoved ImageJ vinduet. Gå til menylinjen og velg 'Bilde', ved å velge 'Type' fra rullegardinmenyen, og velg "8-bit".
- Velg "Adjust", velg deretter "Threshold "for å åpne dialogboksen. Juster nedre bar verdi i dialogboksen, slik at uønsket bakgrunnen er fjernet. Gå til menylinjen og velg "Analyser", velg deretter "Analyser Partikler" for å åpne en ny dialogboks.
- Satt partikkelstørrelse på 10, neste velge 'Vis skisserer' og velg 'Vis resultater "og" oppsummere "bokser. Til slutt, klikk "OK" for å vise partikkel data i dialogboksene.
6. regneark Beregning
- Skriv inn data i Excel-arket og gjennomsnittlig antall partikler i SAL gruppen som en baseline. Beregn prosentnivået av hver seksjon og foreta en graf tilsvarende (figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke oligonukleotid RNA-prober (<25 nt), kan hybridisering bli oppdaget som røde prikker i hypothalamus celler fremstilt fra paraformaldehydet-prefiks og ferske frosne hjerner. De htr2a mRNA molekyler er til stede i noen celler (angitt med heltrukne piler), men ikke andre (åpne piler). Vi observerte at det ikke er noen forskjell mellom paraformaldehydet-prefikset og de ferske frosne vev (figur 1). En vellykket hybridisering kan evalueres først med det blotte øye (figur 2). Vi fant at det valgte området (markert med sirkler) hybridisert med dapB probe ikke viser et synlig signal for det blotte øye (figurene 2A-B). I motsetning til dette området hybridisert med proben ppiB viste signaler homogent fordelt i hele regionen undersøkt (figurene 2C-D). Mens i htr2a testen, signaler er til stede i visse kjerner (angitt ved piler;
Som konklusjon, våre resultater viste at ved hjelp av oligonukleotidprober er bestemt, og egnet for prefiks hjernevev. Videre protokoll prosedyrer, inkludert in situ hybridisering, signal deteksjon og dataanalyse kan være ferdig i løpet av to dager.
Figur 1. Sammenligning av de ferske og innledes frosne vev. Prosedyrer som brukes for Dypfryst hjerner har blitt beskrevet andre steder 5. Legg merke til at de ferske frosne seksjonene ble kuttet på 20 mikrometer tykkelse mens den faste frosne snitt på 10 mikrometer. Oligonukleotidproben var htr2a som hybridiserer til 5-HT2A-reseptoren mRNA i hypotalamus. Heltrukne piler angir celler som inneholder htr2a mRNA molekyler i friskt frosset (A) og innledes vev (B). Åpne piler, ingen htr2a mRNA molekyler oppdaget. Bar: 20 mikrometer. Bruke NIHImageJ analyse, htr2a ble regnet. Antall htr2a teller er ikke forskjellig mellom de friske og paraformaldehyd-prefiks frosne vev (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. En naken perspektiv over hybridiseringssignaler. Vev ble prefiks paraformaldehyde dypt bedøvede rotter tidligere behandlet med saltvann (SAL) og 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). De hvite-prikkede linjer angir regionen hybridiserte med oligonukleotid-prober. Den røde fargen betegner mRNA-signaler for det blotte øye. Ingen rødt signal observert ved bruk av dapB probe hybridisert til deler av SAL-forbehandlede (A) eller MDMa-forbehandlede rotter (B ppiB probe (CD). Interessant, røde signaler som produseres av den htr2a sonden er i noen områder (EF; Piler indikerer hypothalamus-området). Stereotaksisk Opplysninger: -3,50 ~ -3,80 forhold til bregma. 3V, tredje ventrikkel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. En lett mikroskopisk syn på hybridiseringssignaler. Vev ble prefiks paraformaldehyde dypt bedøvede rotter tidligere behandlet med saltvann (SAL) og 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA). Oligonukleotidprober er dapB (AB), ppiB (CD) og htr2a (EF). Hybridiseringssignaler er identifisert som røde prikker ved hjelp objektivforstørrelsen krefter som spenner fra 4 × (barer: 200 mikrometer). 20 × (innfelt microphotographs) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt på hypothalamus htr2a uttrykk hos rotter som tidligere er behandlet med MDMA. Prøvene ble analysert i duplikater og gjentatt tre ganger. Data er uttrykt som en gjennomsnittlig prosent ± sem av SAL gruppen (totalt 8 rotter anvendt i denne studien). * P <0,05 vs. SAL gruppen bruker Student t-test.
| Fersk | Paraformaldehyde-prefiks en | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Target probe (htr2a) | √ | √ | √ | |
| Positive probe (ppiB) | - | √ | √ | |
| Negativ probe (dapB) | - | √ | √ | |
√, angir gruppen undersøkt med oligonukleotidprobe i denne studien.
-, Ikke undersøkt;
a, inneholder hver gruppe 4 forskjellige dyr;
b, gruppen forbehandlet intraperitonealt med fysisk saltvann (SAL; 0,9% NaCl);
c, forbehandlet intraperitonealt med 10 mg / kg MDMA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH stipend (R15DA029863), Florida Atlantic University lavere forskningsstipend (M30014) og Ross University School of Veterinary Medicine forskningsstipend. Vi vil gjerne takke National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) for å gi (±) 3,4-methylenedioxymethamphetamine (± MDMA) for dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).
