Protocol
Procedimentos de uso de animais descritos abaixo foram aprovados pelo o cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Ross e Florida Atlantic University. Embora são necessárias técnicas e luvas estéreis, o ambiente livre de RNase não é necessário ao usar este protocolo.
1. Preparação
- Preparação de tecidos e de seccionamento
- Atribuir ratos aleatoriamente em três grupos: fresca / salina (SAL; 0,9% NaCl), prefixados / SAL e prefixados / 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA; veja detalhes na Tabela 1).
- Administrar três doses de 1 ml / kg de Sal e de 10 mg / kg por via intraperitoneal MDMA, respectivamente, para os grupos SAL e MDMA no intervalo de 2 h. Permitir que os animais sobrevivem ao tratamento durante 6 dias.
- No dia 7, administrar 100 mg / kg de cetamina em combinação de 5 mg / kg de xilazina intraperitonealmente aos ratos para uma anestesia profunda (ou seja, perda de piscar da córnea e TAil beliscar reflexos).
- Para o grupo fresco / SAL, decapitar ratos e remover rapidamente o cérebro para o teste de cérebro fresco (ver detalhes na referência 5).
- Para os grupos / MDMA prefixados / SAL e prefixadas, faça um corte ao longo do esterno de cerca de 10 -12 cm e, em seguida, expor a extremidade do esterno.
- Segurar o final do esterno com uma pinça hemostática e cortar o diafragma lateralmente em ambos os lados com uma tesoura afiada e em seguida cortado para cima entre as nervuras e paralelo para os pulmões.
- Com uma mão, segure a ponta ventral do coração com pequenas pinças. Com a outra mão, perfurar o ventrículo esquerdo com 18 G agulha de seringa (observe o lado do adaptador da agulha está conectada com uma mangueira de silicone em forma de Y para o Sal e paraformaldeído recipientes geladas e bombas peristálticas, ver a referência 9).
- Ligar a bomba de SAL ao nível médio do caudal (~ 5 ml / min) e punção do átrio direito com a pinça para permitir o escape de retorno circlação. Manter SAL perfusão durante 30 minutos.
- Ligar a bomba de paraformaldeído a nível médio e permitir que o paraformaldeído a 4% em gelo para perfundir o animal durante 30 min.
- Remover instrumento perfusão e decapitar o animal. Adicione uma póstero corte através da linha média do crânio, e, em seguida, a aba do crânio para expor a cavidade do crânio 10.
- Remover o cérebro com uma espátula a partir da cavidade do crânio e colocar o cérebro em um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de paraformaldeído a 4%. Mantenha o cérebro dentro do tubo contendo paraformaldeído a 4 ºC geladeira por 24 horas.
- Mover o cérebro para um tubo de centrífuga de 50 ml contendo 25 ml de solução de sacarose a 30% a 4 ° C durante 3 dias. Finalmente, armazenar o cérebro dentro de sacos de plástico a -80 ° C até utilização.
- Monte o cérebro em um mandril com a mídia de incorporação e congelar os meios de comunicação incorporação contendo cérebro em um criostato à temperatura de -26 ºC. Corte o congelou frescoN cérebro em 20 um secções do cérebro e paraformaldeído prefixado em secções de 10 um. Transfira a seção para uma lâmina de microscópio RT tocando o slide para a seção.
- Ar seco à TA durante 4 h. Armazenar as lâminas secção de um saco estanque selado a -80 ° C até utilização.
- Desidratação
- Tome slides da freezer -80 ° C e atribuir seções em um dos três testes: HT2A, PPIB (controle positivo) ou dapB (controle negativo); marca e seções de etiqueta com uma caneta esferográfica (não use um lápis). Submerge lâminas em 100% de álcool à temperatura ambiente durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min numa hotte.
- Pré-tratamento
- Pipetar 20 ul de reagente de Pré-tratamento (1-inactivação de fosfatase alcalina) para as secções em lâminas. Colocar as lâminas em um trilho da cremalheira num tabuleiro de humidade (note que o tabuleiro é coberto com uma tampa para manter uma elevada humidade para evitar a evaporação a partir da reacção solution).
- Agite suavemente a bandeja de umidade num agitador horizontal a uma velocidade baixa para 10 min. Lavar as lâminas duas vezes com água bidestilada (ddH2O) durante 2 min. Mergulhe o slide em uma proveta de 200 ml contendo 150 ml da pré-tratamento-2 reagente (quebra das ligações cruzadas induzidas pela fixação paraformaldeído). Ferver as lâminas por um total de 5 min a 100 ° C (restauração induzida pelo calor da estrutura de ARN 11).
- Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min. Colocar as lâminas em álcool a 100% durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 5 min no exaustor de fumos. Utilize uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo em torno da área seleccionada na secção de tecido (por exemplo, estruturas não-corticais, incluindo tálamo e hipotálamo, conforme descrito na Figura 2).
- Pipeta 10 ml de reagente pré-tratamento-3 (aumentos na penetração de sonda) para cada área selecionada, e cobrir a bandeja de umidade com a tampa. Coloque a bandeja no forno de hibridaçãoequipado com o agitador horizontal e ajustar a temperatura do forno a 40 ° C; agitar suavemente a bandeja para 30 min. Lavar as lâminas duas vezes com ddH2O durante 2 min.
2. A hibridação e amplificação
- Pipeta 10 ml de HTR2A, PPIB e dapB reagentes de sonda, respectivamente, nas áreas selecionadas. Cobrir a bandeja de humidade com a tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite no agitador horizontal definida em uma velocidade baixa. Incubar as lâminas a 40 ° C no forno durante 2 horas.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul do reagente de amplificação-1 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-2 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min.
- Lavar as lâminas duas vezes wom um tampão de lavagem por 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-3 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 30 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 4-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas a 40 ° C durante 15 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul da amplificação 5-reagente sobre cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 30 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min. Pipetar 10 ul de reagente de amplificação-6 em cada zona seleccionada, agitar e incubar as lâminas à temperatura ambiente durante 15 min. Lavar as lâminas duas vezes com um tampão de lavagem durante 2 min.
3. Detecção de Sinais
- Pipetar 10 ul do reagente Vermelho para cada área seleccionada (Note-se que o reagente é uma mistura de vermelho e vermelho-B-A com uma proporção de 1:60 e deve ser utilizado immediately). Coloque o slide na bandeja de umidade no agitador horizontal à TA e agitar suavemente a uma velocidade baixa para 10 min.
- Lavar as lâminas duas vezes com (ddH2O), durante 10 min. Seque as lâminas a 60 ºC no forno por 15 min. Colocar as lâminas em xileno sob o exaustor durante 5 min. Pipetar 20 ul de meio de montagem à base de xileno em cada área seleccionada e cobrir com uma lamela.
Captura 4. Imagem
- Tome microfotografias digitais das áreas selecionadas (por exemplo, o hipotálamo, Figuras 1 e 3) com uma ampliação de 4 × e 20 × lentes objetivas. Salve o arquivo de imagem.
Análise de Partículas 5. Imagem
- Arraste e solte o arquivo de imagem para a janela ImageJ principal. Vá para a barra de menu e selecione 'Imagem', próxima escolha 'Tipo' a partir do menu drop-down e selecione '8-bit'.
- Selecione 'Ajustar', em seguida, selecione 'Threshold 'para abrir a caixa de diálogo. Ajuste o valor da barra inferior da caixa de diálogo para que o fundo não desejado é removido. Vá para a barra de menu e selecione "Analisar", em seguida, selecione "Analisar Partículas 'para abrir uma segunda caixa de diálogo.
- Defina o tamanho de partícula de 10, ao lado selecione "Show apresenta 'e selecione' Mostrar resultados" e "caixas Resumir". Por fim, clique em 'OK' para ver os dados de partículas nas caixas de diálogo.
6. Planilha de Cálculo
- Entre os dados para a folha de Excel e calcular a média dos números de partículas no grupo SAL como uma linha de base. Calcula-se a percentagem do nível de cada secção e fazer um gráfico em conformidade (Figura 4).
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Representative Results
Utilizando as sondas de ARN de oligonucleótidos (<25 NT), a hibridação pode ser detectada como pontos vermelhos em células hipotalâmicas preparados a partir dos cérebros congelados prefixado-paraformaldeído e frescas. As moléculas de mRNA HTR2A estão presentes em algumas células (indicadas pelas setas sólidas), mas não outros (setas abertas). Observou-se que não existe qualquer diferença entre o os tecidos congelados frescos-prefixo e paraformaldeído (Figura 1). Uma hibridização bem sucedida pode ser avaliada primeiro a olho nu (Figura 2). Descobrimos que a área seleccionada (marcados com círculos) hibridadas com a sonda dapB não mostram sinal visível de um a olho nu (Figuras 2A-B). Em contraste, a área hibridado com a sonda PPIB mostrou sinais homogeneamente distribuídas por toda a região examinada (Figuras 2C-D). Enquanto no teste HTR2A, os sinais estão presentes em certos núcleos (indicado pelas setas;
Em conclusão, nossos resultados mostraram que o uso de oligosondas nucleotídicas é específico, e adequado para o tecido cerebral prefixado. Além disso, os procedimentos de protocolo, incluindo a hibridação in situ, análise de dados e detecção de sinal pode ser concluída dentro de dois dias.
Figura 1. Comparação dos tecidos congelados frescos e prefixados. Os procedimentos utilizados para cérebros congelados frescos foram descritos em outro cinco. Note-se que as secções congeladas frescas foram cortadas a 20 um de espessura, enquanto a secções congeladas fixadas a 10 uM. A sonda oligonucleotídica foi HTR2A que hibrida o ARNm do receptor 5-HT 2A, no hipotálamo. Setas sólidas indicam células contendo moléculas de mRNA HTR2A no fresco congelado (A) e tecidos pré-fixados (B). Setas abertas, não há moléculas de mRNA HTR2A detectado. Barra: 20 um. Usando NIHAnálise ImageJ, HTR2A foi contado. Números de contagem HTR2A não são diferentes entre os tecidos congelados frescos e prefixado-paraformaldeído (C). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Uma visão do olho nu de sinais de hibridação. Os tecidos foram prefixados com paraformaldeído em ratos profundamente anestesiados previamente tratados com solução salina (SAL) e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA). As linhas brancas indicam a tracejado-região hibridada com as sondas de oligonucleótidos. A cor vermelha indica sinais de mRNA a olho nu. Nenhum sinal vermelho é observada durante o uso da sonda hibridizada para secções dapB de SAL-pré-tratados (A) ou ratos pré-tratados com MDMA (B PPIB (CD). Curiosamente, os sinais vermelhos produzidos pela sonda HTR2A são apenas algumas regiões (EF; As setas indicam a área do hipotálamo). Coordenadas Estereotáxicas: -3,50 -3,80 ~ em relação ao bregma. 3V, o terceiro ventrículo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Uma visão microscópica luz de sinais de hibridação. Os tecidos foram prefixados com paraformaldeído em ratos profundamente anestesiados previamente tratados com solução salina (SAL) e 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA). Sondas de oligonucleotídeos são dapB (AB), ppiB (CD) e HTR2A (EF). Sinais de hibridação são identificados como pontos vermelhos usando poderes de ampliação objetivas variando de 4 × (Bares: 200 m). 20 × (microfotografias inserir) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito sobre a expressão HTR2A hipotalâmico em ratos previamente tratados com MDMA. As amostras foram ensaiadas em duplicado e repetidas três vezes. Os dados são expressos como uma percentagem média ± epm do grupo SAL (um total de 8 ratos utilizados neste estudo). * P <0,05 vs. o grupo SAL pelo teste t de Student.
| Fresco | Prefixado-paraformaldeído um | |||
| SAL b | SAL b | MDMA c | ||
| Sonda alvo (HTR2A) | √ | √ | √ | |
| Sonda positivo (PPIB) | - | √ | √ | |
| Sonda negativa (dapB) | - | √ | √ | |
√, indica o grupo examinado com uma sonda de oligonucleótidos no presente estudo.
-, Não examinou;
um, cada grupo contém 4 animais diferentes;
b, o grupo de pré-tratados por via intraperitoneal com solução salina física (SAL; 0,9% de NaCl);
C, pré-tratados intraperitonealmente com 10 mg / kg de MDMA.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pela concessão NIH (R15DA029863), a concessão Florida Atlantic University iniciação científica (M30014) e da Escola de Medicina Veterinária bolsa de investigação da Universidade Ross. Gostaríamos de agradecer ao Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (Rockville, MD) para fornecer (±) 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
| RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
| Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
| Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
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