Protocol
Процедуры для животных, описанные ниже, были одобрены уходу и использованию комитета институциональной животных (IACUC) в Росс школы Университета ветеринарной медицины и Florida Atlantic University мимо. Несмотря на то, стерильные методы и перчатки требуется, РНКазы среда не является необходимым при использовании этого протокола.
1. Подготовка
- Подготовка тканей и секционирования
- Связать крыс случайным образом на три группы: свежий / физиологического раствора (SAL; 0,9% NaCl), префикс / SAL и префиксом / 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА; подробнее см таблицу 1).
- Администрирование три дозы 1 мл / кг SAL и 10 мг / кг внутрибрюшинно МДМА, соответственно, к группам SAL и МДМА в 2 интервала ч. Разрешить животных, чтобы выжить лечение в течение 6 дней.
- На 7-й день, управлять 100 мг / кг кетамина в комбинации 5 мг / кг ксилазина внутрибрюшинно крысам для глубокой анестезии в (то есть, потеря роговицы мигают и таиль щепотку рефлексы).
- Для свежего / SAL группы, быстро обезглавить крыс и удалить мозг для испытания свежего мозга (подробности см в ссылке 5).
- Для префиксом / SAL и префиксом / МДМА групп, сделать разрез вдоль грудины около 10 -12 см, а затем подвергать конец грудины.
- Удерживая конец грудины с кровоостанавливающего и сократить диафрагму в поперечном направлении с обеих сторон острыми ножницами, а затем разрезать вверх по ребрам и параллельно легких.
- С одной стороны, держать брюшную кончик сердце с маленькими щипцами. С другой стороны, пробить в левый желудочек с 18 G иглой шприца (обратите внимание на адаптер сторону иглы, связанного с Y-образной силиконового шланга к ледяной SAL и параформальдегидом контейнеров и перистальтических насосов; см ссылка 9).
- Включите SAL насоса на среднем уровне расхода (~ 5 мл / мин) и проколоть правое предсердие с пинцетом, чтобы позволить утечку обратного CIRCавляет. Поддержание SAL перфузии в течение 30 мин.
- Включите параформальдегида насоса на среднем уровне и позволяет ледяной 4% параформальдегида заливать животное в течение 30 мин.
- Удалить перфузии инструмент и обезглавить животное. Сделайте заднепередний прорезать средней линии черепа, а затем махать череп, чтобы выставить череп полость 10.
- Удалить мозга с помощью шпателя из полости черепа и поместить в мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 4% параформальдегида. Держать мозг в пределах параформальдегида содержащие трубки на 4 ºC холодильником в течение 24 ч.
- Перемещение мозг в 50 мл центрифужную пробирку, содержащую 25 мл 30% раствора сахарозы при 4 ° С в течение 3 дней. Наконец, хранить мозг внутри пластиковых пакетов при -80 ° С до использования.
- Установите мозг на патроне при встраивании СМИ и заморозить вложения средств массовой информации, содержащие мозг в криостат при температуре -26 ° C. Разрежьте свежий замерп мозг в 20 мкм разделы и параформальдегиде префиксом мозг в 10 мкм разделов. Перенести раздел на предметное стекло микроскопа РТ, касаясь слайда в разделе.
- Воздух сухой при комнатной температуре в течение 4 часов. Храните раздел слайдов в плотно закрытой сумке при -80 ° С до использования.
- Обезвоживание
- Возьмите слайды из -80 ° C морозильника и назначить разделы в одну из трех испытаний: НТ2А, ppiB (положительный контроль) или dapB (отрицательный контроль); марка и секции этикетка с шариковой ручкой (не используйте карандаш). Submerge слайдов в 100% -ном спирте при комнатной температуре в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу.
- Предварительная обработка
- Внесите 20 мкл-1 Предварительная реагента (инактивация щелочной фосфатазы) в секциях на слайдах. Поместите слайды на направляющей стойки в лотке влаги (обратите внимание, что лоток закрывают крышкой, чтобы поддерживать высокую влажность для предотвращения испарения из реакционной SOLUTIOп).
- Осторожно встряхнуть лоток влаги на горизонтальном шейкере при низкой скорости в течение 10 мин. Вымойте слайды дважды бидистиллированной воды (DDH 2 O) в течение 2 мин. Погрузите слайд в 200 мл стакан, содержащий 150 мл Предварительная-2 реагента (преломлении поперечных связей, вызванных фиксацией параформальдегидом). Отварить слайды в общей сложности 5 мин при 100 ° С (тепловой индуцированных восстановление структуры РНК 11).
- Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин. Поместите слайды в 100% -ном спирте в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 5 мин в вытяжном шкафу. Используйте гидрофобный ручку, чтобы нарисовать круг вокруг выбранной области в разделе ткани (например, не-корковых структур, в том числе таламуса и гипоталамуса, как описанные в Рисунке 2).
- Внесите 10 мкл Предварительная-3 реагента (увеличивается в проникновения зонда) в каждой выбранной области, и покрыть лоток влаги с крышкой. Поместите лоток в гибридизации духовкеоснащен горизонтальной шейкере и установите температуру духовки на 40 ° С; встряхните поднос в течение 30 мин. Вымойте слайды дважды DDh 2 O в течение 2 мин.
2. Гибридизация и усиления
- Внесите 10 мкл HTR2A, ppiB и dapB зонда реагентов, соответственно, на отдельных областях. Накройте лоток влаги с крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Слегка встряхните на горизонтальной шейкере при низкой скорости. Инкубируйте слайды на 40 ºC в духовке в течение 2 часов.
- Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-1 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
- Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-2 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
- Вымойте слайды в два раза WIth промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-3 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 30 мин.
- Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-4 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при температуре 40ºC в течение 15 мин.
- Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-5 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин. Пипетка 10 мкл амплификации-6 реагента на каждой выбранной области, встряхнуть и инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 15 мин. Вымойте слайды в два раза промывочным буфером в течение 2 мин.
3. Обнаружение сигналов
- Пипетка 10 мкл Красного реагента к каждой выбранной области (Обратите внимание, что реагент представляет собой смесь Red-B и красно-A в соотношении 1:60 и должен быть использован Immediately). Поместите слайд в лоток влаги на горизонтальном шейкере при комнатной температуре и слегка встряхнуть при низкой скорости в течение 10 мин.
- Промыть слайдов дважды (DDH 2 O) в течение 10 мин. Высушите слайды на 60 ºC в духовке в течение 15 мин. Поместите слайды в ксилоле при вытяжном шкафу в течение 5 мин. Внесите 20 мкл ксилола на основе монтажа СМИ на каждой выбранной области и накройте покровным.
4. Захват изображения
- Сделайте цифровые микрофотографии отдельных областях (например, гипоталамус, цифры 1 и 3) с увеличением 4 × 20 × и объективов. Сохраните файл изображения.
Анализ частиц 5. Изображение
- Перетащите файл изображения в главном окне ImageJ. Перейти к строке меню и выберите «образ», рядом выберите "Тип" из выпадающего меню, и выберите "8-бит".
- Выберите "Настройка", затем выберите "Threshold ", чтобы открыть диалоговое окно. Отрегулируйте значение нижнего бар в диалоговом окне, чтобы нежелательный фон удаляется. Перейти к строке меню и выберите «Анализ», затем выберите «Анализ частиц", чтобы открыть диалоговое окно второго.
- Установите размер частиц в 10, следующий выбор "Показать контуры" и выберите "Показать результаты" и "коробки" подвести итог. Наконец, нажмите кнопку "ОК", чтобы просмотреть данные частиц в диалоговых окнах.
6. Расчет таблиц
- Введите данные в лист Excel и в среднем число частиц в SAL группы в качестве базового. Рассчитать процент уровня каждой секции и сделать график соответственно (рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Использование олигонуклеотид РНК-зондов (<25 NT), гибридизация может быть обнаружен как красные точки в гипоталамических клеток, полученных из параформальдегида префиксом и свежезамороженных мозга. Молекулы мРНК HTR2A присутствуют в некоторых клетках (указанных сплошными стрелками), но не другие (открытые стрелки). Мы наблюдали, что нет никакой разницы между параформальдегида префиксом и свежие замороженные ткани (фиг.1). Успешная гибридизация может быть оценена сначала невооруженным глазом (рис 2). Мы обнаружили, что выбранная область (отмечены кружками) гибридизации с зондом dapB не показывать визуальный сигнал невооруженным глазом (2А-Б). В противоположность этому, площадь гибридизации с зондом показали ppiB сигналы равномерно распределенных по всей области исследовали (фиг 2C-D). В то время как в тесте HTR2A, сигналы присутствуют в некоторых ядер (указаны стрелками; HTR2A. Интересно, что сигналы в МДМА слайдов были относительно слабы по сравнению с SAL слайдов. Существенные детали сигналов гибридизации могут быть оценены в соответствии с микроскопической инструмента. Там нет красная точка (3А-В) в клетках гибридизации с зондом, тогда как сигналы dapB можно увидеть по всей поле микроскопа гибридизации с зондом ppiB (3С-D). В HTR2A сигналы расположены главным образом в некоторых ядрах гипоталамуса (рис 3E-F). Мы наблюдали снижение HTR2A сигналов в тканях мозга, ранее получавших системной МДМА в 10 мг / кг, которые могут быть количественно определена с использованием анализа ImageJ. Как показано на рисунке 4, мы обнаружили, снижение экспрессии HTR2A 20%.
В заключение, наши результаты показывают, что с помощью олигоНуклеотидные зонды специфичен, и подходит для префиксом мозговой ткани. Кроме того, процедуры протокола, в том числе в гибридизация, обнаружение и анализ сигналов данных может быть завершена в течение двух дней.
Рисунок 1. Сравнение свежих и замороженных тканей префиксом. Процедуры, используемые для свежезамороженных мозги были описаны в других 5. Следует отметить, что свежие замороженные срезы при 20 мкм в толщину, а фиксированной замороженных срезов в 10 мкм. Олигонуклеотид зонд HTR2A, которая гибридизуется в 2A мРНК рецептора 5-HT в гипоталамусе. Твердые стрелки указывают клетки, содержащие HTR2A молекул мРНК в свежезамороженной (а) и префикс тканей (б). Открытые стрелки, что молекулы мРНК HTR2A не обнаружено. Бар: 20 мкм. Использование NIHАнализ ImageJ, HTR2A подсчитывали. Число HTR2A пунктам не отличаются между свежими и параформальдегидом префиксом замороженных тканей (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Вид невооруженным глазом гибридизации сигналов. Ткани с префиксом параформальдегиде глубоко под наркозом крыс, получавших ранее солевым раствором (SAL) и 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА). Белые-пунктирные линии указывают на область гибридизации с олигонуклеотидными зондами. Красный цвет обозначает сигналы мРНК невооруженным глазом. Ни один красный сигнал не наблюдается при использовании зонда гибридизовали с dapB секций SAL-предварительно обработанной (а) или МДМА-предварительно крыс (Б ppiB (CD). Интересно, что красные сигналы, производимые в HTR2A зонда только в некоторых регионах (EF; Стрелки указывают гипоталамической области). Стереотаксическая координаты: -3.50 ~ -3,80 по отношению к темени. 3В, третий желудочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Свет микроскопических вид сигналов гибридизации. Ткани с префиксом параформальдегиде глубоко под наркозом крыс, получавших ранее солевым раствором (SAL) и 3,4-метилендиоксиметамфетамина (МДМА). Олигонуклеотидных зондов являются dapB (АВ), дюймB (CD) и HTR2A (EF). Гибридизации сигналы определены как красные точки, используя объективные увеличения изображения полномочий, начиная с 4 × (Бары: 200 мкм). 20 × (вставка микрофотографий) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Влияние на гипоталамо выражения HTR2A у крыс, предварительно обработанный МДМА. Образцы анализировали в двух экземплярах и повторяли три раза. Данные выражены в виде среднего процента ± SEM из группы SAL (в общей сложности 8 крыс, используемых в данном исследовании). * Р <0,05 по сравнению с. Сал-группы с помощью критерия Стьюдента.
Свежий | Параформальдегид префиксом | |||
SAL б | SAL б | МДМА с | ||
Целевая зонд (HTR2A) | √ | √ | √ | |
Положительный зонд (ppiB) | - | √ | √ | |
Отрицательный щуп (dapB) | - | √ | √ |
√, указывает на группу рассмотрен с олигонуклеотидного зонда в данном исследовании.
- Не рассматриваются;
а, каждая группа содержит 4 различных животных;
б, группа предварительно внутрибрюшинно физиологический раствор физического (SAL; 0,9% NaCl);
С предварительно внутрибрюшинно 10 мг / кг МДМА.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантом NIH (R15DA029863), бакалавриата исследовательский грант Университет Florida Atlantic University (M30014) и Росс школы Университета ветеринарной медицины исследовательского гранта. Мы хотели бы поблагодарить Национальный институт по злоупотреблению наркотиками (Rockville, MD) для обеспечения (±) 3,4-метилендиоксиметамфетамина (± МДМА) для этой работы.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNAscope Negative Control Probe-DapB | Advanced cell diagnostic, INC | 310098 | |
RNAscope Pretreat 4 | Advanced cell diagnostic, INC | 320046 | |
RNAscope 2.0 HD Reagent Kit - Red | Advanced cell diagnostic, INC | 310036 | |
RNAscope Probe - Rn-Ppib | Advanced cell diagnostic, INC | 313921 | |
Rat Htr2a | Advanced cell diagnostic, INC | 300031 | |
Cryostat | Leica | CM 1850 | |
Horizontal shaker | VWR | 88032-088 | |
Hybridization oven | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
Superfrost Plus microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Hydrophobic pen | Vector | H-4000 | |
Microscope | Olympus | Provis AX70 |
References
- Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
- Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA. Heart Lung. 43, 117-119 (2014).
- Bosch, O. G., et al. Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users. PLoS On. 8, e61234 (2013).
- Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users. J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).
- Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain. Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).
- Zoeller, R. T., Fletcher, D. L., Butnariu, O., Lowry, C. A., Moore, F. L. N-ethylmaleimide (NEM) can significantly improve in situ hybridization results using 35S-labeled oligodeoxynucleotide or complementary RNA probes. J Histochem Cytoche. 45, 1035-1041 (1997).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diag. 14, 22-29 (2012).
- Wang, H., et al. RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma. J Vis E. , (2014).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis E. , (2012).
- Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Proto. 9, 323-336 (2014).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval techniques: current perspectives. J Histochem Cytoche. 49, 931-937 (2001).
- Qin, Y., Heine, V. M., Karst, H., Lucassen, P. J., Joels, M. Gene expression patterns in rat dentate granule cells: comparison between fresh and fixed tissue. J Neurosci Method. 131, 205-211 (2003).
- Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription. Method. 52, 322-331 (2010).
- Mijnster, M. J., et al. Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat. J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).
- Li, Q., et al. Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice. J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).
- Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine. Brain Re. 1390, 10-20 (2011).
- Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action. Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).
- Reneman, L., et al. The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human. 26, 387-396 (2002).