Summary
توضح هذه المقالة بروتوكول مفصلة والمعدات اللازمة لرسم الخرائط الضوئية المزدوجة من الغشاء المحتملين (V م) وخالية شبكية داخل الهيولى العضلية (SR) كا 2+ في قلب الأرنب Langendorff perfused. وتسمح هذه الطريقة للمراقبة المباشرة والكمي لV م وريال كا 2+ ديناميكية في قلب سليمة.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان من جامعة كاليفورنيا في ديفيز، والالتزام بها دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التي نشرتها المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد
- إعداد اثنين تتركز (25X) الأسهم المعدلة حل تايرود مسبقا وتخزينها في 4 ° C: (1) ألبوم I (في ملي: كلوريد الصوديوم 3205، CaCl 2 32.5، بوكل 117.5، ناه 2 PO 4 29.75، MgCl 2 26.25) و (2) سهم II (في ملي: NaHCO 3 500).
- طازجة إعداد الحل 2 L تايرود من التشكيل التالي (مم): كلوريد الصوديوم 128.2، CaCl 2 1.3، بوكل 4.7، MgCl 2 1.05 ناه 2 PO 4 1.19، NaHCO 3 20 والجلوكوز 11.1 عن طريق الجمع بين 1840 مل من منزوع الأيونات (DI) الماء، 80 مل الأسهم I، 80 مل من الأسهم II، و 4 غرام من الجلوكوز. لا تخلط مباشرة المالية الأول والمالية II؛ إضافةم إلى 1840 مل DI لتجنب الأمطار.
- إعداد محلول المخزون من الإثارة، تقلص uncoupler blebbistatin في 10 ملغ / مل في اللامائية دى methylsulfoxide (DMSO) مقدما وتخزين الحل السهم عند 4 درجات مئوية.
- إعداد الحلول الأسهم من الأصباغ الفلورية: (1) RH237 الجهد تراعي صبغ (1 ملغ / مل في DMSO) و (2) انخفاض مؤشر تقارب الكالسيوم فلوو-5N AM (2 ملغ / مل في DMSO) وفقا لتوصيات الشركة الصانعة. استخدام الاستعدادات على الفور لتجنب التحلل مع الخسارة اللاحقة من قدرة التحميل.
- رئيس إعادة تدوير نظام نضح Langendorff مع الاوكسيجين (95٪ O 2، 5٪ CO 2) حل تايرود. ضبط تدفق O 2 / CO 2 للحفاظ على درجة الحموضة من الحل تايرود بنسبة 7.4 ± 0.05. استخدام صافي مرشح في خط النايلون المنسوجة (حجم المسام: 11 ميكرون) لتصفية باستمرار الإرواء.
- رئيس نظام نضح في RT، كما loadi اللاحقةيتم تنفيذ نانوغرام من فلوو-5N AM في RT. لفلوو-5N AM التحميل واستخدام كمية صغيرة من إعادة تدوير الإرواء (~ 150 مل). بعد صبغ التحميل واستخدام كميات أكبر من سائل الإرواء (1-2 L، انظر الشكل 1C).
- تشغيل نظام الحصول على البيانات وتحضير لأعمال الرصد المستمر لECG ونضح الضغط. إعداد نظام الضغط رصد: قم بتوصيل محول الضغط إلى خط نضح ورصد ضغط التروية مع مكبر للصوت transbridge. ضبط ضغط التروية الأساسي ل0 مم زئبق عندما لا يرد القلب إلى نظام الارواء.
- محاذاة كاميرات رسم الخرائط البصرية لضمان المواءمة المكانية بين م V وريال كا 2+ الإشارات.
- أولا، تركيز الكاميرات عن طريق وضع مسطرة أو كائن مع النص في طبق الارواء. تحويل كاميرات رسم الخرائط في وضع العرض الحي وضبط التركيز حتى النص هو هش واضحة. الحصول على صورة إطار واحد من كل كاميرا.
- غطاءهذه الصور وضبط شفافية الصورة العليا بحيث أن كلا من صور مرئية. النص في الصور يجب أن تتداخل تماما. إن لم يكن المنحازة تماما، وضبط زاوية المرآة مزدوج اللون أو موقف كل الكاميرا حتى يتم محاذاة الصورتين.
2. الحصاد، والإرواء، وصبغ تحميل الأرنب القلب
- تأمين أرنب في رادع أرنب المعتمدة. تخدير عميق عن طريق الحقن في الوريد (الوريد الأذن هامشية) من بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغ / كلغ) والهيبارين (1000 IU).
- عندما تفتقر يعرض أرنب من ردود الفعل مسبب للألم، وجعل شق الجلد خط الوسط لفضح القص والضلوع. قطع طريق القص مع صريحا معلومات سرية مقص جراحي من سيفي الشكل إلى المقبض. الحرص على عدم تلف القلب أثناء فتح القص. نشر الأضلاع لفضح القلب.
- المكوس بسرعة كامل كتلة القلب والرئة عن طريق خفض سرعة جميع السفن والنسيج الضام. Immediaوضع tely كتلة القلب والرئة إلى حل المثلج تايرود.
- تحديد الشريان الأورطي لنضح الوراء. قطع الشريان الأبهر الصاعد للتو الأقرب إلى الفروع الثلاثة للقوس الأبهر. يقني؛ يدخل القنية الشريان الأورطي إلى قنية 8 G متصلا نظام الارواء. استخدام قطعة من USP 0 خياطة الحرير لتأمين الشريان الأورطي على قنية.
- تشريح بعناية القصبة الهوائية والرئتين، والدهون النخابية من القلب. مع ملقط حادة ومقص تشريح، موقع الصمام التاجي وبعناية ضرر أو إزالة النشرة واحدة لمنع الازدحام الحل في البطين الأيسر.
- يغرق القلب في غرفة نضح-تغلف الزجاج أفقيا مع السطح الأمامي للقلب مواجهة للتصوير. تأمين قنية إلى قطعة من Sylgard مع دبابيس على شكل حرف U على الجزء السفلي من السيليكون الطبق لمنع حركة القلب أثناء رسم الخرائط (1D الشكل). إذا رغبت في ذلك، اضافة الى وجود دبوس حشرة صغيرة في قمة القلب لستاbilization.
- موقف الكهربائي (ECG) الأقطاب الكهربائية في الحمام على الجانب الأيمن والأيسر من القلب. يغرق تماما الأقطاب في الحمام والتأكد من أنهم ليسوا على اتصال مع سطح القلب لتوفير ECG-أجرت حجم مماثل لتكوين I الرصاص. التحقق من الرصاص العادي I ECG التشكل. ضبط تدفق (25-35 مل / دقيقة) للتأكد من أن ضغط الأبهر هو الحفاظ على 60-70 مم زئبق.
- إطفاء الأنوار الغرفة وإضافة 0،3-0،6 مل من محلول المخزون blebbistatin (الخطوة 1.2) إلى الإرواء (تركيز النهائي 10-20 ميكرومتر).
- إطفاء الأنوار الغرفة لتجنب تعطيل ضوئي من blebbistatin. إذا لزم الأمر، الضوء صغير أو كشافات يمكن أن تستخدم لتوفير الإضاءة المهمة.
ملاحظة: Blebbistatin هو الميوسين أتباز المانع وuncoupler الإثارة، تقلص. لأن فلوو-5N التحميل يتطلب طويلة (60 دقيقة) RT (انخفاض حرارة الجسم) شروط (انظر الخطوات 2،8 حتي 2،10)، قد يكون خطر إنتاج الطاقة القلبية. عشرerefore، إضافة blebbistatin في الإرواء قبل أن تصبغ التحميل قد يقلل من الطلب على الطاقة 16 و القضاء على الحركة الفنية خلال التسجيلات البصرية اللاحقة 17.
- إطفاء الأنوار الغرفة لتجنب تعطيل ضوئي من blebbistatin. إذا لزم الأمر، الضوء صغير أو كشافات يمكن أن تستخدم لتوفير الإضاءة المهمة.
- عندما توقف انقباض القلب (10-15 دقيقة، والتحقق منها على تسجيل ضغط الأبهر)، والتحول إلى نظام إعادة تدوير نضح صغيرة الحجم (راجع الخطوة 1.4.1).
- إعداد وتحميل فلوو-5N AM تحميل الحل: إضافة 0.25 مل من فلوو-5N AM الأسهم الحل (الخطوة 1.3) إلى 0.25 مل دافئ 20٪ F127 Pluronic. إضافة 0.5 مل من محلول دافئ تايرود إلى الخليط، وتخلط جيدا، وإضافة إلى نظام إعادة تدوير نضح صغيرة الحجم.
- مراقبة مستمرة ضغط التروية وECG وضبط تدفق إذا لزم الأمر. صبغ التحميل يستغرق حوالي 1 ساعة على RT. 45 دقيقة بعد تحميل بدأت، بدوره على حمام ماء المتداولة لبدء ارتفاع درجة حرارة نظام نضح وسائل الإرواء إلى 37 درجة مئوية.
- بعد 60 دقيقة من فلوو-5N AM التحميل، مفاتتك نضح في وحدة تخزين النظام إعادة تدوير نضح أكبر (راجع الخطوة 1.4).
- تمييع 50 ميكرولتر من الجهد حساسة محلول المخزون صبغ RH237 (الخطوة 1.3) في 1 مل من محلول دافئ تايرود وإضافة ببطء (أكثر من ~ 5 دقائق) إلى الأقرب ميناء حقن للقنية.
3. الخرائط الضوئية
- خلال اللحظات الأخيرة من صبغ تحميل، ضع قلب وتركيز الكاميرات رسم الخرائط الضوئية لضمان الحقل المناسب النظر للتجربة.
- إذا رغبت في ذلك، ضع سرعة الكهربائي بين القطبين على سطح النخابية من القلب للسرعة.
- وضع البلاستيك أو الزجاج غطاء الانزلاق على سطح غرفة نضح للحد من حركة القطع الأثرية على سطح السائل التي قد تكون موجودة بسبب إعادة تدوير سائل الإرواء.
ملاحظة: كبديل لزلة غطاء، واستخدام البلاستيك 50 ملم بيتري غطاء طبق نظيف. - تركيز أدلة الخفيفة لإلقاء الضوء بشكل موحد على سطح القلب مع البريدضوء xcitation. استخدام الضوء الأزرق الصمام الثنائي الباعث لل(LED) مصادر الضوء وكذلك تصفية ضوء مع 475-495 نانومتر مرشح ممر الموجة (الشكل 1A).
- جمع مضان المنبعثة مع macroscope واثنين تكميلية المعادن أكسيد أشباه الموصلات (CMOS) كاميرات رسم الخرائط البصرية. تقسيم الضوء المنبعث مع مرآة مزدوج اللون في 545 نانومتر.
- تمرير طويل تصفية أطول الطول الموجي شاردة، التي تحتوي على V متر إشارة، في 700 نانومتر. الفرقة تمرير تصفية أقصر طول موجي شاردة، التي تحتوي على الكالسيوم ريال 2+ إشارة، 502-534 نانومتر (الشكل 1A). ضبط تردد من الحصول على البيانات الضوئية ل0،5-1 كيلو هرتز.
- لكل تسجيل البصرية، والشروع في أول بروتوكول سرعة المطلوبة، بدوره على ضوء الإثارة، وجمع 1-4 ثانية من البيانات. إذا رغبت في ذلك، وتزامن اكتساب بروتوكولات سرعة والبيانات.
ملاحظة: ليس من الممكن لإعادة تحميل وفلوو-5N AM، وبالتالي فإن نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) سوف decreaحد ذاتها في كافة مراحل التجربة بسبب صبغ تسرب من SR. لحد بروتوكول تجريبي ل1-2 ساعة لضمان القيم SNR عالية. - بعد التجربة، وغسل نظام نضح في سلسلة من المياه DI و 70٪ كاشف الكحول، ومرة أخرى بالماء DI.
- تصفية كل مجموعة بيانات مع فلتر التمويه المكاني (دائرة نصف قطرها 3 بكسل) باستخدام حزم البرامج المتاحة تجاريا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إذا لزم الأمر، محاذاة مكانيا م V ومجموعات البيانات الكالسيوم 2+ ريال. كما في الخطوة 1.6، تراكب الصور من كل كاميرا والتحقق من أن الهياكل التشريحية للقلب (أي.، الأوعية الدموية التاجية، وحواف من الأذينين أو البطينين) أو العناصر الأخرى في مجال الرؤية (أي، قنية، سرعة القطب) بالضبط التداخل. إن لم يكن، والمحاذاة المكانية من قواعد البيانات غير الضرورية.
- تحويل أعلى صورة شفافة في يتحقق X- و ص الاتجاه حتى التداخل المحدد، مما يجعل علما أن عدد بكسليجب أن تحول صورة في كل اتجاه. مجموعة البيانات بأكملها الموافق الصورة العليا (إما V م أو الكالسيوم ريال 2+) ثم يجب أن تحول من قبل عدد محدد من بكسل في كل اتجاه لضمان المواءمة الدقيقة بين م V وريال كا 2+ قواعد البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1A الرسم التخطيطي من التكوين البصري للV المزدوج م وريال كا 2+ رسم الخرائط. مع هذا الإعداد، هناك فصل الطيفي الكامل للمتر V وريال كا 2+ إشارات (الشكل 1B). ويوضح شكل توضيحي لنظام نضح المزدوج حلقة استخدامها لفلوو-5N صبغ التحميل في الشكل 1C. ويبين الشكل 1D اتجاه أفقي للقلب في طبق الارواء. وتظهر V التمثيلي م وريال كا 2+ آثار البصرية خلال سرعة مستمرة من مواقع مختلفة على سطح النخابية القلب في الشكل 2A. مجال بصري النظر مع هذا الإعداد هو 31 ملم ويرد × 31 مم والتوجه للقلب داخل مجال الرؤية في الشكل 2B. وتظهر الخرائط التنشيط أيضا في الشكل 2B، وشيدت عن طريق تحديد الوقت تفعيل كل بكسل وصlotting هذه القيمة على الخريطة متساوي الزمن (لاحظ تأخير نموذجية من ~ 8-10 مللي ثانية بين م V وريال كا 2+ تفعيل الخرائط). الأهم من ذلك، إمكانات العمل الرئيسية (ا ف ب) خصائص مثل AP الوقت الارتفاع (من 10٪ إلى 90٪ من السعة [Trise])، وAP مدة 80٪ عودة الاستقطاب (APD 80)، لا تختلف إحصائيا بين قلوب محملة RH237 وفلوو-5N مقارنة مع أولئك محملة RH237 وRhod 2 (Trise: 14.9 ميللي ثانية ± 1.9 ميللي ثانية مقابل 14.2 ميللي ثانية ± 1.2 ميللي ثانية وAPD 80: 155.3 مللي ثانية ± 5.8 ميللي ثانية مقابل 156.9 مللي ثانية ± 5.7 ميللي ثانية لفلوو-5N و Rhod-2 على التوالي؛ P> 0.05 لكلا؛ ن = 8 / مجموعة)، مما يدل على تأثير ضئيل من فلوو-5N أو صبغ التحميل على AP الشكل 2C يدل على القدرة على مراقبة وقياس التغيرات النسبية في الانبساطي الكالسيوم ريال 2+ تحميل والانقباضي ريال كا الإفراج 2+ سعة على مختلف أطوال دورة سرعة. التغيرات النسبية فقط في هذه المعايير يمكن تشوantified والمعايرة كما المطلقة ([كا 2+] SR) للإشارة في قلب سليمة غير ممكن.
هذا النهج هو مفيد بشكل خاص لوصف وقياس المرضية ريال كا 2+ المناولة، كما هو مبين في الشكل (3). وبعد التطبيق للβ الأدرينالية مستقبلات ناهض ايزوبروتيرينول (100 نيوتن متر)، واضحة الانبساطي الكالسيوم 2+ تسرب من SR لوحظ ( السهام الحمراء، الشكل 3A). إذا تسرب كبير بما فيه الكفاية، بوساطة كا 2+ قد يحدث النشاط المشغلة (الشكل 3B).
الشكل 1. إعداد النظام لالمزدوج رسم خرائط V م والكالسيوم ريال 2+. (A) رسم تخطيطي لإعداد البصرية، بما في ذلك المرشحات اللازمة ومرآة مزدوج اللون لفصل الطيفي المناسبة. (B) التصوير من قلوب محملة إما فلوو-5N فقط (ط) أو RH237 فقط (ب) يشير الفصل الطيفي كاملة من V م والكالسيوم 2+ إشارات الفلورسنت ريال. مثال: الإثارة، إم: الانبعاثات (C) رسم تخطيطي لنظام نضح المزدوج حلقة لنضح العادي وفلوو-5N صبغ تحميل (D) صورة من مقنى القلب وتخطيط القلب الأقطاب الكهربائية في طبق التروية. لوحات A و B تتكرر بإذن من وانغ وآخرون. 15. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. V م والكالسيوم ريال 2+ آثار البصرية خلال يخطو المستمر وغير المستمر. (A) V الممثل م وريال كا 2+ البصريل يتتبع خلال سرعة المستمرة في طول الدورة 300 مللي ثانية. يتم إظهار إشارات من المواقع الفردية المشار إليها في (B). لاحظ تأخر ~ 8-10 مللي ثانية بين م V وريال كا 2+ مرات التنشيط كما هو الحال بالنسبة للالعادي اقتران الإثارة، تقلص. (B) صورة قلب في مجال رسم الخرائط نظر (رأس السهم الأبيض يشير إلى سرعة الأقطاب) وخرائط تفعيل V م والكالسيوم ريال 2+ (C) ريال كا 2+ آثار البصرية مما يدل على تغييرات في الانبساطي ريال كا 2+ الحمل واتساع إطلاق الكالسيوم ريال 2+ أعقاب التغيرات المفاجئة في معدل سرعة. كل آثار تبدأ مع سرعة في CL = 300 مللي ثانية. معدل سرعة وثم تغير فجأة إلى CL = 500 مللي ثانية (ط)، CL = 400 مللي ثانية (ب)، أو CL = 250 مللي ثانية (ج). عندما يتم البدء CLS أطول (الأول - الثاني)، تحدث ريال إطلاق أكبر الكالسيوم 2+ أولا (بسبب فترة أطول الانبساطي واسترداد RyRs) والكالسيوم ريال الانبساطي2+ الحمل يقلل قليلا لللدولة ثابتة جديدة (خط متقطع أفقي). عندما يبدأ CL أقصر، ومع ذلك، تحدث أصغر ريال كا 2+ الإفراج السعة (بسبب فترة أقصر الانبساطي وغير مكتملة استرداد RyRs) والانبساطي ريال كا 2+ يزداد الحمل على الحالة المستقرة (خط متقطع الأفقي) جديد . يحدث اختلاف ريال كا 2+ الإفراج السعة أيضا في CL = 250 مللي ثانية. S: السعة الإفراج صغيرة، L: الإفراج السعة الكبيرة. (CL: طول دورة) الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. ضغط الدم الانبساطي الكالسيوم 2+ SR تسرب واللاحق آخر الحفز. (A) ECG، V م، والكالسيوم ريال 2+ آثار خلال خط الأساس (يسار) وبعدالمعاملة مع 100 نيوتن متر ايزوبروتيرينول (ISO، يمين). مع ISO، لوحظ تسرب كبير الانبساطي الكالسيوم ريال 2+ (الأسهم الحمراء). تم تطبيع الكالسيوم ريال 2+ سعة إشارة قبل وبعد ايزو. وقد ذاب العقدة بين الصين والأذيني للسماح لسرعة CL = 300 مللي ثانية في كلتا الحالتين. (B) إذا كا ريال 2+ تسرب كبير بما فيه الكفاية، فإنه قد يطلق العنان لنشاط البؤري (المجمعات البطين سابق لأوانه، PVCS). في هذا المثال، PVCS ومقاطعة إيقاع الجيوب الأنفية طبيعية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مفاتيح النجاح فلوو-5N صبغ التحميل هي صغيرة الحجم الإعداد إعادة تدوير التروية، والذي يسمح لتركيز فلوو-5N عالية دون الحاجة إلى كميات كبيرة من الصبغة، وطول وقت التحميل (1 ساعة)، وأداء التحميل في RT. إذا تم تنفيذ التحميل في درجات الحرارة الفسيولوجية والنشاط الأنزيمي الخلوي بسرعة يشق العلامة -AM عندما يعبر صبغ غشاء الخلية، محاصرة جزيئات الصبغة في العصارة الخلوية وعدم السماح لهم بعبور الغشاء ريال. في RT، ومع ذلك، تباطأ النشاط الأنزيمي والمشقوق على كمية كافية من الصبغة يمكن أن يعبر كل من غشاء الخلية وغشاء ريال قبل علامة -AM، محاصرة الصبغة في SR.
حتى مع ظروف التحميل الأمثل، ومع ذلك، فإن سعة إشارة والتغيرات مضان كسور (ΔF / F) مع هذا النهج سيكون أقل من مع رسم الخرائط التقليدية البصري V م والكالسيوم داخل الخلايا 2+ مع الأصباغ عالية تقارب. على سبيل المثال، مع الإعداد البصرية المستخدمة هنا يتكون من الصمام ضوء الإثارة والأهداف العيانية، والمرشحات كبيرة ومرآة مزدوج اللون (5 سم × 5 سم)، وكاميرات CMOS، والتغيرات مضان كسور (ΔF / F) هي في حدود 1 - 2٪ للإشارة فلوو-5N و2-3٪ للإشارة RH237 15. ومضان كسور، بطبيعة الحال، تعتمد على تكوين معين بصري، مصدر الضوء، والكاميرات من الإعداد معين، ولكن حتى في ظل الظروف المثلى للإشارة فلوو-5N هو أقل بكثير مما هو عادة لاحظت لتسجيلات الكالسيوم داخل الخلايا 2+ مع الأصباغ عالية تقارب. على سبيل المثال، على نفس الإعداد، ΔF / F على الترتيب من 20-30٪ لRhod-2 عند استخدام الأخضر (545 نانومتر) الضوء الإثارة 18. ضوء الإثارة الأخضر هو أيضا أقرب إلى ذروة الإثارة من RH237، وبالتالي فإن ΔF / F من RH237 هو أيضا أكبر في هذه الحالة، حوالي 4-5٪. وهكذا، بالنسبة لأولئك مختبرات أداء بالفعل رسم الخرائط الضوئية المزدوجة من V م 2+، ينبغي الحرص على الاستفادة القصوى من جميع مكونات الإعداد الضوئية لضمان أقصى ΔF / F للإشارة فلوو-5N.
مع هذا النهج، يمكن محققون بالضبط ريال كا 2+ ديناميات وتأثيرها على V م بطرق غير ممكن مع النهج القائمة. على سبيل المثال، والقياسات الكمية للريال كا 2+ تسرب (كما في الشكل 3A) وثابت الوقت الدقيق من ريال كا 2+ الانتعاش (قياس تاو -A من ريال كا 2+ إطعام الفئران [SERCA] النشاط) لا يمكن أن يؤديها. استخدام النهج القائم لرسم الخرائط البصرية من الكالسيوم داخل الخلايا 2+ مع الأصباغ عالية تقارب، وهذه المقاييس قد تكون 'الملوثة' مع الكالسيوم عبر الغشاء 2+ تدفق (أي، مساهمات من نوع L-كا 2+ القنوات ونا + -Ca 2 + مبادل). وعلاوة على ذلك، عالية تقارب الكالسيوم 2+ المؤشرات لديها أبطأ بطبيعتها كوبالتالي من المتوقع إشارات فلوو-5N inetics من مؤشرات انخفاض تقارب 5، أن يقدم تقريرا عن دقة ريال كا 2+ الحركات مع الدقة العالية وأساسا أي تأخير الوقت بين التغيرات الكالسيوم 2+ الفعلية وتغييرات مماثلة في مضان.
القدرة على التحقيق في الآليات التفصيلية التي ريال كا 2+ الإفراج وامتصاص تسهم في الظواهر محدث اضطراب النظم هي ميزة أخرى لهذا النهج. على سبيل المثال، باستخدام هذه المنهجية، أبلغنا مؤخرا كيف حران من ريال كا الإفراج 2+ يساهم في ظهور الكالسيوم 2+ تناوب وأنه خلال الرجفان البطيني، كا ريال 2+ الإفراج تبقى تقريبا باستمرار الحرارية 15. كان هذا هو التقرير الأول للريال كا 2+ ديناميات خلال الرجفان ويسلط الضوء على الميزة الأساسية لتصوير الكالسيوم ريال 2+ في قلب سليمة: ظواهر متميزة مكانيا ومعقدة مثل تناوب المتنافرة مكانيا وو ibrillation يمكن دراستها. للأسف، هذا النوع من المعلومات لا يمكن استخلاصها من خلايا معزولة، حيث الرجفان غير ممكن، أو من الأساليب التي يسجل فقط من موقع واحد على القلب سليما 12.
وعلاوة على ذلك، ورسم الخرائط البصرية في وقت واحد V م وخالية الكالسيوم 2+ ريال سعودي في قلب سليمة يمكن أن توفر أداة جديدة لتقييم الكالسيوم غير طبيعي 2+ معالجة في الحالات المرضية، بما في ذلك فشل القلب. شذوذ في ريال كا 2+ التنظيم، بما في ذلك تفعيل وإنهاء ريال كا 2+ الإفراج عنهم، الانبساطي ريال كا 2+ تسرب، وريال كا 2+ امتصاص - جميع الخطوات الرئيسية في كا 2+ الدراجات وجميع يحتمل أن تتغير في قصور القلب - يمكن دراستها مباشرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن لهذه المنهجية أيضا أن تكون أداة مفيدة لتقييم آثار التدخلات العلاجية الجديدة مثل استقرار RYR 19 و SERCA تعديل 20.
ق ق = "jove_content"> وهذا النهج ليس من دون قيود، ولكن، بما في ذلك انخفاض ΔF / F على النحو المذكور أعلاه وعدم القدرة على معايرة بدقة القيم مضان على وجه الدقة [كا 2+] تركيزات ريال. للأسف، وتقلب في صبغ التحميل وغير موحدة الإثارة والخفيفة الانبعاثات بسبب السطح المنحني للقلب، والصور وتبييض وتسرب الصبغة من ريال طوال فترة التجربة تجعل من الصعب للغاية لمعايرة إشارات فلوو-5N ل بالضبط [كا 2+] SR في قلب سليمة. وأفادت السابقة في الدراسات المختبرية في المحاليل الفيزيولوجية وmyocytes permeabilized عزل هذه المعايرة وأشارت إلى أن التغييرات في فلوو-5N مضان تتناسب مع التغيرات في [كا 2+] ريال سعودي وليس من المتوقع أن مضان لتشبع في الفسيولوجية [كا 2 +] مستويات SR 11. وبالتالي، يجب أن المحققين اختيار طريقة من الكالسيوم 2+ أماهpping (المنخفض أو العالي تقارب صبغ) على أساس أهداف محددة التجريبية والتحقيقات الفسيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).
- Kong, W., Fast, V. G. The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).
- Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).
- Bers, D. M., Shannon, T. R. Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes. Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).
- Knollmann, B. C. New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle. The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).
- Chen, H., et al. Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions. The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).
- Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans. Circulation research. 94, 650-656 (2004).
- Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve. Circulation research. 93, 40-45 (2003).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).
- Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations. Circulation research. 99, 740-748 (2006).
- Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).
- Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).
- Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).
- Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).
- Marks, A. R. Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics. The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).
- Cutler, M. J., et al. Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart. Circulation. 126, 2095-2104 (2012).
