Summary
本文介绍了详细的协议和必要的跨膜电位（V M）双光学测绘和免费内部肌浆网（SR）设备钙在的Langendorff灌注兔心脏。此方法允许直接观察和第V 米量化和SR 的 Ca 2+动力学在完整心脏。
Protocol
所有涉及动物的程序由加州大学戴维斯分校的动物护理和使用委员会批准，并坚持以指南实验动物卫生的国家机构发布的管理和使用。
1.准备
- 准备提前和存储改良台氏液2浓缩（25X）的股票在4℃下：（1）股票我（在MM：氯化钠3205， 氯化钙 32.5，氯化钾117.5，氢化钠2 PO 4 29.75， 氯化镁 26.25）和（2）股票II（毫米： 碳酸氢钠 500）。
- 新鲜制备下列组合物（以mM计）的2升的台氏溶液：氯化钠128.2， 氯化钙 2 1.3，氯化钾4.7，MgCl 2的1.05，将NaH 2 PO 4 1.19， 碳酸氢钠 20，并结合1840年毫升去离子葡萄糖11.1（DI）水，80 ml的库存我，80毫升库存II和4克葡萄糖。不要直接混合股票我和股票II;添加米1840毫升DI，以避免沉淀。
- 事先准备的兴奋 - 收缩解偶联剂II型肌球蛋白的储备溶液为10毫克/毫升的无水二 - 二甲亚砜（DMSO）和存储原液于4℃。
- 制备储备溶液的荧光染料：（1）电压敏感染料RH237（1毫克/毫升在DMSO中）和（2）低亲和力钙指示剂的Fluo-5N调幅根据制造商的建议（2毫克/毫升在DMSO中）。使用准备立即以避免分解与承载能力后续损失。
- 素再循环的Langendorff灌注系统与充氧（95％O 2，5％的CO 2）台氏液。调整的 O 2 / CO 2的流动，以保持台氏溶液的pH值在7.4±0.05。使用在线的尼龙机织网过滤器（孔径：11微米），以连续地过滤灌注液。
- 素灌注系统在RT，随后的loadi荧光 - 5N上午NG是在室温下进行。为的Fluo-5N AM装载，用小体积循环灌注液（〜150毫升）中。染料加载后，用灌注液更大体积（1 - 2 L时， 参见图1C）。
- 打开数据采集系统和连续监测心电图和灌注压的准备。准备压力监测系统：压力传感器连接到灌注线路和监控一个transbridge放大器的灌注压。调整基线灌注压为0毫米汞柱时心脏没有连接到灌注系统。
- 将光盘映射摄像头，保证了V M和SR 钙离子信号之间的空间对齐。
- 首先，通过把尺子或物体与文成灌注菜集中的摄像机。打开相机映射到实时取景模式，并调整对焦，直到文本清晰和明确的。获得来自每个摄像机的单个帧的图像。
- 覆盖这些图像并调整顶部图像的透明度，使得两个图像是可见的。在图像中的文本应完全重叠。如果不完全一致，调整分色镜或每个摄像机的位置的角度，直到两个图像对齐。
2.收获，灌注和染料装兔心
- 固定兔批准的兔子限制器。通过戊巴比妥钠（50毫克/千克）和肝素（1000 IU）的静脉内注射（耳缘静脉）深麻醉。
- 当兔子显示缺乏痛觉反射，可使正中皮肤切口，显露胸骨和肋骨。切通过与钝尖从xyphoid至胸骨柄手术剪胸骨。请注意不要损伤心脏，同时打开胸骨。传播肋骨暴露的心脏。
- 迅速切除被迅速切断所有船只和结缔组织整个心脏，肺块。立即直接tely将心脏，肺块入冰冷的台氏液。
- 找到主动脉逆行灌注。切开升主动脉刚好接近主动脉弓的三个分支。导管插入主动脉到8G的插管连接到灌注系统。使用一块USP 0丝线缝合来固定到主动脉插管。
- 仔细解剖气管，肺，从心脏心外膜脂肪。用锋利的镊子和剪刀剥离，找到二尖瓣和小心损坏或删除一个小叶，以防止在左心室溶液拥塞。
- 在玻璃夹套灌注室面朝成像心脏的前表面淹没心脏水平。固定在插管到一块的Sylgard的与U形销上的菜硅底部，以防止映射（图1D）在心脏的运动。如果需要，插入一个小的昆虫针在心脏的STA顶点bilization。
- 位置心电图（ECG）中的心脏的右侧和左侧的浴电极。完全淹没在浴中的电极，并确保它们不与心脏表面接触，以提供一个体积进行心电图类似于一个导联I配置。验证正常导我的心电图形态。调节流量（25 - 35毫升/分钟），以确保在主动脉压力维持在60 - 70毫米汞柱。
- 关闭室内灯光，并添加0.3 - 的II型肌球蛋白原液（步骤1.2）灌注液（终浓度为10 - 20μM）0.6毫升
- 关掉房间的灯，以避免II型肌球蛋白的光灭活。如果需要的话，小聚光灯或头灯可以用来提供工作照明。
注：II型肌球蛋白是肌球蛋白ATP酶抑制剂和兴奋收缩解偶联剂。因为将Fluo-5N装载需要延长（60分钟）RT（低温）条件（见步骤2.8 - 2.10），心脏能源生产可能会受到损害。钍erefore，除了II型肌球蛋白进入前灌注液染负荷可以减少能源需求16，并在随后的光学记录17消除运动伪影。
- 关掉房间的灯，以避免II型肌球蛋白的光灭活。如果需要的话，小聚光灯或头灯可以用来提供工作照明。
- 当心脏收缩已经停止（10 - 15分钟，核实主动脉压力记录），切换到小容量循环灌注系统（见步骤1.4.1）。
- 准备和加载的Fluo-5N AM负载的解决方案：加入0.25g毫升的Fluo-5N AM储备液（1.3步）至0.25毫升温20％，聚醚F127。加入0.5毫升温台氏液的混合，拌匀，并添加到小批量循环灌流系统。
- 持续监测灌注压和心电图，必要时调节流量。染料加载需要大约1小时，在室温。负荷后45分钟开始，打开循环水浴开始灌注系统和灌注液升温至37℃。
- 的荧光 - 5N AM加载，SWI 60分钟后，TCH灌注到更大的卷循环灌注系统（见步骤1.4）。
- 稀释50微升电压敏感染料RH237原液（步骤1.3）在1毫升温台氏液和，缓慢加入（超过〜5分钟）到注射口靠近所述插管。
3.光学测绘
- 在染料加载的最后时刻，定位心脏和聚焦光学测绘相机，以确保视图中的相应领域的实验。
- 如果需要的话，将一个双极起搏电极对心脏起搏的心外膜表面。
- 放置灌注腔的表面上的塑料或玻璃盖玻片，以减少在液体表面可能存在由于灌注液的再循环运动伪影。
注：作为替代盖玻片，用干净的塑料50毫米培养皿盖。 - 聚焦光导板均匀地照射随e心脏的表面xcitation光。使用蓝色发光二极管（LED）光源和进一步过滤的光用一个475 - 495 nm的带通滤波器（ 图1A）。
- 收集发射的荧光与macroscope和两个互补金属氧化物半导体（CMOS）光学测绘相机。分割所发射的光与分色镜在545nm纳米。
- 长通滤波器的较长波长部分，包含在V m个信号 ，在700纳米。带通滤波器的更短的波长的部分，含有的SR 的 Ca 2+信号，从502 - 534纳米（ 图1A）。光学数据采集的频率设定为0.5 - 1千赫。
- 对于每一个光记录，首先发起所需的起搏协议，打开激发光，并收集1 - 4秒的数据。如果需要，同步起搏协议和数据采集。
注意：这是不可能重新加载的Fluo-5N调幅，因此信噪比（SNR）将会增减本身在整个由于从SR染料渗漏的试验。限制实验协议，1 - 2小时，以确保高SNR值。 - 以下实验中，用DI水冲洗灌注系统的DI水，70％的试剂酒精的序列中，并再次。
- 过滤每个数据集具有根据制造商的方案使用市售软件包空间高斯滤波器（半径为3像素）。
- 如果需要的话，在空间上对齐V M和SR 的 Ca 2+的数据集。如在步骤1.6，来自每个摄像机覆盖图像，并验证该心脏的解剖结构（即，冠状脉管，心房边缘或心室）或其他物品中的视图（即，套管，起搏电极）的字段完全重叠。如果不是，则数据集的空间对准是必要的。
- 移的顶部透明图像中的X和Y方向，直到完全重叠，从而使靠的像素的数目的音符的图像必须被移位在每个方向。对应于顶部图像（无论是V M或SR的Ca 2+）整个数据集然后必须通过的像素的数目来确定在每个方向错开，以保证在V 米和SR 的 Ca 2+数据集之间的精确对准。
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Representative Results
图1A示出了用于双重V M和SR 的 Ca 2+映射的光学配置的示意图。与此设置，有一个在V 米和SR 的 Ca 2+信号（图1B）的完整光谱分离。用于将Fluo-5N染料加载的双回路灌注系统的示意图示于图1C。图1D示出了心脏的灌注菜水平方向。代表性V M和过程中从对心脏的心外膜表面的不同位置连续起搏的SR 的 Ca 2+光学迹线示于图2A中。来看这种设置的光电场为31毫米×31日毫米和心脏的视场中的取向示于图2B。激活图也示于图2B和通过选择每个像素和p的激活时间被构造在等时地图lotting这个值（注意〜8典型的延迟-的V M和SR 钙激活图10毫秒）。重要的是，键动作电位（AP）的性质如AP上升时间（从10％到90％的幅度[素养]的），和AP的持续时间，在80％的复极化（APD 80），都没有心装入RH237之间统计学不同和荧光- 5N相比，那些装有RH237和RHOD-2（TRISE：14.9毫秒±1.9毫秒主场迎战14.2毫秒±1.2毫秒，APD 80：155.3毫秒±5.8毫秒与 156.9毫秒±5.7毫秒的Fluo-5N和RHOD-2，分别; P <0.05为; N = 8 /组），这表明荧光- 5N的影响很小或染料装载在AP上图2C展示了观察和量化舒张期SR钙相对变化的能力2+负荷和收缩SR 钙释放振幅在不同的起搏周期长度。只有在这些参数的相对变化，可曲antified，作为绝对校准在完整心脏的信号（的[Ca 2+]，SR）是不可能的。
这种方法是用于表征和量化病理SR 的 Ca 2+处理特别有用，因为示于图3。以下申请的β肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（100纳米），明确舒张的 Ca 2+泄漏从SR被观察到的（红色箭头， 图3A）。如果泄漏足够大时， 钙离子介导的触发活动可能会出现（ 图3B）。
图1.系统设置为V M双映射和SR 的 Ca 2+，光学装置，包括必要的过滤器和分色镜适当光谱分离的（A）图。（心装载有任一的Fluo-5N仅（i）或RH237的B）的成像只（ⅱ）表示在V 米完整光谱分离和SR 的 Ca 2+荧光信号。例如：激励，EM：正常灌注和荧光- 5N染料加载双循环灌注系统的发射（C）图（D）在灌注菜一个空心的心脏和心电电极的图像。图A和B Wang等15经授权转载。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. V M和SR钙在连续和非连续起搏2+光的痕迹。（A）代表V M和SR 钙离子光学在连续起搏在300毫秒的周期长度l的痕迹。的信号显示从在（B）中所指示的各个位置。注意的〜8的延迟-在V 米和SR 的 Ca 2+活化倍是典型的正常兴奋-收缩偶联之间10毫秒。 （二）鉴于映射领域内的心脏的图像（白箭头指示起搏电极）的V M和SR 钙离子。（C）SR 的 Ca 2+光的痕迹表明变化舒张期SR 钙负荷和激活图和SR 钙释放的幅度以下的起搏频率的急剧变化。所有的痕迹开始起搏在CL = 300毫秒。起搏率然后突然变为CL = 500毫秒（i）中，CL = 400毫秒（ii）中，或CL = 250毫秒（ⅲ）。当不再通函发起（ⅰ - ii）中，较大的SR 的 Ca 2+释放的第一发生（由于较长舒张间隔和RyRs的回收）和舒张期的SR钙2+负荷略有降低到一个新的稳态（水平虚线）。当启动一个较短的CL，然而，更小的SR 钙释放的振幅发生（由于RyRs的的短舒张间隔和不完全恢复）和舒张的SR 的 Ca 2+负荷增大到一个新的稳态（水平虚线） 。 SR 钙释放幅度的轮换还发生在CL = 250毫秒。 S：小幅度释放，L：大量释放的幅度。 （CL：周期长度） 点击此处查看该图的放大版本。
基线（左）和之后在图3舒张期SR 钙离子泄漏和随后的触发活动。（A）心电图，V m和 SR 的 Ca 2+的痕迹治疗用100nM异丙肾上腺素（ISO，右）。符合ISO，显著舒张期SR 钙泄漏观察（红色箭头）。前，后的ISO SR 钙离子信号的振幅已经正常化。在窦房结被烧蚀以允许起搏CL = 300毫秒在这两种情况下，（B）如果SR 的 Ca 2+泄漏足够大，它可能会触发焦活性（室性早搏，室早）。在这个例子中，永久虚电路中断正常窦性心律。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
成功的关键的Fluo-5N染料加载是小容积循环灌流设置，其允许高的Fluo-5N浓度，而不需要大量的染料，加载时间（1小时）的长度，并执行装载在RT。如果载入在生理温度，细胞的酶活性迅速裂解当染料穿过细胞膜，捕集染料分子在细胞质中，而不是使它们穿过的SR膜的-AM标签进行。在RT，然而，酶活性被减慢和染料的足够量可以跨越两个细胞膜和SR膜-AM标记之前被裂解，捕捉在SR中的染料。
即使有最佳的负载条件，但是，信号幅度和分数荧光变化（ΔF/ F），这种方法会比与V M传统光学测绘和细胞内钙离子具有高亲和力的染料低。例如，对于这里使用的光学设置，由LED激发光，宏观的目标，大的过滤器和分色镜（5厘米×5厘米），和CMOS照相机，分数的荧光变化的（ΔF/ F）是1的量级- 2％，为的Fluo-5N信号和2 - 3％，为RH237 信号 15。分数荧光会，当然，取决于具体的光学配置，光源，和一个特定的设置的摄像机，但即使在最佳条件下的Fluo-5N信号是比通常观察到的细胞内Ca录音显著低级2+具有高亲和性的染料。例如，在相同的设置，ΔF/ F是20的数量级上- 30％RHOD-2时的绿色（545纳米）激发光被用于18。绿色激发光还更加接近于RH237的激发峰，从而RH237的ΔF/ F是也较大在这种情况下，左右4 - 5％。因此，对于那些实验室已经执行了V 米双光学测绘细胞内Ca 2+，应注意，以优化光学装置的所有组件，以确保最大的ΔF/ F显示了将Fluo-5N信号。
利用这种方法，调查人员能精确地探测SR 的 Ca 2+动态及其的方式是不可能的现有的方法对V M影响。例如，SR 的 Ca 2+泄漏定量测量（如在图3A）和SR 的 Ca 2+恢复（SR 的 Ca 2+ -ATPase [SERCA活性的的tau蛋白-a测量）的精确的时间常数可以被执行。使用为2+的细胞内Ca具有高亲和性的染料光学测绘现有的方法中，这些测量值可以“污染”与跨膜的 Ca 2+通量（即，捐款L-型Ca 2+通道和Na +的-Ca 2 +交换 ）。此外，高亲和力钙指标有本质上慢ķinetics比低亲和力的指标5，这样的Fluo-5N的信号，预计在精确的SR 钙离子的运动具有高保真及本质实际钙离子的变化和荧光相应变化之间没有时间延迟报告。
调查由SR 钙释放和再摄取有助于致心律失常现象的详细机制的能力是这种方法的另一个优点。例如，使用这种方法，我们最近报道怎样的SR 钙释放耐火度有助于对钙离子交替其发作和，在心室纤维性颤动，SR 的 Ca 2+释放几乎保持连续耐火材料15。这颤动期间SR 钙离子动力学的第一份报告，并强调了SR 钙成像的关键优势，在完整的心脏：空间不同而复杂的现象，如在空间不协调交替和fibrillation可以研究。不幸的是，这种类型的信息不能从分离的细胞，其中原纤化是不可能的，或从方法从一个位置上完整的心脏 12，只有记录收集。
此外，V M和免费SR 钙离子在完整心脏同步光映射可以提供新的工具，以评估异常钙处理在病理情况下，包括心脏衰竭。在SR 钙调控，包括激活SR 钙释放，舒张期SR 钙离子泄漏，和SR 钙摄取和终止的异常-中钙的所有主要步骤2+循环和全部心脏衰竭可能改变的-可以直接影响。此外，这种方法也可以用于评估新的治疗干预，如碱受体稳定19和SERCA调制20的效果的有用工具。
2+] 的SR浓度。不幸的是，由于心脏，和光致漂白和染料泄漏从整个实验过程中的SR的曲面变异染料加载，非均匀的激发和发射光使其极难校准的Fluo-5N信号以确切的[Ca 2+] SR在完整的心脏。先前的体外研究中的生理缓冲液和透化细胞中分离已经报道这种校准和已表明改变的Fluo-5N荧光成比例的变化的[Ca 2+] SR和荧光预计不会饱和，在生理的[Ca 2 +] SR等级 11。因此，调查人员应选择钙马的方法pping（低或高亲和力的染料）根据其具体的实验目标和生理调查。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
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