Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optisk Kortlægning af Intra-reticulum Ca Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/53166
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

Summary

Denne artikel beskriver den detaljerede protokol og nødvendigt udstyr til dobbelt optisk kortlægning af transmembranpotentiale (V m) og gratis intra-reticulum (SR) Ca2 + i Langendorff-perfunderet kanin hjerte. Denne metode giver mulighed for direkte observation og kvantificering af V m og SR Ca 2+ dynamik i den intakte hjerte.

Protocol

Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg fra University of California, Davis, og levet op til vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udgivet af National Institutes of Health.

1. Fremstilling

  1. Forbered to koncentrerede (25X) lagre af modificeret Tyrodes løsning på forhånd og opbevares ved 4 ° C: (1) Lager I (i mM: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCI 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26,25), og (2) Lager II (i mM: NaHCO3 500).
    1. Forberede frisk 2 L Tyrode opløsning med følgende sammensætning (i mM): NaCl 128,2, CaCl2 1,3, KCI 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1.19, NaHCO3 20 og glucose 11,1 ved at kombinere 1840 ml deioniseret (DI) vand, 80 ml Stock I, 80 ml Stock II, og 4 g glucose. Må ikke direkte blande Stock I og Stock II tilføjem til 1.840 ml DI for at undgå udfældning.
  2. Forbered stamopløsning af excitation-kontraktion afkobler Blebbistatin ved 10 mg / ml i vandfrit di-methylsulfoxid (DMSO) på forhånd og gemme stamopløsningen ved 4 ° C.
  3. Forbered stamopløsninger af fluorescerende farvestoffer: (1) spændingsfølsomme farvestof RH237 (1 mg / ml i DMSO) og (2) Lav-affinitet calciumindikator Fluo-5N AM (2 mg / ml i DMSO) ifølge producentens anbefalinger. Brug forberedelserne øjeblikkeligt for at undgå nedbrydning med efterfølgende tab af lasteevnen.
  4. Prime recirkulerende Langendorff perfusionssystemet med oxygeneret (95% O2, 5% CO2) Tyrode opløsning. Juster strømmen af O 2 / CO 2 for at holde pH af Tyrode-opløsning ved 7,4 ± 0,05. Brug en in-line nylon vævet net filter (porestørrelse: 11 pm) til løbende at filtrere perfusatet.
    1. Prime perfusionssystemet ved RT, som efterfølgende loading Fluo-5N AM udføres ved stuetemperatur. For Fluo-5N AM lastning, bruge en lille mængde af recirkulerende perfusat (~ 150 ml). Efter farvestof lastning, bruges et større volumen af perfusat (1 - 2 L, se figur 1C).
  5. Tænd dataopsamlingssystem og forberede kontinuerlig overvågning af EKG og perfusionstryk. Forbered pres-overvågningssystem: Tilslut en tryktransducer til perfusion linje og overvåge perfusion tryk med en transbridge forstærker. Juster baseline perfusionstryk til 0 mm Hg, når hjertet ikke er fastgjort til perfusion system.
  6. Juster de optiske kortlægning kameraer for at sikre rumlig overensstemmelse mellem V m og SR Ca 2 + signaler.
    1. Først fokus kameraerne ved at placere en lineal eller en genstand med tekst i perfusion fad. Drej kortlægning kameraerne i en live view mode og justere fokus, indtil teksten er skarp og klar. Anskaf et enkelt billede billede fra hvert kamera.
    2. Overlaydisse billeder og justere gennemsigtigheden af ​​den øverste billede, så begge billeder er synlige. Teksten i billederne skal overlappe nøjagtigt. Hvis ikke perfekt afstemt, justere vinklen på den dikroiske spejl eller positionen af ​​hvert kamera, indtil de to billeder er justeret.

2. Høst, Perfusion og Dye-lastning af kanin Heart

  1. Fastgør kanin i en godkendt kanin harpiksstopperen. Dybt bedøver via en intravenøs injektion (marginal ørevene) natrium pentobarbital (50 mg / kg) og heparin (1.000 IE).
    1. Når kanin viser mangel på nociceptive reflekser, lave en midtlinie incision i huden til at afsløre brystbenet og ribben. Skære igennem brystbenet med stumpe-spids kirurgiske sakse fra Xyphoid til manubrium. Pas på ikke at beskadige hjertet mens åbning brystbenet. Sprede ribberne for at blotlægge hjertet.
    2. Hurtigt udskære hele hjerte-lunge blok ved hurtigt at skære alle fartøjer og bindevæv. Immediastændig placere hjerte-lunge-blok i iskoldt Tyrode opløsning.
  2. Find aorta for retrograd perfusion. Skær aorta ascendens lige proximalt til de tre grene af aortabuen. Kanyle aorta til en 8 G kanyle forbundet til perfusion system. Brug et stykke USP 0 silkesutur at sikre aorta på kanylen.
  3. Dissekere forsigtigt luftrør, lunger og epikardial fedt fra hjerte. Med en skarp pincet og dissektion saks, find mitralklappen og omhyggeligt skade eller fjerne en folder til at forhindre løsning overbelastning i venstre ventrikel.
  4. Nedsænk hjertet i glasset-kappe perfusionskammer vandret med den forreste overflade af hjertet opad til billeddannelse. Fastgør kanyle til et stykke Sylgard med U-formede tappe på silicium bunden af skålen for at forhindre bevægelse af hjertet under kortlægning (figur 1D). Hvis det ønskes, skal du indsætte en lille insekt pin i spidsen af ​​hjertet for staseringsrådgivere.
  5. Position elektrokardiogram (EKG) elektroder i badet på højre og venstre side af hjertet. Fuldt nedsænkes elektroderne i vandbadet og sikre, at de ikke er i kontakt med hjertet overflade for at tilvejebringe et volumen-EKG udført analogt med et Lead I konfiguration. Bekræft en normal Lead I EKG morfologi. Juster flow (25 - 35 ml / min) for at sikre, at aortatryk holdes ved 60 - 70 mmHg.
  6. Sluk lyset i rummet og tilsæt 0,3 til 0,6 ml Blebbistatin stamopløsning (trin 1.2) til perfusatet (slutkoncentration 10 - 20 uM).
    1. Sluk værelse lys for at undgå fotoinaktivering af Blebbistatin. Hvis det er nødvendigt, kan et lille spotlight eller forlygte bruges til at give opgaven belysning.
      Bemærk: Blebbistatin er et myosin ATPase inhibitor og en excitation-kontraktion afkobler. Fordi Fluo-5N belastning kræver udvidede (60 min) RT (hypotermi) forhold (se trin 2.8 - 2.10), hjerte-energiproduktion kan være kompromitteret. Therefore, tilsætning af Blebbistatin ind perfusatet før farvning belastning kan reducere energibehovet 16 og fjerne bevægelsesartefakter under efterfølgende optiske optagelser 17.
  7. Når sammentrækning af hjertet er ophørt (10 - 15 min, kontrolleret på aorta pres optagelse), skifte til den lille volumen recirkulerende perfusionssystem (se trin 1.4.1).
  8. Forberede og indlæse Fluo-5N AM lastning løsning: Tilføj 0,25 ml Fluo-5N AM stamopløsning (trin 1.3) til 0,25 ml varm 20% Pluronic F127. Tilføj 0,5 ml varm Tyrodes løsning til blandingen, bland godt, og tilføje til det lille volumen recirkulerende perfusionssystem.
  9. Løbende overvåge perfusionstryk og EKG og justere strømmen, hvis det er nødvendigt. Dye loading tager ca. 1 time ved stuetemperatur. 45 min efter læsning er begyndt, tænde for cirkulerende vandbad for at begynde at varme perfusionssystemet og perfusat til 37 ° C.
  10. Efter 60 min af Fluo-5N AM lastning, swiTCH perfusionen til større volumen recirkulerende perfusion (se trin 1.4).
  11. Fortynd 50 pi spænding farvestof RH237 stamopløsning (trin 1.3) i 1 ml varmt Tyrode opløsning og tilføje langsomt (over ~ 5 min) i en injektionsport proksimalt til kanylen.

3. Optisk Mapping

  1. I løbet af de sidste øjeblikke af farvestof lastning, placere hjerte og fokusere de optiske kortlægning kameraer for at sikre en passende synsfelt til eksperimentet.
  2. Hvis det ønskes, placeres en bipolær pacing elektrode på epikardial hjertets overflade for pacing.
  3. Placer en plast eller glas dækglas på overfladen af ​​perfusionskammeret at reducere bevægelsesartefakter på væskeoverfladen, der kan være til stede på grund af recirkulation af perfusatet.
    Bemærk: Som et alternativ til et dækglas, skal du bruge en ren plast 50 mm petriskål dækning.
  4. Fokusere de lysledere til ensartet at belyse overfladen af ​​hjertet med excitation lys. Brug blå lysdiode (LED) lyskilder og videre filtrere lys med en 475-495 nm båndpasfilter (figur 1A).
  5. Saml udsendte fluorescens med en makroskop og to komplementære metal-oxid-halvleder (CMOS) optiske kortlægning kameraer. Split det udsendte lys med et dikroisk spejl ved 545 nm.
    1. Langpasfilter længere bølgelængde del, der indeholder V-m-signal, ved 700 nm. Båndpasfilter den kortere bølgelængde del, der indeholder SR Ca2 + signal, 502-534 nm (figur 1A). Indstil frekvensen af ​​erhvervelsen optisk data til 0,5-1 kHz.
  6. For hver optisk optagelse, først indlede ønskede pacingprotokol, tænde excitationslyset, og indsamle med 1 - 4 sek af data. Hvis det ønskes, synkronisere pacing protokoller og dataopsamling den.
    Bemærk: Det er ikke muligt at re-indlæse Fluo-5N AM, således signal-til-støj-forhold (SNR) vil decreaSE hele eksperimentet grund farvestoflækage fra SR. Begræns forsøgsprotokol 1 - 2 timer for at sikre høje SNR værdier.
  7. Efter eksperimentet, vaske perfusionssystemet i sekvensen af ​​DI vand, 70% reagensalkohol og igen med DI-vand.
  8. Filter hvert datasæt med et geografisk Gaussisk filter (radius 3 pixels) ved anvendelse af kommercielt tilgængelige softwarepakker ifølge fabrikantens protokol.
  9. Hvis det er nødvendigt, rumligt tilpasse V m og SR Ca 2+ datasæt. Som i trin 1.6, overlay billederne fra hvert kamera, og kontrollere, at de anatomiske strukturer i hjertet (dvs.., Koronar vaskulatur, kanter af forkamre eller ventrikler) eller andre elementer i synsfeltet (dvs. kanyle, pacing elektrode) præcist overlap. Hvis ikke, er nødvendige rumlige justering af datasæt.
  10. Skift toppen transparent billede i x- og y-retning, indtil præcis overlapning opnås, at notere sig, at antallet af pixelsbilledet skal forskydes i hver retning. Hele datasæt svarende til den øverste billede (enten V m eller SR Ca2 +) skal derefter forskydes det bestemte antal pixels i hver retning for at sikre præcis opretning mellem V m og SR Ca2 + datasæt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1A viser et skematisk diagram af den optiske konfiguration for dual V m og SR Ca2 + kortlægning. Med denne opsætning er der fuldstændig spektral adskillelse af V m og SR Ca2 + signaler (Figur 1B). Et diagram over dual-loop perfusion system, der anvendes til Fluo-5N farvestof loading er illustreret i figur 1C. Figur 1D viser den vandrette orientering af hjerte i perfusion skålen. Repræsentative V m og SR Ca2 + optiske spor under kontinuerlig stimulering fra forskellige steder på epikardial hjertets overflade er vist i figur 2A. Den optiske synsfelt med denne opsætning er 31 mm x 31 mm og orienteringen af hjertet inden for synsfeltet er vist i figur 2B. Activation kort er også vist i figur 2B og er konstrueret ved at vælge aktiveringstiden for hver pixel og plotting denne værdi på en isokronalt kort (bemærk den typiske forsinkelse på ~ 8 - 10 msek mellem V m og SR Ca2 + aktivering maps). Det er vigtigt, nøgleaktion potentiale (AP) egenskaber, såsom AP stigetid (fra 10% til 90% af amplituden [Trise]), og AP varighed ved 80% repolarisering (APD 80), er ikke statistisk forskellige mellem hjerter fyldt med RH237 og Fluo-5N sammenlignet med dem fyldt med RH237 og Rhod-2 (Trise: 14,9 msek ± 1,9 msek vs. 14,2 ± 1,2 msek msek og APD 80: 155,3 ms ± 5,8 ms vs. 156,9 ± 5,7 msek msek for Fluo-5N og Rhod-2, henholdsvis; p> 0,05 for begge dele. n = 8 / gruppe), hvilket indikerer minimal indvirkning af Fluo-5N eller farvestof belastning på AP Figur 2C viser evnen til at observere og kvantificere relative ændringer i diastolisk SR Ca2 + belastning og systolisk SR Ca2 + frigivelse amplituder på forskellige pacing cyklus længder. Kun relative ændringer i disse parametre kan quantified, som absolut kalibrering ([Ca2 +] SR) af signalet i det intakte hjerte er ikke mulig.

Denne fremgangsmåde er særlig anvendelig til at karakterisere og kvantificere patologiske SR Ca2 + håndtering, som det er vist i figur 3. Efter påføring af β-adrenerge agonist isoproterenol receptor (100 nM), klar diastolisk Ca 2+ lækage fra SR observeres ( røde pile, figur 3A). Hvis lækagen er stor nok, Ca2 + -medieret udløst aktivitet kan forekomme (figur 3B).

Figur 1
Figur 1. Systemopsætning til Dual Kortlægning af V m og SR Ca2 +. (A) Diagram over den optiske setup, herunder de nødvendige filtre og dichroic spejl for korrekt spektral adskillelse. (B) Imaging af hjerter fyldt med enten Fluo-5N kun (I) eller RH237 kun (ii) indikerer fuldstændig spektral adskillelse af V m og SR Ca2 + fluorescerende signaler. Ex: excitation, Em:. Emission (C) Diagram over dobbelt loop perfusionssystem for normal perfusion og Fluo-5N farvestof lastning (D) Billede af en kanyle hjerte og EKG-elektroder i perfusion fad.. Paneler A og B gengivet med tilladelse fra Wang et al. 15. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. V m og SR Ca 2 + Optiske Spor under kontinuerlig og ikke-kontinuerlig pacing. (A) Repræsentant V m og SR Ca2 + OPTICAl spor under kontinuerlig pacing ved en længde på 300 ms cyklus. Signaler er vist fra hvert af de steder, der er angivet i (B). Bemærk forsinkelsen af ~ 8 - 10 msek mellem V m og SR Ca2 + aktiveringstider som er typisk for normal excitation-kontraktion kobling. (B) Billede af et hjerte inden for synsfeltet kortlægning (hvid pilespids angiver pacingelektroderne) og kort aktivering af V m og SR Ca2 +. (C) SR Ca2 + optiske spor demonstrerer ændringer i diastolisk SR Ca2 + belastning og amplituden af SR Ca2 + frigørelse efter pludselige ændringer i pacingfrekvens. Alle spor starter med pacing ved CL = 300 ms. Pacingfrekvens derefter brat ændret til CL = 500 ms (i), CL = 400 ms (II) eller CL = 250 ms (iii). Når længere CLS indledes (i - ii), en større SR Ca2 + frigivelse først opstår (på grund af den længere diastoliske interval og genvinding af RyRs), og det diastoliske SR Ca2+ load lidt falder til en ny steady-state (vandret stiplet linje). Når en kortere CL initieres imidlertid forekommer en mindre SR Ca2 + release amplitude (på grund af kortere diastolisk interval og ufuldstændig genvinding af RyRs) og diastoliske SR Ca2 + belastningen stiger til en ny steady-state (vandret stiplet linje) . Vekslen af SR Ca2 + release amplitude forekommer også på CL = 250 msek. S: små frigivelse amplitude, L: stor release amplitude. (CL: cyklus længde) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Diastoliske SR Ca 2+ læk og efterfølgende Udløst aktivitet. (A) EKG, V m, og SR Ca 2+ spor under baseline (til venstre) og efterbehandling med 100 nM isoproterenol (Iso, højre). Med Iso er betydelig diastoliske SR Ca2 + læk observeret (røde pile). SR Ca2 + signalamplituder er blevet normaliseret før og efter Iso. Den sinusknuden blev ablateret at give mulighed for pacing CL = 300 ms i begge tilfælde. (B) Hvis SR Ca2 + lækage er stor nok, kan det udløse fokal aktivitet (præmature ventrikulære komplekser, PVC'er). I dette eksempel er PVC'er afbryde normal sinusrytme. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøglerne til en vellykket Fluo-5N farvestof loading er de små mængder recirkulerende perfusion setup, som giver mulighed for en høj Fluo-5N koncentration uden behov for store mængder farvestof, længden af ​​indlæsningstiden (1 time), og udføre lastning ved stuetemperatur. Hvis loading udføres ved fysiologiske temperaturer, cellulære enzymaktivitet hurtigt spalter -AM tag, når farvestoffet krydser cellemembranen, opfange de farvestofmolekyler i cytosolen og ikke tillade dem at krydse SR membran. Ved stuetemperatur, dog enzymatisk aktivitet aftaget, og en tilstrækkelig mængde farvestof kan krydse både cellemembranen og SR membran før -AM tag spaltes, fældefangst farvestoffet i SR.

Selv med optimale belastningsforhold vil imidlertid signalamplituder og fraktioneret fluorescensændringer (bf / F) med denne fremgangsmåde skal være lavere end med traditionelle optiske kortlægning af V m og intracellulær Ca2 + med høj affinitet farvestoffer. For eksempel med optiske opstilling anvendes her, der består af LED excitationslys, makroskopiske mål, store filtre og dikroiske spejl (5 cm x 5 cm) og CMOS-kameraer, fraktioneret fluorescensændringer (bf / F) er i størrelsesordenen 1 - 2% for Fluo-5N-signal og 2 - 3% for RH237 signalet 15. Den fraktionelle fluorescens vil naturligvis afhænge af den specifikke optiske konfiguration, lyskilde og kameraer af en bestemt opsætning, men selv under optimale betingelser Fluo-5N signal er signifikant lavere, end hvad der typisk observeres for optagelser af intracellulær Ca2 + med høj affinitet farvestoffer. For eksempel, på samme opsætning, bf / F er i størrelsesordenen 20 - 30% for Rhod-2, når grøn (545 ​​nm) excitationslyset bruges 18. Den grønne excitationslys er også tættere på excitation toppen af ​​RH237, således bf / F RH237 er også større i dette tilfælde omkring 4 - 5%. Således for disse labs allerede udfører dobbelt optisk kortlægning af V m Ca2 +, der skal sørges for at optimere alle dele af den optiske setup til at sikre maksimal bf / F for Fluo-5N-signal.

Med denne fremgangsmåde, kan efterforskerne præcist sonde SR Ca 2 + dynamik og dens indvirkning på V m på måder, der ikke er muligt med de eksisterende metoder. For eksempel kan udføres kvantitative målinger af SR Ca2 + lækage (som i figur 3A) og den præcise tidskonstant SR Ca2 + nyttiggørelse (tau -a mål for SR Ca2 + -ATPase [SERCA] aktivitet). Anvendelse af eksisterende metoder til optisk kortlægning af intracellulær Ca2 + med høj affinitet farvestoffer, kan disse målinger "forurenet" med transmembrane Ca2 + flux (dvs.., Bidrag fra L-typen Ca2 + kanaler og Na + -CA 2 + veksler). Desuden høj affinitet Ca2 + indikatorer har iboende langsommere kinetics end lav-affinitet indikatorer 5, således Fluo-5N signaler forventes at rapportere om præcise SR Ca 2 + bevægelser med high fidelity og i det væsentlige ingen tid forsinkelse mellem faktiske Ca 2+ ændringer og tilsvarende ændringer i fluorescens.

Evnen til at undersøge de detaljerede mekanismer, som SR Ca2 + frigivelse og reuptake bidrager til arytmier fænomener er en anden fordel ved denne fremgangsmåde. For eksempel ved hjælp af denne metode, for nylig rapporteret vi, hvordan ildfasthed af SR Ca 2+ frigivelse bidrager til udbrud af Ca 2 + alternans og at der under ventrikelflimmer, SR Ca2 + frigivelse forbliver næsten konstant refraktær 15. Dette var den første rapport fra SR Ca 2 + dynamik under fibrillation og fremhæver den vigtigste fordel ved SR Ca2 + billeddannelse i intakte hjerte: rumligt adskilte og komplekse fænomener som rumligt disharmoniske alternans og fibrillation kan studeres. Desværre kan denne type oplysninger ikke udledes isolerede celler, hvor fibrillation ikke er mulig, eller fra metoder, der kun optage fra et enkelt sted på den intakte hjerte 12.

Endvidere kan samtidig optisk kortlægning af V m og frie SR Ca2 + i ubeskadiget hjertet tilvejebringe et nyt værktøj til vurdering af unormale Ca 2+ håndtering i patologiske tilstande, herunder hjertesvigt. De abnormiteter i SR Ca2 + regulering, herunder aktivering og opsigelse af SR Ca2 + udgivelse, diastoliske SR Ca2 + lækage, og SR Ca2 + optagelse - alle større skridt i Ca2 + cykling og alle potentielt ændres i hjertesvigt - kan direkte undersøgt. Desuden kunne denne metode også være et nyttigt redskab til at vurdere virkningerne af nye terapeutiske indgreb, som f.eks RyR stabilisering 19 og SERCA modulation 20.

[Ca2 +] SR koncentrationer. Desværre variation i farvestof lastning, uensartet excitation og emission lys på grund af den krumme overflade af hjertet og foto-blegning og farvestof lækage fra SR hele forløbet af eksperimentet gøre det yderst vanskeligt at kalibrere Fluo-5N signaler til overstående [Ca2 +] SR i ubeskadiget hjertet. Tidligere in vitro studier i fysiologiske bufferopløsninger og permeabiliseres isolerede myocytter har rapporteret sådanne kalibreringer og har tilkendegivet, at ændringer i Fluo-5N fluorescens er proportionale med ændringer i [Ca2 +] SR og fluorescensen forventes ikke at mætte ved fysiologisk [Ca 2 +] SR niveauer 11. Således bør efterforskere vælge metoden til Ca2 + mapping (lav eller høj affinitet farvestof) baseret på deres specifikke eksperimentelle mål og fysiologiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-1 Component of Tyrode's solution
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500 Component of Tyrode's solution
KCl Fisher Scientific S217-500 Component of Tyrode's solution
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500 Component of Tyrode's solution
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500 Component of Tyrode's solution
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3 Component of Tyrode's solution
D-Glucose Fisher Scientific D16-1 Component of Tyrode's solution
95% O2 5% CO2 AirGas carbogen For oxygenation and pH of Tyrode's solution
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760 Excitation-contraction uncoupler
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Fluo-5N AM Invitrogen F-26915 Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature
Pluronic F127 Biotium 59004 For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving blebbistatin and dyes
Filter EMD Millipore NY1104700 11 μm in-line filter
Pressure Transducer WPI BLPR2 For measuring perfusion pressure
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp
PowerLab 26T ADInstruments For continuous recording of pressure and ECG signals
THT Macroscope SciMedia Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS SciMedia Optical mapping cameras
Precision LED Spot Light Mightex PLS-0470-030-15-S LED light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
  2. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
  3. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  4. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).
  5. Kong, W., Fast, V. G. The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).
  6. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).
  7. Bers, D. M., Shannon, T. R. Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes. Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).
  8. Knollmann, B. C. New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle. The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).
  9. Chen, H., et al. Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions. The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).
  10. Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans. Circulation research. 94, 650-656 (2004).
  11. Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve. Circulation research. 93, 40-45 (2003).
  12. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).
  13. Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations. Circulation research. 99, 740-748 (2006).
  14. Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).
  15. Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).
  16. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).
  17. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).
  18. Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).
  19. Marks, A. R. Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics. The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).
  20. Cutler, M. J., et al. Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart. Circulation. 126, 2095-2104 (2012).

Tags

Molecular Biology optiske kortlægning reticulum calcium calcium-sensitive farvestof spændingsfølsomme farvestof arytmi hjerteelektrofysiologi excitation-kontraktion kobling kanin
Optisk Kortlægning af Intra-reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Og transmembrane potentiale i Langendorff-perfunderet kanin Heart
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., De Jesus, N. M.,… More

Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. J. Vis. Exp. (103), e53166, doi:10.3791/53166 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter