Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/53166

Summary

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Protocol

Hayvanları da içeren tüm prosedürler California, Davis Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu yapıştırılır bulundu.

1. Hazırlık

  1. 4 ° C'de önceden ve mağaza modifiye Tyrode çözeltisi iki konsantre edildi (25X) stokları hazırlayın: (1) Stok I (mM olarak: NaCl 3205, CaCl2 32.5, KCI 117.5, NaH 2 PO 4 29,75, MgCI2 26,25) ve (2) (mM olarak: 500 NaHCO 3) Stok II.
    1. (DI) NaCl 128.2, CaCl2 1.3, KCI 4.7, MgCl2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 ve deiyonize 1840 ml birleştirerek glikoz 11.1: Taze (mM olarak) aşağıdaki bileşime sahip 2 L'lik Tyrode solüsyonu hazırlamak Su, 80 mi Hazır I Stok II 80 mi, ve glukoz, 4 g. Doğrudan Stok I ve II Stok karışmaz; eklemek1840 ml DI m çökmesini önlemek için.
  2. Önceden 10 mg susuz di-metilsülfoksit (DMSO) / ml uyanlma-kasılma uncoupler blebbistatin stok çözeltisi hazırlamak ve 4 ° C 'de stok solüsyonu saklayın.
  3. Floresan boyalar stok çözelti hazırlayın: (1) voltaj duyarlı boya RH237 (DMSO içinde 1 mg / ml) ve (2) Düşük afiniteli kalsiyum göstergesi Fluo-5N AM, üreticinin tavsiyelerine göre (DMSO içinde 2 mg / ml). Yükleme kapasitesi kaybı sonucu ile, bozulmayı önlemek için, hemen hazırlıkları kullanın.
  4. Prime oksijenli sahip çevrimli Langendorff perfüzyonu sistemi (% 95 O2,% 5 CO2), Tyrode çözeltisi. 7.4 ± 0.05 Tyrode çözümü pH tutmak için O 2 / CO 2 akışını ayarlayın. Sürekli perfüzyon filtre: bir in-line naylon dokuma ağ filtre (11 um gözenek boyutu) kullanın.
    1. Sonraki loadi olarak oda sıcaklığında Başbakan perfüzyon sistemi,Fluo-5N AM ng oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Fluo-5N AM yükleme için, çevrimli perfüzat küçük bir hacim (~ 150 ml) kullanın. Boya yüklemesinin ardından, perfüzat daha büyük bir hacim kullanımı (1-2 L, Şekil 1C bakınız).
  5. Veri toplama sistemi açın ve EKG ve perfüzyon basıncının sürekli izlenmesi için hazırlar. Basınç izleme sistemi hazırlayın: perfüzyon hattına bir basınç transdüktörü bağlayın ve bir transbridge amplifikatörü ile perfüzyon basıncını izlemek. Kalp perfüzyon sistemine bağlı değilken 0 mmHg bazal perfüzyon basıncını ayarlayın.
  6. V m ve SR Ca 2 + sinyalleri arasındaki uzaysal uyum sağlamak için optik haritalama kameraları aynı hizaya getirin.
    1. İlk olarak, bir cetvel ya da perfüzyon çanak içine metin ile bir nesne yerleştirerek kameralar odaklanır. Canlı görünüm moduna haritalama kameraları açın ve metin canlı ve net olana kadar odağı ayarlamak. Her bir kamera tek bir kare görüntü elde edin.
    2. YerleşimiHer iki resim görünür, böylece bu görüntülerin ve üst resmin saydamlığını ayarlamak. Görüntülerdeki metin tam üst üste gelmelidir. Mükemmel hizalanmış değilse iki görüntü aynı hizada kadar, dikroik ayna veya her kameranın konumunun açısını ayarlayın.

Tavşan Kalbin 2. Hasat, Perfüzyon ve Boya yükleme

  1. Onaylanmış bir tavşan süzgeç tavşan sabitleyin. Derin sodyum pentobarbital (50 mg / kg) ve heparin (1000 IU) bir intravenöz enjeksiyon (marjinal kulak daman) ile anestetize.
    1. Tavşan görüntüler nosiseptif reflekslerin eksikliği olduğunda, bir orta hat cilt kesi sternum ve kaburga maruz olun. Manubrium için xiphoid gelen künt uçlu cerrahi makas ile sternum ile kesin. Sternumu açarken kalbi zarar vermemeye özen gösterin. Kalp maruz kaburga yayıldı.
    2. Hızla hızla tüm damarları ve bağ dokusu kesim tarafından tüm kalp-akciğer bloğu tüketim. Immediately buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi içine kalp-akciğer bloğu yerleştirin.
  2. Retrograd perfüzyon için aorta bulun. Aortik arkın üç şubelerine sadece proksimal asendan aort kesin. Perfüzyon sistemine bağlı bir 8 G kanül aort kanüle. Kanül üzerine aorta güvenli USP 0 ipek sütür bir parça kullanın.
  3. Dikkatle kalp trakea, akciğerler ve epikardiyal yağ teşrih. Keskin forseps ve diseksiyon makas ile, mitral kapak bulun ve dikkatle zarar veya sol ventrikül çözüm sıkışıklığını önlemek için tek broşür kaldırın.
  4. Görüntüleme için yukarı bakacak şekilde kalbin ön yüzeyi ile yatay cam ceketli perfüzyon odasında kalbi Batmak. Haritalama (Şekil 1D) sırasında kalbin hareket etmesini önlemek için çanağın silikon alt üzerine U-şekilli pimlerle Sylgard parçasına kanül elde edin. İsterseniz, sta için kalbin tepesinde küçük bir böcek pin eklemekbilization.
  5. Pozisyon elektrokardiyogram (EKG) kalbin sağ ve sol tarafında banyosunda elektrotlar. Tamamen banyosunda elektrotlar daldırın ve onlar Kurşun Ben yapılandırmasına bir hacim yapılan EKG benzer sağlamak için kalp yüzeyi ile temas halinde olmadığından emin olun. Normal Kurşun I EKG morfoloji doğrulayın. 70 mmHg - aort basıncı 60 muhafaza edilmesinin sağlanması için - (35 ml / dakika 25) akışını ayarlayın.
  6. Oda ışıkları kapatın ve 0.3 eklemek - Perfüzat (- 20 uM son konsantrasyon 10) ile blebbistatin stok solüsyonu (adım 1.2) 0.6 ml.
    1. Blebbistatin bir photoinactivation önlemek için oda ışıkları kapatın. Gerekirse küçük bir spot ışığı veya far görevi aydınlatma sağlamak için kullanılabilir.
      Not: Blebbistatin bir miyozin ATPaz inhibitörü ve bir eksitasyon-kasılma uncoupler olduğunu. , Kardiyak enerji üretimi bozulabilir - Flu-5N yükleme genişletilmiş (60 dk) RT (hipotermi) koşulları gerektirdiğinden (2.10 adımları 2.8 bakınız). Therefore, Perfüzat önce içine blebbistatin eklenmesi enerji talebini azaltmak 16 ve sonraki optik kayıtları 17 sırasında hareket eserler ortadan kaldırabilir yükleme boya.
  7. Kalbin kasılması bittikten sonra (10 - aort basınç kayıt doğrulandı 15 dk), küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemi (adım 1.4.1 bakınız) geçmek.
  8. Hazırlayın ve Fluo-5N AM yükleme çözüm yük: 0.25 ml ılık% 20 Pluronic F127 için Fluo-5N AM stok solüsyonu (adım 1.3) 0.25 ml ekleyin. , 0,5 ml karışımına sıcak Tyrode çözeltisi ekleyin, iyice karıştırılmakta ve küçük hacimli çevrimli perfüzyon sistemine ekleyin.
  9. Sürekli perfüzyon basıncı ve EKG izlenmesi ve gerekirse akışını ayarlamak. Boya yükleme RT'de yaklaşık 1 saat sürer. Yüklemeden sonra 45 dk 37 ° C perfüzyon sistemi ve perfüzyon ısınma başlamak için dolaşan su banyosu açın başladı.
  10. Fluo-5N AM yükleme, swi 60 dakika sonraDaha büyük hacimli sirkülasyon perfüzyon sistemine perfüzyon Tch (adım 1.4).
  11. Sıcak Tyrode çözeltisi 1 ml voltajı duyarlı boya RH237 stok çözeltisinin (adım 1.3) 50 ul seyreltilir ve kanül, bir enjeksiyon noktası proksimal içerisine (5 ~ dakika boyunca) yavaş yavaş ekleyin.

3. Optik Haritalama

  1. Boya yükleme son anlarında kalbi konumlandırmak ve deney için görüş uygun alanı sağlamak için optik haritalama kameraları odaklanır.
  2. Eğer arzu edilirse, kalp atışı düzenleme epikardiyal yüzeyi üzerine yerleştirilen iki kutuplu bir elektrot ilerleme hızı yerleştirin.
  3. Bağlı perfüzat devridaim mevcut olabilir, sıvı yüzeyi üzerinde hareket paraziti azaltmak perfüzyon odasına yüzeyi üzerinde bir plastik ya da cam kapak kayma yerleştirin.
    Not: Bir kapak kayma bir alternatif, temiz bir plastik 50 mm Petri kabı kapağı kullanmak gibi.
  4. Üniform e kalbin yüzeyine aydınlatmak için ışık kılavuzları Odakxcitation ışığı. 495 nm bant geçiren filtre (Şekil 1A) - Mavi ışık yayan diyot (LED) ışık kaynağı kullanın ve daha bir 475 ile ışık filtresi.
  5. Bir macroscope ve iki tamamlayıcı metal oksit-yarıiletken (CMOS) optik haritalama kameralar ile yayılan floresan toplayın. 545 nm'de dikroik ayna ile yayılan ışığı bölün.
    1. Uzun pas 700 nm'de, V m sinyalini içeren, uzun dalga boyu parçasını filtre. 534 nm (Şekil 1A) - Bant geçiren 502 den, SR Ca 2 + sinyalini içeren, kısa dalga boylu parçasını filtre. 1 kHz - 0.5 optik veri toplama sıklığını ayarlayın.
  6. Her optik kayıt için, ilk olarak, istenen düzenlemeyi başlatmak ikaz ışığı açmak ve 1 toplamak - veri 4 sn. İstenirse, ilerleme hızı protokolleri ve veri toplama senkronize.
    Not: mümkün değildir Fluo-5N AM, bu nedenle sinyal-gürültü oranını (SNR) re-load düflüfl olacakse SR sızıntıyı boya nedeniyle deney boyunca. Yüksek SNR değerleri sağlamak için 2 saat - 1 deneysel protokol sınırlayın.
  7. Deney sonra, Dİ su ile tekrar DI su,% 70 reaktif alkol sırayla perfüzyon sistemi yıkama ve.
  8. Üreticinin protokolüne göre ticari yazılım paketleri kullanılarak mekansal Gauss filtre (yarıçap 3 piksel) her veri kümesi Filtre.
  9. Gerekirse, mekansal V m ve SR Ca 2 + veri setleri aynı hizaya getirin. Adım 1.6 olduğu gibi, her kamera görüntüleri kaplaması ve doğrulayın görünümü (yani, kanül, kalp pili elektrodu) alanında kalbin anatomik yapıları (yani., Koroner damar, kulakçıklar kenarlarına veya ventriküller) ya da diğer öğeleri tam olarak örtüşmektedir. Değilse, veri setlerinin mekânsal uyum gereklidir.
  10. Piksel sayısı not ederek, tam örtüşme kadar x ve y-yönünde elde edilir üst saydam bir görüntü ShiftResim, her yönünde kaydırılabilir olmalıdır. Üst görüntüde (V m veya SR Ca 2+ ya) karşılık gelen tüm veri kümesi sonra V m ve SR Ca 2 + veri setleri arasındaki hassas hizalama sağlamak için her yönde piksel belirlenen sayısına göre kaydırılır gerekmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1A, çift V m ve SR Ca2 + eşleme için optik konfigürasyonunda şematik bir diyagramını göstermektedir. Bu ayar ile, V m ve SR Ca 2 + sinyalleri (Şekil 1B) tam spektral ayrılık yoktur. Fluo-5N boya yüklemesinin için kullanılan çift döngü perfüzyon sistemin bir şeması Şekil 1C 'de gösterilmiştir. Şekil 1 D perfüzyon çanak kalp yatay yönünü gösterir. Örnek V m ve kalp epikardiyal yüzeyi üzerinde farklı konumlarda sürekli pacing sırasında SR Ca2 + optik izleri Şekil 2A'da gösterilmektedir. Bu kurulum ile görüş optik alanı x 31 mm ve görüş alanı içinde kalp oryantasyon Şekil 2B'de gösterilmiştir 31 mm'dir. Aktivasyon haritaları aynı zamanda Şekil 2B'de de gösterilmiştir ve her bir piksel ve p aktivasyon süresi seçilerek oluşturulmuşturBir eş zaman harita üzerinde bu değeri lotting (- V m ve SR Ca 2 + aktivasyon haritalar arasında 10 msn ~ 8 tipik gecikme dikkat edin). Önemlisi, bu tür AP yükselme süresi gibi önemli aksiyon potansiyeli (AP) özellikleri% 80 repolarizasyon (APD 80) ve AP süresi (genlikli [Trise] 10% 90 den%), RH237 yüklü kalpleri arasında istatistiksel olarak farklı değildir 14.9 ± 1.9 msn msn vs 14.2 ± 1.2 msn msn ve APD 80: Flu-5N ve için 155,3 milisaniye ± 5.8 msn vs 156.9 milisaniye ± 5.7 msn ve Fluo-5N RH237 ve Rhod-2 (Trise yüklü kıyasla Rhod-2 sırasıyla; p hem de> 0.05; n. = 8 / grup), en az Fluo-5N etkisi veya AP Şekil 2C'de ilgili yükleme boya gösteren gözlemlemek ve diyastolik SR Ca bağıl değişiklikleri ölçmek için kabiliyetini gösterir 2+ Yük ve sistolik SR Ca 2 + sürüm çeşitli kalp pili döngüsü boylarda genlikleri. Bu parametreler Sadece rölatif değişimler qu edilebilirsağlam kalbinde sinyal antified, mutlak kalibrasyon ([Ca 2 +] SR) mümkün değildir.

Şekil 3'te gösterildiği gibi bu yaklaşım, karakterize patolojik SR Ca2 + kullanım miktarının belirlenmesi için özellikle yararlıdır. Görülmektedir SR den β-adrenerjik reseptör agonisti, isoproterenol (100 nM), açık bir diastolik Ca 2 + sızıntının uygulama (aşağıdakı kırmızı oklar, Şekil 3A). Kaçak yeterince büyükse, Ca 2 + tetiklenen etkinliği (Şekil 3B) oluşabilir -kaynaklı.

Figür 1
Çift V m Haritalama ve SR Ca 2+. Gerekli filtreler ve uygun spektral ayırma dikroik ayna dahil optik kurulum, (A) şeması. (Şekil 1. Sistem KurulumuYa Flu-5N, sadece (i) ya da RH237 yüklü kalplerin B) Görüntüleme, sadece (ii) V m tam bir spektral ayrılmanın ve SR Ca2 + floresan sinyalleri gösterir. Ör: uyarma, Em. Normal perfüzyon ve Fluo-5N boya yükleme için çift döngü perfüzyon sistemi emisyon (C) Diyagram (D) perfüzyon çanak bir kanüle kalp ve EKG elektrotları Image.. Paneller A ve B Wang ve ark. 15 izni ile yeniden. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. V m ve SR Ca Sürekli ve Non-Sürekli Pacing sırasında 2 + Optik İzler. (A) Temsilcisi V m ve SR Ca 2 + optical 300 msn siklus uzunluğunda sürekli pacing sırasında izler. İşaretler (B) 'de gösterildiği münferit konumlardan gösterilmiştir. Normal eksitasyon-kasılma kenet için tipik olarak V m ve SR Ca 2 + aktivasyon süreleri arasında 10 ms - ~ 8 gecikme unutmayın. (B) görünümü haritalama alanı içinde kalp Görüntü V m ve SR Ca 2+. (C) diyastolik SR Ca 2 + yük değişiklikleri gösteren SR Ca 2 + optik izleri ve aktivasyon haritaları (beyaz ok ucu elektrotlar pace gösterir) ve SR Ca 2+ bülteninin genlik oranı kalp pili ani değişikliklerin ardından. Tüm izleri CL = 300 msn pacing ile başlar. Oranı Pacing sonra aniden CL = 500 ms: (i), CL için değiştirilir = 400 milisaniye (ii) ya da CL = 250 milisaniye (iii). Uzun CLs başlatılan zaman (i - ii) daha büyük bir SR Ca 2 + sürüm ilk ve diyastolik SR Ca (nedeniyle uzun diyastolik aralığı ve RyRs ve kurtarma) oluşur2+ yük hafifçe yeni kararlı durumda (yatay kesikli çizgi) azalır. Kısa CL başlatıldığında, ancak, daha küçük bir SR Ca 2 + bırakma genlik yeni bir kararlı durum (yatay kesikli çizgi) ve diyastolik SR Ca 2 + yük arttıkça (nedeniyle RyRs kısa diyastolik aralığı ve eksik kurtarma) oluşur . SR Ca 2 + bırakma genlik münavebe de CL = 250 msn oluşur. S: Küçük bırakma genlik, L: Büyük bırakma genlik. (CL: döngü uzunluğu) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Başlangıca (solda) ve aşağıdaki sırasında Şekil 3. Diastolik SR Ca 2 + Kaçak ve Müteakip Tetikleme aktivitesi. (A) EKG, V m ve SR Ca 2+ izleri100 nM isoproterenol (Iso, sağda) ile tedavi. Iso ile önemli diyastolik SR Ca 2 + kaçak (kırmızı oklar) görülmektedir. SR Ca 2+ sinyal amplitüdleri öncesi ve sonrasında normale Iso oylandı. Sino-atrial düğüm her iki durumda da CL = 300 msn pace sağlamak için ablasyon. (B) SR Ca 2 + kaçak yeterince büyük ise, odak aktiviteyi (prematüre ventriküler kompleksler, PVC) tetikleyebilir. Bu örnekte, VPS'ler normal sinüs ritmi kesintiye vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Başarılı Fluo-5N boya yükleme anahtarları boyanın büyük miktarda yükleme süresi (1 saat) uzunluğu gerek kalmadan yüksek Fluo-5N konsantrasyonu sağlar küçük hacimli çevrimli perfüzyon kurulum vardır ve yükleme gerçekleştirme oda sıcaklığında karıştırıldı. Yükleme hızla fizyolojik sıcaklıklarda, hücresel enzimatik aktivite böler boya sitozolde boya moleküllerini yakalama ve onları SR zarı geçmeye izin vermiyor, hücre zarı haçlar -AM etiketi gerçekleştirilir edin. Oda sıcaklığında, bununla birlikte, enzim aktivitesi yavaşlatılır ve -AM etiketi önce hücre membran ve membran SR hem çapraz bir boya yeterli miktarda, SR boya tutucu, yarılır.

Hatta en uygun yükleme koşulları, Bununla birlikte, sinyal amplitüdleri ve bu yaklaşım ile fraksiyonel Floresan değişiklikleri, (kadar taşınmış / F) yüksek afiniteli boyalarla V m geleneksel optik haritalama ve hücre içi Ca2 + ile birlikte daha düşük olacaktır. Örneğin, LED uyarma ışığı, makroskopik amaçları, büyük filtre ve dikroik ayna (5 cm x 5 cm), ve CMOS kamera, fraksiyonel floresans değişimden oluşmaktadır Burada kullanılan optik kurulum ile (kadar taşınmış / F) ile 1 mertebesindedir RH237 sinyali 15% 3 - - Flu-5N sinyali ve 2 için% 2. Fraksiyonel floresans, tabii ki, belirli bir optik konfigürasyonunda, ışık kaynağı ve özel bir kurulum kameralar bağlıdır, ama daha uygun koşullar altında Fluo-5N sinyal, tipik olarak, hücre içi Ca kayıtları için gözlenenden önemli ölçüde daha düşük olduğunu 2+ Yüksek afiniteli boyalarla. Yeşil (545 ​​nm) uyarma ışık 18 kullanıldığında Rhod-2 için% 30 - Örneğin, aynı kurulum üzerinde, mesafe kadar taşınmış / F 20 mertebesinde olduğunu. % 5 - yeşil uyarım ışığı da RH237 uyarım zirvesine yakın olup bu nedenle RH237 bölgesinin kadar taşınmış / F yaklaşık 4, bu durumda da daha büyüktür. Böylece, bu laboratuvarlar zaten V m çift optik haritalama performans 2+ hücre içi, bakım maksimum mesafe kadar taşınmış sağlamak için optik kurulum tüm bileşenleri optimize etmek için alınması gereken / Fluo-5N sinyali F.

Bu yaklaşımla, araştırmacılar tam olarak SR Ca 2 + dinamiklerini ve mevcut yaklaşımlarla mümkün olmayan yollarla V m üzerindeki etkilerini sonda olabilir. Örneğin, (Şekil 3A'da gibi) SR Ca2 + sızıntının sayısal ölçümler ve SR Ca2 + kurtarma (SR Ca2 + -ATPase [SERCA] aktivitesinin tau -a ölçüsü) hassas zaman sabiti gerçekleştirilebilir. Yüksek afiniteli boyalar ile 2 + hücre içi Ca optik haritalama için mevcut yaklaşımları kullanarak, bu ölçümler (transmembran Ca 2 + akı ile 'kirlenmiş' olabilir yani., L-tipi katkıları Ca 2 + kanalları ve Na + -Ca 2 + değiştirici). Ayrıca, yüksek afiniteli Ca 2 + göstergeleri doğal yavaş k varDüşük afiniteli göstergelerinin 5'ten inetics, böylece Fluo-5N sinyalleri yüksek sadakat ve gerçek Ca 2+ değişiklikler ve floresan karşılık gelen değişiklikler arasında aslında hiçbir zaman gecikmesi ile hassas SR Ca 2 + hareketlere rapor bekleniyor.

SR Ca 2 + bırakma ve geri alım aritmojenik olayların katkıda hangi detaylı mekanizmaların araştırılması yeteneği bu yaklaşımın bir başka avantajdır. Örneğin, bu metodolojiyi kullanarak, son zamanlarda SR Ca 2 + sürümü refrakterlik Ca 2 + alternans başlangıcından katkıda bulunur ve bu ventriküler fibrilasyon sırasında, SR Ca 2 + sürüm neredeyse sürekli refrakter 15 kalır ne bildirdi. Bu fibrilasyon sırasında SR Ca 2 + dinamiklerin ilk rapor ve sağlam kalbinde SR Ca 2+ görüntüleme anahtar avantajı vurgulamaktadır: Böyle uzaysal uyumsuz alternans ve f olarak uzamsal farklı ve karmaşık olgularıibrillation incelenebilir. Ne yazık ki, bu tip bilgiler fibrilasyon mümkün değildir ya da sadece dokunulmamış kalp 12 tek bir konumda kayıt yöntemlerle izole hücreler, panoda edilemez.

Bundan başka, V, m ve sağlam merkezinde ücretsiz SR Ca2 + aynı anda optik haritalama anormal Ca 2+ değerlendirmek kalp yetmezliği de dahil patolojik koşullarda, işleme için yeni bir araç sağlayabilir. SR Ca 2 + sürümü, diyastolik SR Ca 2 + kaçak, ve Ca 2+ SR alımı aktivasyonu ve fesih dahil SR Ca 2 + yönetmelik, anormallikleri - Ca tüm önemli adımlar 2+ bisiklet ve potansiyel kalp yetmezliği değişmiş tüm - doğrudan ele alınabilir. Buna ek olarak, bu yöntem aynı zamanda RyR stabilizasyon 19 ve SERCA modülasyon 20 olarak yeni terapötik müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için yararlı bir araç olabilir.

[Ca2 +], SR konsantrasyonları kesin için floresan değerleri kalibre yetersizlik de dahil olmak üzere, ancak, sınırlama olmadan değildir. Ne yazık ki, deney süresince SR ile ilgili kalp ve foto-ağartma ve boya sızıntının eğri yüzeyine boya yükleme, tek biçimli olmayan, uyarım ve emisyon ışığında değişkenliği son derece zor Fluo-5N sinyallerini ayarlamak yapmak sağlam kalbinde tam [Ca 2 +] SR. Fizyolojik tampon çözümleri Önceki in vitro çalışmalar ve geçirgen izole miyositler tür kalibrasyon bildirdi ve Fluo-5N floresan değişiklikler değişikliklere orantılı olduğunu göstermiştir [Ca 2 +] SR ve floresan fizyolojik doyurmak için beklenmemektedir [Ca 2 +] SR seviyeleri 11. Böylece araştırmacılar Ca 2+ ma yöntemini seçmelisinizkendi özel deneysel hedefleri ve fizyolojik araştırmalara dayalı pping (düşük veya yüksek afiniteli boya).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-1 Component of Tyrode's solution
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500 Component of Tyrode's solution
KCl Fisher Scientific S217-500 Component of Tyrode's solution
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500 Component of Tyrode's solution
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500 Component of Tyrode's solution
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3 Component of Tyrode's solution
D-Glucose Fisher Scientific D16-1 Component of Tyrode's solution
95% O2 5% CO2 AirGas carbogen For oxygenation and pH of Tyrode's solution
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760 Excitation-contraction uncoupler
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Fluo-5N AM Invitrogen F-26915 Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature
Pluronic F127 Biotium 59004 For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving blebbistatin and dyes
Filter EMD Millipore NY1104700 11 μm in-line filter
Pressure Transducer WPI BLPR2 For measuring perfusion pressure
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp
PowerLab 26T ADInstruments For continuous recording of pressure and ECG signals
THT Macroscope SciMedia Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS SciMedia Optical mapping cameras
Precision LED Spot Light Mightex PLS-0470-030-15-S LED light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
  2. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
  3. Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  4. Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).
  5. Kong, W., Fast, V. G. The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).
  6. Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).
  7. Bers, D. M., Shannon, T. R. Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes. Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).
  8. Knollmann, B. C. New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle. The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).
  9. Chen, H., et al. Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions. The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).
  10. Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans. Circulation research. 94, 650-656 (2004).
  11. Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve. Circulation research. 93, 40-45 (2003).
  12. Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).
  13. Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations. Circulation research. 99, 740-748 (2006).
  14. Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).
  15. Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).
  16. Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).
  17. Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).
  18. Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).
  19. Marks, A. R. Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics. The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).
  20. Cutler, M. J., et al. Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart. Circulation. 126, 2095-2104 (2012).

Tags

Molecular Biology Sayı 103 optik haritalama sarkoplazmik retikulum kalsiyum kalsiyuma-hassas bir boya voltaja duyarlı bir boya aritmi kalp elektrofizyoloji uyarım-kasılma birleştirme tavşan
Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., De Jesus, N. M.,More

Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. J. Vis. Exp. (103), e53166, doi:10.3791/53166 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter