Abstract
动物模型是研究的神经性疼痛的病理生理学和药理学的重要工具。这份手稿描述了外科手术和行为过程来研究三叉神经性疼痛的影响。满足三叉神经病疼痛综合症的特异性，眶下神经（离子）被松结扎神经经受慢性挤压伤（CCI）。一内部轨道的方式在这里呈现给揭露和结扎离子眶腔。离子结扎后，大鼠表现出变化自发行为和响应于的von Frey毛发刺激是表示持续性疼痛和机械异常性疼痛。两相可在的行为变化的发展来限定。在第一周离子CCI（阶段1），只显示出增加的和不对称的脸修饰活动， 即用洗面招主要针对神经损伤离子领土。它又分为脸部克之间进行ooming行为是更一般的身体梳理行为，这仍然基本不受离子的CCI的一部分，并且面对疏导既不是前面和后面由身体修饰，其中离子的CCI后显著增加。在此期间，响应于离子领土的机械刺激被降低。这种低反应突然由一个极端的高反应性，从而即使是很微弱的刺激强度惹nocifensive行为（第2阶段）所取代。这些行为改变和报道的面部疼痛征兆之间的相似性现象（即，响应于脸部的伤害性刺激）建议感觉迟钝/感觉异常和机械异常性疼痛在结扎离子领土的存在。
Introduction
损坏的体感神经最常导致感觉丧失。它不很好地理解为什么和怎样，在一些情况下，外周神经损伤引起的慢性疼痛。其结果是，痛苦神经病仍然是具有挑战性的条件来治疗1和导致大幅度减少生活2-3的患者的生存质量。动物模型是研究的现有的和新开发的药物的疗效，并确定参与神经性疼痛的发展和维持的病理生理机制的一个重要工具。在对平移疼痛研究的主要挑战是确定和衡量自发性疼痛的动物（ 即 ，生理，行为或其他表现，表明疼痛的动物的存在是不被用探测被敏锐地叠加在对象的基础条件刺激的挑战）。此过程的总体目标是手术诱导眶下神经损伤的大鼠，导致两者自发的发展和诱发可用于研究参与三叉神经性疼痛和其治疗机制nocifensive行为。
导演，孤立的脸修饰是大鼠自发性神经病理性疼痛唯一的措施。以下眶下神经的慢性挤压伤（CCI）（离子），大鼠表现出变化自发行为和响应于触觉刺激的，指示的持续性疼痛和机械异常性疼痛4。以下离子的CCI，大鼠显示出增加的和非对称面的修饰活性， 即 ，与洗面笔划主要涉及神经损伤离子领土。与此相反的面的伤害性刺激（例如，福尔马林注射）5，非疼痛感觉障碍（即，单侧触须削波，麻药眶下神经阻滞，矿物油对VIBRI应用SSAE）没有或只有非常简要（即，发病后的第一分钟）诱导梳理行为6面对一个显著变化。得出的结论是离子CCI后，这种不正常的疏导是在受伤的神经境内自发的，强烈的厌恶感觉一种行为表现。在离子CCI大鼠这种行为带有很强的相似观察患者自发性疼痛。进一步的研究发现面部修饰行为之间的一个重要区别是一个更一般的身体修饰行为的一部分（ 即“身体美容在脸上疏导”），这在很大程度上仍然不受离子CCI和nocifensive面部美容既不之前也不随后体修饰（即，“分离的面部美容”），其中离子的CCI 7-9后显著增加。药理学上，在身体护理面部护理构成良好的控制测量非特异性药物作用（ 以下离子的CCI，大鼠也响应于触觉刺激的，指示机械异常性疼痛4，10的呈现的改变。在第一周离子CCI后（多个），大鼠不再到轻度或中度触觉（即，的von Frey响应）的刺激。这种低反应，然后突然用一种极端的高反应性，从而即使是很微弱的刺激强度挑起nocifensive行为所取代。高反应性的可发性大鼠之间变化，但经过三至四周手术后最大鼠都成为高反应性。
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Protocol
伦理声明：动物治疗和关怀根据委员会的研究和IASP 11的伦理问题的指导方针。该协议被批准的机构伦理委员会。
1.主题
- 使用雄性SD大鼠（250-300g的到港）。
- 房子只在一个殖民地的房间有40-60％的湿度和21±1℃的室温固底笼。
- 使水和食物提供不限量。
- 保持大鼠下，反向12时12小时黑暗/光周期（开灯20小时）。
2.手术
- 每只鼠，准备两片约6厘米铬肠结扎（5-0）长，并放置在无菌盐水中，以避免干燥和变得僵硬且脆。
- 麻醉与戊巴比妥动物（60毫克/千克，IP），用阿托品（0.1毫克/千克，IP）。通过延长一条腿，pinchi监测麻醉水平纳克脚趾之间的皮肤上用指甲以确保有足够的压力被施加。确保动物不展示自己的肢体。如果有必要，给予额外的戊巴比妥钠。
- 剃鼠的头部，使得中线切开头皮，可制成具有相等的距离前部和后部，对眼睛的中心约25毫米。
- 修复老鼠的头一个立体框架或以其他方式固定老鼠的头部。放置在一个加热垫的大鼠，以保持体温。
- 取适量涂抹于双眼眼药膏，以防止干燥损害。
- 用酒精擦洗光头区域，然后优碘。
- 做一个中线头皮切口，露出颅骨和鼻骨。
- 使用的手术显微镜来执行步骤2.9至2.16。
- 解剖轨道自由，由上颌窦，额窦，泪和颧骨骼形成的边缘，用棉签和一对杜蒙钳的。用棉签如此阿克补气血从可能的出血。
- 为了让进入离子，打个擦边球用精密棉签眶内容物，注意不要过度扩张的筛前神经横跨优于离子。解剖离子自由从周围结缔组织，使用精密棉签和一对使用扩频运动杜蒙钳的。用棉签吸收血液可能出血。
- 要执行结扎，推单片铬肠向下沿额骨的一端，内侧与离子和推进几毫米平行和劣于离子。该结扎现在在离子和额骨之间的地方举行。
- 滑的下离子以45度倾斜的杜蒙钳尖端将其放置在靠近结扎。轻轻缩回离子侧面揭示钳结扎和小费。握钳结扎和横向下的离子撤回镊子。 从眶腔拉出结扎直到结扎的两端从离子或多或少等距。
- 建立从结扎线的两端一个“活结”，让完美的控制收缩的程度和相对滑动的离子结。进一步滑动结以收缩离子，使得神经的直径减小一个可觉量。使在滑结的顶部上的正常结，使得收缩的量保持恒定（即，防止狭缝结打滑）。
- 切连字留下约2毫米的离结自由端。
- 重复同样的过程（步骤2.11至2.15），以从所述第一做一个第二结扎2毫米。
- 对于假手术，执行步骤2.2到2.10。
- 关闭采用涤纶缝线（4-0）头皮切口，让老鼠恢复上一个加热垫。不要让动物无人看管，直到它重新获得足够的利弊ciousness保持胸骨斜卧，并不动物返回给其他动物的公司，直到其完全恢复。
- 为了避免对神经性疼痛的发展先发制人镇痛作用，不施用镇痛手术后疼痛。
3.行为测试程序
- 允许大鼠适应环境至少8天的时间手术前测试之前的居住条件。
- 手术前测试之前每日三天至少一次，观察者大鼠测试过程。
- 在黑暗的房间光线通过一个60瓦的红色灯泡提供行为测试暂停以上1米的试验区照明中心，但留下的圆周昏暗的房间黑暗的剩余部分的中心。
- 确保有足够的背景噪音，以减少突发听觉刺激的干扰。如果需要的话，提供白噪声。
- 面部护理行为观察
- Ťransport从殖民地一个老鼠的试验室有盖的塑料保持架没有被褥。注：理想情况下，这应该是最少的外部刺激的短途旅行。
- 放置在有盖的，透明的塑料笼老鼠没有床上用品（LXWXH：24厘米×14厘米×17厘米）的镜像备份在摄像机前。
- 做一个10分钟的记录动物的行为。在录制过程中，要确保实验者不存在于所述测试室。
- 将下一个动物前，清洁观察笼。
- 确保所记录的行为是由实验者谁是盲目的大鼠的实验条件下进行分析。
- 使10分钟的录制过程中，每一面疏导集的记录。注意：面部护理被定义为其中前爪被带到与面部区域接触的运动模式。
- 使两种类型的面梳理行为之间的区别。如果一个序列既不前面和后面由体修饰（即，梳理的身体区域脸部 以外），分类的情节作为分离面的修饰。如果身体梳洗之前或面部美容后立即进行，分类情节脸部护理过程中身体疏导。
- 确定的面部美容发作的次数。
- 归类面部美容动作之间的时间段不超过4秒为帧内集空间 （即，在单个情节面部美容动作之间的停顿）。
- 归类超过4秒作为一个跨插曲空间 （即，脸部美容动作两集之间的完全中断）面梳理动作之间的时间段。
- 机械性刺激试验
- 运输大鼠达6只动物从菌落到测试室的基团在有盖的笼与寝具。确保这是最少的外部刺激的短途旅行。
- 放置大鼠个别地置于透明塑料笼寝具（LXWXH：24厘米×14厘米×17厘米）的自由开闭，以便它可以容易地打开和关闭。
- 使用分级系列五·冯·弗雷毛发。注意：弯曲毛发所需的力是0.015克，0.127克，0.217克，0.745克和2.150克。
- ，观察者大鼠的观察笼并到达运动10分钟。每30秒，打开盖子，轻轻地触摸笼壁用塑料棒。
- 当动物处于嗅/无运动状态 （即，带有四个爪放置在地面上，既不移动也不冻结，但表现出嗅探行为），可应用所述第一的von Frey毛发离子境内靠近vibrissal垫的中心，对周围的mystacial触须毛茸茸的皮肤。
- 评分动物对刺激的响应于属于下列响应类别4之一。
- 分类完全没有反应，作为比分0。
- 分类的刺激检测（ 即鼠转头向激励对象，激励对象然后探索）的比分是1。
- 分类取款反应（ 即 ，鼠转头慢慢远去，或发生拉它轻快地向后当刺激被应用，有时单个面擦同侧刺激区）的比分2。
- 分类逃生/攻击响应（ 即 ，老鼠避免与刺激物进一步接触，无论是被动地通过移动身体远离刺激物承担对笼壁蹲伏的姿势，或主动通过攻击刺激物，使咬和抓的动作）作为得分3。
- 分类不对称的脸修饰（ 即鼠显示一系列连续的朝向刺激的面部区域至少有三个洗脸笔）作为得分4。
- 在每个动物，申请stimu李强度的升序排列。后一个刺激强度已经被应用到一侧，将其应用到另一侧移动到下一个刺激强度之前。随机化，其中，同侧和对侧侧面受到刺激的顺序。注意，动物必须在一个嗅探/无运动状态的每个刺激前。
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Representative Results
离子CCI大鼠表现出强烈的手术后增加的时间花费在分离面疏导（图1）的量。在第一手术后一周结束的增加的峰值，然后在接下来的数周内下降。最近的研究发现，面部修饰，以长达三个星期显著增加。在假手术组脸部美容的行为或多或少受到影响。
ION-CCI老鼠也表现出几乎完全没有反应的离子领土同侧机械刺激的第一个手术后一周（ 图2）中。在接下来的一周，这是低反应性所取代高反应性。高反应性的发作可能鼠之间变化，堪为提高平均分数，并减少变化。高反应性，已经发现在手术后到持续长达120天。还有一个在响应性禁忌小幅增长横向机械刺激在离子CCI大鼠，但也可以是从该勉强统计学显著在假手术大鼠。
。在分离面梳理行为以下离子的CCI数据点图1.手术后的变化代表平均值（±SEM;每组12只）的时间量花在分离面疏导（A）和平均（±SEM; N =孤立的脸疏导集（B）的前一天离子手术（前）和对术后天12月5号至26号每组）号。
中响应于机械性刺激下列离子的CCI数据点图2.手术后的变化代表平均值（±SEM; N= 12每组）响应得分的连接的离子领土之一天离子手术（预）之前的的von Frey毛发刺激和手术后的天4〜15（改编自Deseure等人，2003）。
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Discussion
离子的CCI模型中最令人感兴趣的方面是，它提供了自发的，非诱发（神经性）疼痛的唯一措施。神经性疼痛的大多数动物实验中，使用脊神经模型，专门解决nocifensive 行为 （例如，发声和戒断反应），反映过敏机械或热的刺激12。然而，患者的主要临床抱怨是持续性疼痛，痛觉过敏没有异常性疼痛或13。
本文章介绍了神经性疼痛以下离子CCI，孤立的脸修饰（自发痛）和响应冯·弗雷头发刺激（机械痛）两项措施。的下列离子的CCI神经性疼痛行为等措施也已经在别处描述， 即 ，热痛觉过敏和14冷异常性疼痛15。口颌面疼痛评估的。此外，新开发的方法，例如Orofacial疼痛评估设备（OPAD）16-17或进食持续作为口颌面痛反应18的措施，可能被证明是离子CCI后疼痛的有价值的措施。
本文章描述了一个内部轨道的方式离子。注意，其他两个方法， 即，外围方法通过切口进入毛状皮肤尾椎vibrissal垫和口腔内的方法，也是可能的。虽然外围的方法是迄今为止最简单的技术，帧内轨道方法具有离开细肌肉控制vibrissal运动完好，甚至更重要的明显的优势，它避免了卷绕在受损神经的领土的切口是可能严重地阻碍感官检验在该地区。其他作者已经成功应用于口腔内的办法14。然而，在maxil的腹侧端的离子的腹侧和一个骨脊之间的紧密接触毛细管骨使得口腔内的办法似乎更复杂我们和比内轨道的方法通过外科手术有挑战性。
考虑手术野的与大鼠，麻醉通过腹腔注射（IC戊巴比妥）的口部的紧密接近被选择了吸入麻醉（例如，异氟烷 ）。然而，鉴于戊巴比妥的缺点，如经由气体麻醉面罩为立体帧过量的风险，呼吸抑制，流体在上呼吸道堆积，其他麻醉药或甚吸入麻醉，可以考虑。根据我们的经验，小心给药，及时施用阿托品只要动物变得麻醉（甚至部分），适当的维修体温的，并从上呼吸道的流体抽吸最小化用戊巴比妥相关的风险。
在的量离子CCI大鼠间变异面部修饰行为可能会相当高。最近，已经显示这种可变性的一部分可通过观察大鼠更为频繁9来消除。每天两次观察显著增加的统计效力，减少所需的动物数量。响应于离子领土的von Frey毛发刺激是根据一系列等级排序描述响应类别（参见上文）进行分类。它可以被认为是一个缺点，即数据应该被非参数分析和集中趋势（例如，中值 ）和变异（例如，interquartiles）的非参数的措施来表示。有人认为，参数分析的结果显示了很好的根据这些非参数分析和平均分数没有适当的可视化的响应分值10的实验条件的影响。
离子CCI模型的主要应用是在PHAR现有的或新开发的镇痛药macological测试，新的治疗策略的开发，并参与（三叉）神经性疼痛的发展和维持的病理生理机制的研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromic catgut | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Pharmacy | ||
| Atropine | Pharmacy | ||
| Clippers for small animals - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting | 51600 | |
| Ophthalmic ointment (Liposic) | Pharmacy | ||
| Homeothermic monitor system | Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | |
| Cotton applicator | Pharmacy | ||
| Precision cotton swab | Qosina | 10225 | |
| Operation microscope | Kaps | SOM 62 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Scissors - blunt tips | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Polyester sutures - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H | |
| Digital video camera | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit | Stoelting | 58011 |
References
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Neuropathic pain a multidimensional burden for patients. Eur J Pain. 5 (4), 379-389 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Comparison of the SF 36 and Nottingham Health Profile in patients with chronic neuropathic pain. Eur J Pain. 5 (4), 391-403 (2001).
- Vos, B. P., Strassman, A. M., Maciewicz, R. J. Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rats infraorbital nerve. J Neurosci. 14, 2708-2723 (1994).
- Clavelou, P., Pajot, J., Dallel, R., Raboisson, P. Application of the formalin test to the study of orofacial pain. Neurosci Lett. 103, 349-353 (1989).
- Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. Behavioral assessment of facial pain in rats face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rats infraorbital nerve. Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).
- Deseure, K. R., Adriaensen, H. F. Comparison between two types of behavioral variables of non evoked facial pain after chronic constriction injury to the rat infraorbital nerve. Comp Med. 52 (1), 44-49 (2002).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Deseure, K., Koek, W., Adriaensen, H., Colpaert, F. C. Continuous administration of the 5 hydroxytryptamine1A agonist (3-Chloro-4-fluoro-phenyl)-[4-fluoro-4-[[(5-methyl-pyridin-2-ylmethyl) -amino]-methyl]piperidin-1-yl]-methadone (F 13640) attenuates allodynia like behavior in a rat model of trigeminal neuropathic pain. J Pharmacol Exp Ther. 306 (2), 505-514 (2003).
- Zimmerman, M. Ethical Guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112 (1-2), 12-15 (2004).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5 (9), 491-497 (2004).
- Imamura, Y., Kawamoto, H., Nakanishi, O. Characterization of heat hyperalgesia in an experimental trigeminal neuropathy in rats. Exp Brain Res. 116, 97-103 (1997).
- Chichorro, J. G., Zampronio, A. R., Souza, G. E., Rae, G. A. Orofacial cold hyperalgesia due to infraorbital nerve constriction injury in rats reversal by endothelin receptor antagonists but not non steroidal anti inflammatory drugs. Pain. 123 (1-2), 64-74 (2006).
- Kramer, P. R., Bellinger, L. L. Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents. J Vis Exp. (83), e50745 (2014).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to Measure Changes in Nociceptive Behavior. J Vis Exp. (76), 50336 (2013).
