Abstract
Djurmodeller är viktiga verktyg för att studera patofysiologi och farmakologi av neuropatisk smärta. Detta manuskript beskriver de kirurgiska och beteende förfaranden för att studera trigeminal neuropatisk smärta hos råttor. För att möta den särskilda karaktären hos trigeminala neuropatisk smärta syndrom, är det infraorbital nerven (jon) utsattes för en kronisk sammandragning skada (CCI) genom löst ligering nerven. En intra-orbital tillvägagångssätt presenteras här för att exponera och ligera jon i omlopps kaviteten. Efter Ion ligering, råttor uppvisar förändringar i spontanbeteende och som svar på von Frey hår stimulans som indikerar ihållande smärta och mekanisk allodyni. Två faser kan definieras i utvecklingen av beteendeförändringar. Under den första veckan efter Ion-CCI (fas 1), råttor visar en ökad och asymmetrisk ansikte grooming verksamhet, det vill säga med Face Wash stroke främst inriktad på nervskadade Ion territorium. En skillnad görs mellan ansikte grooming beteende som är en del av en mer allmän trimning av kroppshår beteende, vilket är i stort sett opåverkad av Ion-CCI, och ansikts grooming som varken föregås eller följs av kroppen grooming, vilket avsevärt ökar efter Ion-CCI. Under denna period är känslighet för mekanisk stimulering av jonen territorium minskas. Detta hyporespons abrupt ersättas med en extrem hyperreaktivitet innebär även mycket svaga stimulans intensiteter provocera nocifensiva beteende (fas 2). De fenomenologiska likheterna mellan dessa beteendeförändringar och rapporterade tecken på ansiktssmärta (dvs. svar på skadlig stimulering av ansiktet) tyder på förekomsten av dysestesi / parestesier och mekanisk allodyni i det ligerade Ion territorium.
Introduction
Skador på somatosensoriska nerver leder oftast till förlust av känsel. Det är inte mycket väl förstått varför och hur, i vissa fall, leder perifer nervskada till kronisk smärta. Som ett resultat, smärtsamma neuropatier förbli en utmanande förutsättning för att behandla en och leda till betydande minskningar i patienternas livskvalitet 2-3. Djurmodeller är ett viktigt verktyg för att undersöka effekten av befintliga och nyutvecklade läkemedel och för att identifiera de patofysiologiska mekanismer som är involverade i utveckling och underhåll av neuropatisk smärta. Bland de viktigaste utmaningarna för translationell smärtforskning är att identifiera och mäta spontan smärta hos djur (dvs, fysiologisk, beteendemässiga eller andra manifestationer som tyder på förekomsten av smärta hos djur som inte utmanas med sondering stimuli som akut överlagras på motivets basala tillstånd ). Det övergripande målet med detta förfarande är att kirurgiskt inducera ettinfraorbital nervskada i en råtta som leder till utveckling av både spontana och framkallade nocifensiva beteende som kan användas för att studera de mekanismer som är involverade i trigeminala neuropatisk smärta och dess behandling.
Riktad, isolerade ansikte grooming är en unik åtgärd för spontan neuropatisk smärta hos råttor. Efter kronisk sammandragning skada (CCI) i infraorbital nerven (Ion), råttor uppvisar förändringar i spontanbeteende och som svar på taktil stimulering som indikerar ihållande smärta och mekanisk allodyni 4. Efter Ion-CCI, råttor visar en ökad och asymmetrisk ansikte grooming verksamhet, det vill säga med Face Wash stroke främst inriktad på nervskadade Ion territorium. I motsats till skadliga stimulering av ansiktet (t.ex. formalin injektion) 5 icke-smärtsam känselstörningar (dvs ensidig vibrissae klippning, bedövningsmedel infraorbital nervblockad, tillämpning av mineralolja på vibriSSAE) inte eller endast mycket kortfattat (dvs de första minuterna efter starten) inducera en betydande förändring i ansiktet grooming beteende 6. Det konstaterades att denna onormala grooming efter Ion-CCI är en beteende manifestation av spontana, starkt aversiva känsla i den skadade nerven territorium. Detta beteende i jon-CCI-råttor bär starka likheter med spontan smärta hos patienter. Ytterligare studier har identifierat en viktig skillnad mellan ansikte grooming beteende som är en del av en mer allmän trimning av kroppshår beteende (dvs "ansikte grooming under kropp grooming"), vilket är i stort sett opåverkad av Ion-CCI, och nocifensiva ansikte grooming som varken föregås eller följt av trimning av kroppshår (dvs "isolerade ansikte grooming"), vilket avsevärt ökar efter Ion-CCI 7-9. Farmakologiskt, ansikte grooming under kropp grooming utgör en utmärkt kontrollmätning för icke-specifika läkemedelseffekter ( Efter Ion-CCI, råttor uppvisar också förändringar som svar på taktil stimulering som indikerar mekanisk allodyni 4, 10. Under den första veckan (s) efter Ion-CCI, råttor inte längre svarar på mild eller måttlig taktil (dvs, von Frey ) stimuli. Detta hyporespons sedan plötsligt ersatts av en extrem hyperreaktivitet innebär även mycket svaga stimulans intensiteter provocera nocifensiva beteende. Uppkomsten av hyperreaktivitet kan variera mellan råttor, men de flesta råttor har blivit hyperresponsive efter tre till fyra veckor efter operation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Djuren behandlas och vårdas enligt riktlinjerna i kommittén för forskning och etiska frågor i IASP 11. Protokollet godkänns av institutionella etiska kommittén.
1. Ämnen
- Använd Sprague-Dawley (250-300 g vid ankomsten).
- Hus råttor i fast bottnade burar i en koloni rum med en luftfuktighet på 40-60% och en RT 21 ± 1 ° C.
- Gör vatten och mat finns på libitum.
- Håll råttor under ett omvänt 00:12 h mörker / ljuscykel (ljus på vid 20 h).
2. Kirurgi
- Per råtta, förbereda två bitar av kromtarm ligatur (5-0) på cirka 6 cm långa och placera dem i steril saltlösning för att undvika uttorkning och blir stel och spröd.
- Söva djuret med pentobarbital (60 mg / kg, ip) och behandla med atropin (0,1 mg / kg, ip). Övervaka nivån av anestesi genom att förlänga ett ben och pinching banan av hud mellan tårna med en nagel för att säkerställa adekvat tryck appliceras. Se till att djuret inte flex sin lem. Om det behövs, administrera ytterligare pentobarbital.
- Raka huvudet av råttan, så att en mittlinjen hårbotten snitt kan göras på ca 25 mm med lika avstånd främre och bakre till mitten av ögonen.
- Fix råttans huvud i en stereotaktisk ram eller på annat sätt fixera råttans huvud. Placera råttan på en uppvärmd dyna för att upprätthålla kroppstemperaturen.
- Applicera oftalmologiska salva på båda ögonen för att förhindra skador från att torka.
- Skrubba rakat huvud med alkohol, sedan Betadine.
- Gör en mittlinjen hårbotten snitt, exponera skallen och näsben.
- Använd en operation mikroskop för att utföra steg från 2,9 till 2,16.
- Dissekera kanten på bana fri, som bildas av maxillary, frontal, lakrimal och zygomatic ben, under användning av en bomullspinne och ett par Dumont pincett. Använd pinnen för att såak upp blod från eventuella blödningar.
- Att ge tillgång till ION, försiktigt böja orbital innehållet med en precision bomullspinne, noga med att inte överanstränga den främre ethmoidal nerv som korsar överlägsen Ion. Dissekera jonfritt från den omgivande bindväven, med användning av en precisionsbomullspinne och ett par Dumont pincett som använder en spridningsrörelse. Använd pinnen för att suga upp blod från eventuella blödningar.
- För att utföra en ligering skjuta den ena änden av ett enda stycke av krom tarmen nedåt längs pannbenet, mediala till Ion och avancera några millimeter parallellt och underlägsen Ion. Ligaturen hålls nu på plats mellan jon- och pannbenet.
- Slip spetsen av en 45 graders vinklad Dumont pincett enligt jonen för att placera den i omedelbar närhet av ligaturen. Försiktigt dra jonen i sidled för att avslöja ligatur och dricks av tången. Ta tag i ligatur med pincett och dra pincetten i sidled från under jonen. Dra ut ligaturen från orbital håligheten tills båda ändarna av ligaturen är mer eller mindre på samma avstånd från jonen.
- Gör en "ögla" från de två ändarna av ligaturen för att medge perfekt kontroll över graden av sammandragning och skjut knut mot jonen. Skjut knuten vidare att tygla jonen så att diametern av nerven reduceras med en precis märkbar mängd. Göra en normal knut ovanpå glidknut så att mängden av sammandragning förblir konstant (dvs., för att förhindra att slitsen knut glider).
- Skär ligaturer att lämna ungefär 2 mm fria ändar från knuten.
- Upprepa samma procedur (steg från 2,11 till 2,15) för att göra en andra ligering 2 mm avstånd från den första.
- För skenkirurgi, utför steg från 2,2 till 2,10.
- Stäng hårbotten snitt med användning polyester suturer (4-0) och låt råttan att återfå på en uppvärmd dyna. Lämna inte djuret utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt consciousness att upprätthålla sternala VILA och inte tillbaka djuret till sällskap av andra djur tills den är helt återställd.
- För att undvika förebyggande smärtstillande effekter på utvecklingen av neuropatisk smärta, inte administrera smärtlindring för postoperativ smärta.
3. Behavioral Testförfarande
- Låt råttor acklimatisera sig under minst 8 dagar till bostadsförhållanden före preoperativ testning.
- Vänja råttor till testproceduren minst en gång dagligen under tre dagar före preoperativ testning.
- Uppförande testning i ett mörkt rum med ljus från en 60 W röd glödlampa svävande 1 m ovanför centrum av testområdet belysning centrum men lämnar omkrets dunkel och resten av rummet mörka.
- Se till att det finns tillräckligt med bakgrundsljud för att minska störningar från plötslig hörselstimulering. Om det behövs, ger vitt brus.
- Observation av ansikte grooming beteende
- Transport en enda råtta från kolonin till testrummet i en täckt plast bur utan sängkläder. Obs: Helst bör detta vara en kort resa med minimala yttre stimuli.
- Placera råttan i en täckt, transparent plast bur utan sängkläder (LxBxH: 24 cm x 14 cm x 17 cm) med en speglad tillbaka framför en videokamera.
- Gör en 10 minuters inspelning av djurets beteende. Under inspelningen, se till att försöks inte är närvarande i testrummet.
- Rengör observations buren innan du placerar nästa djur.
- Kontrollera det inspelade beteende analyseras av en försöks som är blind för den experimentella tillståndet hos råttan.
- Gör ett register över varje yta grooming episod under 10 min inspelning. Obs: Ansikts grooming definieras som rörelsemönster i vilka framtassar bringas i kontakt med ansiktet områden.
- Göra en åtskillnad mellan två typer av ansikts grooming beteende. Om en sekvens varken föregås eller följs avkropp grooming (dvs. grooming av en kropp annat område än det nominella), kategori episoden som isolerade ansikte grooming. Om kroppen grooming utförs omedelbart före eller efter ansikte grooming, kategori episoden som ansiktet grooming under kroppen grooming.
- Bestäm antalet ansiktet grooming episoder.
- Kategori en tidsperiod mellan ansikte grooming åtgärder som inte överstiger 4 sekunder som en intra-episod utrymme (dvs, en paus mellan ansikte grooming åtgärder inom en och samma episod).
- Kategori en tidsperiod mellan ansikte grooming åtgärder som överstiger 4 sekunder som en inter-episod utrymme (dvs en komplett avbrott i ansiktet grooming åtgärder mellan två episoder).
- Mekanisk stimulering testning
- Transport råttor i grupper på upp till 6 djur från kolonin till provrummet i en täckt bur med strö. Se till att det är en kort resa med minimala yttre stimuli.
- Placeraråttor individuellt i genomskinliga plastburar med strö (LxBxH: 24 cm x 14 cm x 17 cm) med ett ledat lock så att den lätt kan öppnas och stängas.
- Använd en graderad serie av fem von Frey-hår. Obs: Den kraft som krävs för att böja hår är 0,015 g, 0,127 g, 0,217 g, 0,745 g och 2,150 g.
- Vänja råttorna till observations buren och nå rörelser under 10 minuter. Varje 30 sekund, öppna locket och försiktigt vidröra väggen av buren med en plaststav.
- När djuret är i en sniffa / ingen rörelsetillstånd (dvs med fyra tassar placerad på marken, varken rörliga eller frysa, men uppvisar sniffa beteende), tillämpa första von Frey hår inom ION territorium nära centrum av vibrissal dynan å hårig hud som omger mystacial vibrissae.
- Score svaret hos djuret till stimulering för att tillhöra en av följande svarskategorier 4.
- Kategori en total brist på svar sompoäng 0.
- Kategori en stimulans detektering (dvs., vänder råttan huvudet mot stimulerande objektet och stimulus objektet därefter undersökas) som poäng 1.
- Kategori ett uttag reaktion (dvs.. Vänder råtta huvudet sakta bort eller drar den raskt bakåt när stimulering appliceras, ibland en enda ansikte torka ipsilateralt den stimulerade området inträffar) som poäng 2.
- Kategori en flykt / attack respons (dvs.. Undviker råtta ytterligare kontakt med den stimulans objektet antingen passivt genom att flytta sin kropp bort från stimulerande föremålet att inta en hukande ställning mot buren väggen, eller aktivt genom att angripa den stimulans objekt, vilket gör bita och greppa rörelser) som poäng 3.
- Kategori asymmetriska ansikte grooming (dvs, visar råttan en oavbruten serie av minst tre ansikte tvätta slag riktade mot stimulerade ansiktet) som poäng 4.
- Inom varje djur, applicera stimuli i en stigande ordning av intensitet. Efter en stimulusintensitet har tillämpats på en sida, tillämpa den på andra sidan innan vi går vidare till nästa stimulusintensitet. Slumpmässigt i vilken ordning de ipsilaterala och kontra sidor stimuleras. Observera att djuret måste vara i en sniffa / ingen förflyttning tillstånd före varje stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ion-CCI-råttor visar en stark postoperativ ökning av mängden tid som spenderas på isolerad ansikte grooming (Figur 1). Ökningen topparna i slutet av den första postoperativa veckan och sedan avtar under de följande veckorna. De senaste studier har funnit ansikte grooming ökas avsevärt i upp till tre veckor. Face grooming beteende hos skenopererade råttor är mer eller mindre opåverkade.
Ion-CCI råttor visar också en nästan fullständig brist på lyhördhet för ipsilateral mekanisk stimulering av Ion territorium under första postoperativa veckan (Figur 2). Under nästa vecka, detta hyporespons ersättas med en hyperreaktivitet. Uppkomsten av hyperreaktivitet kan variera mellan råttor, vilket framgår av den ökande medelvärden och minskande variation. Hyperreaktivitet har visat sig kvarstå upp till 120 dagar efter operationen. Det finns också en liten ökning av lyhördhet för contralateral mekanisk stimulering i jon-CCI-råttor, men det kan vara knappt statistiskt signifikant från den i skenopererade råttor.
. Figur 1. Post-operativa förändringar i isolerade ansikte grooming beteende efter Ion-CCI Datapunkter representerar medelvärdet (± SEM, n = 12 per grupp) tid som tillbringas på isolerade ansikte grooming (A) och medelvärdet (± SEM; n = 12 per grupp) antal isolerade ansikte grooming episoder (B) en dag innan Ion kirurgi (pre) och postoperativa dagar 5 till 26.
. Figur 2. Post-operativa förändringar i lyhördhet för mekanisk stimulering efter Ion-CCI Datapunkter representerar medelvärdet (± SEM; n= 12 per grupp) svar poäng till von Frey hår stimulering av ligerade Ion territorium en dag före jon kirurgi (Pre) och postoperativa dagar 4-15 (anpassad från Deseure et al, 2003).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mest intressanta aspekten av Ion-CCI modellen är att den ger en unik mått på spontan, icke-framkallade (neuropatisk) smärta. De flesta djurstudier av neuropatisk smärta med spinal nerv modeller, uteslutande riktar nocifensiva beteenden (t ex., Läte och uttags svar), vilket återspeglar överkänslighet mot mekaniska eller termiska stimuleringar 12. Men är den främsta kliniska klagomål hos patienter pågående smärta, inte hyperalgesi eller allodynia 13.
Den nuvarande artikeln beskrivs två mått på neuropatisk smärta efter Ion-CCI, isolerade ansikte grooming (spontan smärta) och mottaglighet för von Frey hår stimulering (mekanisk allodyni). Andra mått på neuropatisk smärta beteende efter jon-CCI har också beskrivits på andra håll, dvs termisk hyperalgesi 14 och kall allodyni 15. Dessutom nyutvecklade metoder för orofacial smärtbedömning som Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) 16-17 eller måltid varaktighet som ett mått på orofaciala nociceptiva svar 18, kan visa sig vara värdefulla åtgärder av smärta efter Ion-CCI.
Denna artikel beskriver en intra-orbital förhållningssätt till jonen. Observera att två andra metoder, det vill säga, en perifer strategi via ett snitt i den håriga huden kaudalt om vibrissal pad och en intraoral strategi, är också möjliga. Även den perifera tillvägagångssättet är den absolut enklaste tekniken, har intra-orbital tillvägagångssätt den klara fördelen att lämna fina muskulaturen som styr vibrissal rörelser intakt och kanske ännu viktigare, undviker det ett snitt lindad i territorium den skadade nerven som kan allvarligt hämma sensorisk testning i regionen. Andra författare har framgångsrikt tillämpat intraorala strategi 14. Emellertid den nära kontakten mellan den ventrala sidan av jonen och en benig ås vid den ventrala änden av maxillary ben gör intraorala tillvägagångssätt verkar mer komplicerat för oss och kirurgiskt utmanande än intra-orbitala strategi.
Med tanke på närheten till det kirurgiska fältet till mynningen av råtta, anestesi via ip-injektion (ic pentobarbital) valdes över inhalationsanestesi (t.ex. isofluran). Men med tanke på nackdelarna med pentobarbital, såsom risk för överdosering, andningsdepression, uppbyggnad av vätska i övre luftvägarna, andra anestesimedel eller ens inhalationsanestesi via en gas anestesi mask för stereotaktiska ramar, kan övervägas. I vår erfarenhet, noggrann dosering, snabb administrering av atropin så snart djuret blir sövd (även delvis), korrekt underhåll av kroppstemperatur, och aspiration av vätskor från de övre luftvägarna minimerar riskerna med pentobarbital.
Variabilitet mellan Ion-CCI-råttor i en mängd avansikte trimning beteende kan vara ganska hög. Nyligen har det visat sig att en del av denna variation kan elimineras genom att observera råttor oftare 9. Två gånger dagliga observationer ökade signifikant statistisk kraft, vilket minskar antalet djur som behövs. Svar på von Frey hår stimulering av Ion territorium kategoriseras enligt en serie av rang-beställda kategorier beskrivande svar (se ovan). Det kan betraktas som en nackdel att uppgifterna bör analyseras nonparametrically och representeras av nonparametric centralmått (t.ex. median) och variations (t.ex. interquartiles). Det har hävdats att resultaten av parametrisk analys visar en mycket god överensstämmelse med de nonparametric analys och att median poäng misslyckas att på lämpligt sätt visualisera effekterna av experimentella betingelser på svars betyg 10.
De huvudsakliga användningsområdena för jon-CCI-modellen är i phargiska tester av befintliga eller nyutvecklade smärtstillande läkemedel, utveckling av nya behandlingsstrategier och studiet av de patofysiologiska mekanismer som är involverade i utveckling och underhåll av (trigeminus) neuropatisk smärta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chromic catgut | Dynek | CG504 | |
| Nembutal (pentobarbital) | Pharmacy | ||
| Atropine | Pharmacy | ||
| Clippers for small animals - Favorita II | Aesculap | GT104 | |
| Stereotaxic instrument | Stoelting | 51600 | |
| Ophthalmic ointment (Liposic) | Pharmacy | ||
| Homeothermic monitor system | Harvard Apparatus | PY8 50-7221-F | |
| Cotton applicator | Pharmacy | ||
| Precision cotton swab | Qosina | 10225 | |
| Operation microscope | Kaps | SOM 62 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45) | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Scissors - blunt tips | Fine Science Tools | 14574-09 | |
| Polyester sutures - Mersilene (4-0) | Ethicon | R871H | |
| Digital video camera | Sony | HDR-CX330E | |
| Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit | Stoelting | 58011 |
References
- Jensen, T. S., Gottrup, H., Sindrup, S. H., Bach, F. W. The clinical picture of neuropathic pain. Eur J Pharmacol. 429 (1-3), 1-11 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Neuropathic pain a multidimensional burden for patients. Eur J Pain. 5 (4), 379-389 (2001).
- Meyer Rosberg, K., et al. Comparison of the SF 36 and Nottingham Health Profile in patients with chronic neuropathic pain. Eur J Pain. 5 (4), 391-403 (2001).
- Vos, B. P., Strassman, A. M., Maciewicz, R. J. Behavioral evidence of trigeminal neuropathic pain following chronic constriction injury to the rats infraorbital nerve. J Neurosci. 14, 2708-2723 (1994).
- Clavelou, P., Pajot, J., Dallel, R., Raboisson, P. Application of the formalin test to the study of orofacial pain. Neurosci Lett. 103, 349-353 (1989).
- Vos, B. P., Hans, G., Adriaensen, H. Behavioral assessment of facial pain in rats face grooming patterns after painful and non-painful sensory disturbances in the territory of the rats infraorbital nerve. Pain. 76 (1-2), 173-178 (1998).
- Deseure, K. R., Adriaensen, H. F. Comparison between two types of behavioral variables of non evoked facial pain after chronic constriction injury to the rat infraorbital nerve. Comp Med. 52 (1), 44-49 (2002).
- Deseure, K., Adriaensen, H. Nonevoked facial pain in rats following infraorbital nerve injury a parametric analysis. Physiol Behav. 81 (4), 595-604 (2004).
- Deseure, K., Hans, G. Behavioral study of non evoked orofacial pain following different types of infraorbital nerve injury in rats. Physiol Behav. 138, 292-296 (2015).
- Deseure, K., Koek, W., Adriaensen, H., Colpaert, F. C. Continuous administration of the 5 hydroxytryptamine1A agonist (3-Chloro-4-fluoro-phenyl)-[4-fluoro-4-[[(5-methyl-pyridin-2-ylmethyl) -amino]-methyl]piperidin-1-yl]-methadone (F 13640) attenuates allodynia like behavior in a rat model of trigeminal neuropathic pain. J Pharmacol Exp Ther. 306 (2), 505-514 (2003).
- Zimmerman, M. Ethical Guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 16, 109-110 (1983).
- Mogil, J. S., Crager, S. E. What should we be measuring in behavioral studies of chronic pain in animals. Pain. 112 (1-2), 12-15 (2004).
- Backonja, M. M., Stacey, B. Neuropathic pain symptoms relative to overall pain rating. J Pain. 5 (9), 491-497 (2004).
- Imamura, Y., Kawamoto, H., Nakanishi, O. Characterization of heat hyperalgesia in an experimental trigeminal neuropathy in rats. Exp Brain Res. 116, 97-103 (1997).
- Chichorro, J. G., Zampronio, A. R., Souza, G. E., Rae, G. A. Orofacial cold hyperalgesia due to infraorbital nerve constriction injury in rats reversal by endothelin receptor antagonists but not non steroidal anti inflammatory drugs. Pain. 123 (1-2), 64-74 (2006).
- Kramer, P. R., Bellinger, L. L. Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents. J Vis Exp. (83), e50745 (2014).
- Rossi, H. L., et al. Characterization of bilateral trigeminal constriction injury using an operant facial pain assay. Neuroscience. 224, 294-306 (2012).
- Anderson, E. M., et al. Use of the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) to Measure Changes in Nociceptive Behavior. J Vis Exp. (76), 50336 (2013).
