Summary
Dit manuscript beschrijft een methode om te kwantificeren tumor cel accumulatie in de longen in een diermodel van uitzaaiing van de tumor.
Abstract
Voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen bestuur tumor metastase, verschillende testen met behulp van de muis als een dier model voorgesteld. Hier tonen we een eenvoudige test om te evalueren van de tumor cel extravasation of micrometastasis. In deze test, tumorcellen waren geïnjecteerd door de ader van de staart, en na een korte periode, de longen werden ontleed en verteerd om te tellen de geaccumuleerde gelabelde tumorcellen. Deze test wordt overgeslagen de eerste stap van primaire tumor invasie in het bloedvat en vergemakkelijkt de studie van gebeurtenissen in het verre orgaan waar de uitzaaiing van de tumor zich voordoet. Het aantal cellen in het bloedvat geïnjecteerd kan worden geoptimaliseerd om te zien hoe een beperkt aantal metastasen. Er werd gemeld dat stromale cellen in het verre orgel aan metastase bijdragen. Dus zou deze test een nuttig instrument om te verkennen potentiële therapeutische drugs of apparaten voor preventie van uitzaaiing van de tumor.
Introduction
Tumor metastase rekeningen voor de hoge sterfte in kanker-gerelateerde ziekten. Vanuit het oogpunt van onderzoek op moleculair niveau, metastase kan worden onderverdeeld in meerdere stappen: tumor inleiding op de primaire tumor site, de groei van de primaire tumor en de invasie in de omringende weefsels, intravasation, omloop door de bloedvaten , extravasation op verre organen en tumor uitgroei. Elke stap impliceert verschillende soorten moleculen/signalen1.
Studies tot op heden zijn bezorgd met gebeurtenissen die plaatsvinden in verre organen voordat de tumorcellen circuleren in het bloed, die ook bekend staat als de pre metastatische fase2,3,4,5, 6. Onze muis model studies is gebleken dat de vooraf metastatische fase Long metastase vergemakkelijkt door het creëren van duurzame en low-level inflammatoire reacties in de longen. De vooraf metastatische fase wordt gekenmerkt door hyperpermeability van themicrovasculature, werving van afgeleid beenmergcellen (BMDC), en opregulatie van cytokine/chemokine-achtige moleculen met inbegrip van S100A8 en SAA33,4 . Er werd gemeld dat lysyl-oxidase wijzigt de extracellulaire matrix in de longen te werven BMDCs7. Een ander rapport is gebleken dat het belang van Angpt2, MMP3 en MMP10 in de vooraf metastatische fase8. Met andere woorden, de complexe interacties tussen primaire tumoren, beenmerg en externe organen moeten worden begrepen en correct gemoduleerd (bijvoorbeeld door het gebruik van drugs die gericht zijn op eiwitten die betrokken zijn in deze interacties) om te voorkomen dat toekomstige metastase9 . Voor het regelen van de vooraf metastatische fase, moet eerst worden gevisualiseerd en voor diagnostische of therapeutische interventies geëvalueerd. Wij rapporteren hier, een Long tumor cel aanwerving assay waarmee de studie van de vooraf metastatische fase in de longen.
Tumorcellen direct geïnjecteerd in het bloedvat van de muis zijn vergelijkbaar met de circulerende tumorcellen bij kankerpatiënten, hoewel er verschillen tussen gekweekte cellen zijn kunnen en circulerende tumorcellen. Circulerende tumorcellen ondergaan zich enkele karakteristieke wijzigingen bij het invoeren van verkeer van de primaire tumor. Gekweekte cellen vormen echter kunnen tumoren in immunodeficiëntie muizen wanneer ze worden geïnjecteerd in de ader van de staart. Daarnaast, in de muis modelsysteem, kan fluorescentie label tumorcellen worden gebruikt waarmee het volgen van deze cellen in het lichaam. Het gedrag van de circulerende tumorcellen is cruciaal omdat zij de uiteindelijke gevolgen van kanker patiënten10 bepalen. Bloed is niet een goede plek om te overleven van tumor cellen2. Ze moeten ontsnappen uit de aanval door het immuunsysteem van de gastheer en anti-apoptotic signalen om te voorkomen dat apoptosis als gevolg van een gebrek aan fysieke ondersteuning. Tumorcellen met hogere capaciteiten van tumor inleiding op metastatische sites genereren meer tumor knobbeltjes. Als de tumorcellen Toon specifieke orgel tropisme, moet metastase in die specifieke organen worden geobserveerd. De eerste stappen van de metastatische cascade (primaire tumorgroei en invasie) zijn niet inbegrepen in deze test, en zo de nadruk ligt op de interactie tussen het circulerende tumorcellen en de stromale cellen (endotheliale cellen, epitheliaale cellen en bloedcellen). In conventionele tumor cel injectie testen moeten onderzoekers wachten tot de tumor knobbeltjes groeien tot een tastbare grootte detecteren de metastase. In dit geval worden niet het exacte aantal tumorcellen in het bloedvat gekwantificeerd. Dit proces omvat bovendien een tumor hergroei fase, die aangeeft dat andere factoren in de tumorcellen van invloed kunnen zijn op het resultaat.
Tellen is met het label tumorcellen onder een fluorescentie stereomicroscoop een eenvoudig proces. De stereomicroscoop biedt een breed gezichtsveld zodat de hele Long kan worden gescand. Stroom cytometry is ook een nuttig hulpmiddel dat direct een nauwkeurige aantal tumorcellen in het weefsel geeft. Fluorescerende cellen in het weefsel onder een confocal microscoop tellen is ook mogelijk en geeft de meest nauwkeurige beelden van metastatische tumorcellen, maar het is tijdrovend en vooringenomen resultaten kan geven als alleen een geselecteerd gebied wordt geteld. Het uiteindelijke doel van deze test is om te observeren hoe gemakkelijk tumorcellen zich ophopen in de longen. Zoals gemeld eerder3,4, als de longen zijn in vooraf metastatische fase als gevolg van inflammatoire signalering van de primaire tumor, zijn de geïnjecteerde tumorcellen gevoelig voor zich ophopen in de longen, dus impliceert hogere kans op longkanker metastase. Andere aandoeningen (reumatoïde artritis, astma, enz.), en hun behandeling met anti-inflammatoire stoffen (zoals anti-TNFα) kan verzachten Long metastase. Dus, we concluderen dat deze bepaling een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van de mogelijkheid van longkanker metastase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures uitgevoerd met muizen werden goedgekeurd door het dier onderzoek Comité van Tokyo vrouwen Medizinische Universität.
1. staart veneuze injectie van Lewis Lung Carcinoma (LLC) cellen
- Handhaven van LLC cellen in DMEM aangevuld met 10% FCS, in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 ° C. Cellen moeten bevatten een fluorescerend eiwit expressie systeem (b.v., GFP).
- Cellen verwijderen uit het cultuur schotel met behulp van een niet-enzymatische cel dissociatie reagens. Volg protocol van de fabrikant.
- Cellen in een tube van 15 mL en centrifuge op 400 x g verzamelen voor 3 min. resuspendeer de cellen in 5 mL PBS door pipetteren en centrifugeren van de buis (400 x g, 3 min). Verwijder vervolgens het supernatant.
- Herhaal deze stap wassen één meer tijd.
- Na de tweede wash, de cellen passeren door een zeef van de cel (40 µm poriegrootte) en resuspendeer in PBS te geven een laatste celdichtheid van 1 x 106 cellen/mL.
- Injecteren van 0,1 mL celsuspensie (1 x 105 cellen, 29 G naald) in elke C57BL/6 muis (8-10 week oude mannetjes) via de ader van de staart.
2. isolatie van de longen en het tellen van de cellen onder een stereomicroscoop fluorescentie
- De muizen bij CO2 inademing euthanaseren.
- Verwijder de huid op het ventrale oppervlak van de borst met een schaar. Snij vervolgens de ribben en het middenrif naar de borstholte bloot. PBS (100 cmH2van O, totale 15 mL) via de rechterventrikel met een gevleugelde infusie 25 G naald en de buis spoelen.
- Knip het hart en de thymus. Grip van de luchtpijp met een tang en optrekken, ontrafeling van het bindweefsel rond de luchtpijp met een schaar. Ontleden uit de longen en was ze in PBS.
- Losmaken elke kwab en observeren onder een fluorescentie stereomicroscoop.
3. lung spijsvertering
- Los 10 mg collagenase, 10 mg dispase en 10 µg DNase in 10 mL serumvrij DMEM. Filtreer door een 0,22 µm spuit filter ter voorbereiding van de enzymatische spijsvertering-oplossing.
- De geïsoleerde caudal lobe dobbelstenen met een schaar. Leg de stukjes van de Long in een 10 mL spuit, gevolgd door de plunjer.
- Gecombineerd de spijsvertering-oplossing (5 mL) in de injectiespuit door terug te trekken op de plunjer. Werken de zuiger omhoog en omlaag totdat de Long in de oplossing zinkt. Dan de longen en de spijsvertering buffer te plaatsen in een tube van 50 mL.
- Schud de buis gedurende 15 minuten bij 37 ° C op een wederzijdse shaker (150 rpm). Longen kunnen tijdens deze incubatie gescheurde geworden.
- Pipetteer op en neer totdat longkanker cellen volledig zijn verspreid. Schud de buis voor de extra 30 minuten bij 37 ° C op een wederzijdse shaker (150 rpm).
- De longkanker cellen passeren een 40 µm cel zeef. Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 3 minuten.
4. Stroom Cytometry van longkanker cellen
- Los 100 mg BSA in 10 mL PBS en filter door een 0,22 µm spuit filter te bereiden PBS - 1% BSA.
- Verwijder de bovendrijvende vloeistof van het monster verkregen bij stap 3.6 met behulp van een precisiepipet en voeg toe 2 mL rode bloedcellen lysis van de oplossing. Dan draai naar beneden de cellen bij 400 x g gedurende 3 min. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de cellen in 5 mL PBS - 1% BSA door pipetteren en centrifugeren van de buis (400 x g, 3 min). Verwijder het supernatant.
- Herhaal deze stap wassen één meer tijd.
- Cellen in 1 mL PBS - 1% BSA schorten en passeren een nieuwe 40 µm cel zeef.
- Het analyseren van de cellen met een cytometer van de stroom te tellen van de tumorcellen (met behulp van de filter setup FL1 voor GFP-LLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De longen presenteren veel GFP-LLC cellen 2 h na injectie (figuur 1A). Opgemerkt moet worden dat de fluorescerende vlekken ook gedetecteerd in de rode filter moeten worden uitgesloten van de cel nummer tellen. De overgrote meerderheid van de LLC cellen verdwijnen uit de longen 24u na injectie (Figuur 1 c).
Om te bevestigen het nummer van het GFP-LLC in de longen, kan een van de lobben stroom cytometrische p.a. (Figuur 2) worden gebruikt.
Figuur 1 : Detectie van GFP-LLC cellen onder een fluorescentie stereomicroscoop. (A) de longen zijn geïsoleerde 2 h (A: filter GFPLP, B: filter ingesteld ET/CY3) of 24 h (C: filter GFPLP, D: filter ingesteld ET/CY3) na injectie van 3 x 104 GFP-LLC cellen. Onder C, is een GFP-LLC-cel gemarkeerd met een gele pijl. De plekken die gemarkeerd door blauwe pijlen zijn niet GFP-LLC cellen. Schaal balk geeft aan 750 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Stroom cytometry analyse van longkanker cellen. (A) en (B); Flow cytometrische analyse GFP-LLC cellen die worden gebruikt voor staart-veneuze injectie. Om uit te sluiten van de dode cellen bevatte de opschorting van de cel buffer propidium jodide (1 µg/mL). (A) toont FSC vs. SSC plot, en cellen in het gebied van (C) zijn ontwikkeld in (B) om te laten zien van de FL1 vs. FL3 plot. Cellen in het gebied (D) worden beschouwd als GFP-LLC cellen. (E) en (F); Dot plots caudal lobe cellen geïsoleerd 24u na de staart veneuze injectie. Het GFP-LLC cellen worden waargenomen in de regio (D). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voorbehandeling van muizen met antilichamen, drugs, een vetrijke dieet of tumor-geconditioneerd medium vóór tumor cel injectie is mogelijk. De moeilijkste stap in deze test is de staart veneuze injectie. Onvolledige injectie leidt tot twijfelachtige gegevens. De ader van de staart in C57BL/6 is bijzonder moeilijk te identificeren, wat resulteert in mislukte injecties. Plaatsen van de muizen op een verwarming pad (37 ° C) verwijden helpt de staart ader zodat injectie gemakkelijker wordt.
Deze test gebruikt een groot aantal (1 x 104 - 1 x 10,5) tumorcellen, die is veel groter dan die bij de patiënt bloed waargenomen. Een eenmalige injectie van dergelijke een groot aantal van de cellen kan teweegbrengen van ongewenste reacties van de host-dieren. In de fluorescentie stereo microscopie tellen, tumorcellen diep in het weefsel zijn moeilijk te detecteren. In de stroom cytometry analyse, zijn longen volledig verteerd om te tellen van de tumorcellen in de longen. Dit proces veroorzaakt verlies van waardevolle informatie over de locatie van de cel van de tumor (binnen of buiten het bloedvat). Integendeel, detectie van tumorcellen onder een fluorescentie van de confocal microscoop kan de onderscheidende tumor van cellen in het bloedvat van de anderen10.
Fluorescentie stereo microscopie is een zeer eenvoudige methode. Het gebruik van stroom cytometry rekenen de tumorcellen heeft geen bias in vergelijking met Microscoop scannen. Het is mogelijk om te scannen hele Long secties onder een confocal fluorescentie Microscoop; echter, de bepaling zullen dan moeizaam. Andere soorten tumorcellen of stromale cellen mogen worden vermengd met de ingespoten tumorcellen. Co injectie van kanker-geassocieerde cellen verbetert de mogelijkheid van metastase. De tumor metastase tarief is sterk afhankelijk van het type van de cel van de tumor en het dier gebruikt.
Zoals hierboven vermeld, is de meest kritische stap in dit protocol de staart veneuze injectie. Een nauwkeurige aantal cellen moet worden geïnjecteerd met geen lekkage, maar is technisch moeilijk. Zorgvuldig observeren dat kan de hanteren door geschoolde onderzoekers zijn van grote hulp.
Een reeks muis model studies hebben gemeld dat 20% van de geïnjecteerde tumorcellen onderging extravasation, 3% van hen gevormd micrometastasen en slechts 0,02% ontwikkeld tot tastbare metastatische knobbeltjes2. In het geval van GFP-LLC cel injectie (3 x 104 cellen), werden 150-300 GFP-LLC cellen ontdekt door stroom cytometry analyse in de caudal lobe geïsoleerd 2 h na injectie. Het totale aantal GFP-LLC in de longen wordt uitgegaan worden van 600-1200, die aangeeft dat de 2-4% van de geïnjecteerde cellen bleef levend. Deze verhouding verlaagt in een tijd-afhankelijke manier3,11. De andere cellen worden verondersteld te ondergaan apoptosis wegens gebrek aan fysieke ondersteuning of voeding, of als gevolg van uitsluiting door het immuunsysteem. In onze recente gegevens, 24 uur na de injectie van GFP-LLC (6 x 104 cellen), het aantal GFP-LLC in de longen bleek te zijn ongeveer 20. Deze resultaten kunnen worden beïnvloed door de stam van de muis, tumor cel en andere factoren. Bijvoorbeeld, werd er gemeld dat het nummer van de tumorcellen in de longen werd verheven in de vooraf metastatische fase12, of in gen muizen13,14 gemodificeerde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
