Summary
इस पांडुलिपि ट्यूमर मेटास्टेसिस के एक पशु मॉडल में फेफड़ों में ट्यूमर सेल संचय यों तो करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
ट्यूमर मेटास्टेसिस शासी आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, एक मॉडल पशु के रूप में माउस का उपयोग कर विभिन्न assays प्रस्तावित किया गया है. यहां, हम एक सरल परख प्रदर्शन करने के लिए ट्यूमर सेल एक्वेकेशन या माइक्रोएस्टेसिस का मूल्यांकन । इस परख में, ट्यूमर कोशिकाओं पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्शन थे, और एक छोटी अवधि के बाद, फेफड़ों और विच्छेदित थे संचित लेबल ट्यूमर कोशिकाओं गिनती पचा । इस परख रक्त वाहिका में प्राथमिक ट्यूमर आक्रमण के प्रारंभिक कदम रुक जाती है और जहां ट्यूमर मेटास्टेसिस होता है दूर के अंग में घटनाओं के अध्ययन की सुविधा । रक्त वाहिका में इंजेक्शन कोशिकाओं की संख्या मेटास्टेसिस की एक सीमित संख्या का पालन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. यह बताया गया है कि सुदूर अंग में स्ट्रोमल कोशिकाएं मेटास्टेसिस में योगदान देती हैं । इस प्रकार, इस परख एक उपयोगी उपकरण ट्यूमर मेटास्टेसिस की रोकथाम के लिए संभावित चिकित्सकीय दवाओं या उपकरणों का पता लगाने के लिए हो सकता है ।
Introduction
ट्यूमर मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित रोगों में उच्च मृत्यु दर के लिए खाते हैं । आणविक स्तर पर जांच के दृष्टिकोण से, मेटास्टेसिस को कई चरणों में बांटा जा सकता है: प्राथमिक ट्यूमर साइट पर ट्यूमर दीक्षा, प्राथमिक ट्यूमर के विकास और आसपास के ऊतकों में आक्रमण, इंट्रावेशन, रक्त वाहिकाओं के माध्यम से संचलन , दूर के अंगों पर बहिर्वेशन, और ट्यूमर फिर से विकास । प्रत्येक चरण में अणुओं/संकेतों के विभिन्न समुच्चयसम्मिलित हैं ।
तिथि करने के लिए अध्ययन से पहले दूर के अंगों में होने वाली घटनाओं के साथ संबंध किया गया है ट्यूमर कोशिकाओं रक्त में परिसंचारी शुरू, जो भी पूर्व के रूप में जाना जाता है मेटास्टेटिक चरण2,3,4,5, 6. हमारे माउस मॉडल अध्ययनों से पता चला है कि पूर्व-मेटास्टेटिक चरण फेफड़ों में लंबे समय से स्थायी और निम्न स्तर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं बनाने के द्वारा फेफड़ों मेटास्टेसिस की सुविधा. पूर्व मेटास्टेटिक चरण themicrovasculature की हाइपरपारगम्यता की विशेषता है, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं की भर्ती (bmdc), और cytokine के अपरेगुलेशन/S100A8 और SAA33,4 सहित chemokine की तरह अणुओं . यह सूचित किया गया है कि lysyl ऑक्सीडेस फेफड़ों में extracellular मैट्रिक्स को संशोधित करने bmdcs7की भर्ती । एक अन्य रिपोर्ट में प्री-मेटास्टेटिक फेज8में Angpt2, MMP3, और MMP10 के महत्व का पता चला है । दूसरे शब्दों में, प्राथमिक ट्यूमर के बीच जटिल बातचीत, अस्थि मज्जा, और दूरदराज के अंगों को समझा जा करने की जरूरत है और ठीक से संग्राहक (उदाहरण के लिए, दवाओं का उपयोग करके कि इन बातचीत में शामिल प्रोटीन लक्ष्य) भविष्य मेटास्टेसिस को रोकने के लिए9 . पूर्व-मेटास्टेटिक चरण को विनियमित करने के लिए, यह पहले कल्पना की जानी चाहिए और नैदानिक या चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए । यहां, हम एक फेफड़ों के ट्यूमर सेल भर्ती परख कि फेफड़ों में पूर्व मेटास्टेटिक चरण के अध्ययन में सक्षम बनाता है रिपोर्ट ।
ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे माउस के रक्त वाहिका में इंजेक्शन कैंसर रोगियों में ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी के समान हैं, हालांकि वहां सुसंस्कृत कोशिकाओं और परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं के बीच मतभेद हो सकता है । जब वे प्राथमिक ट्यूमर से संचलन में प्रवेश ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी खुद कुछ विशिष्ट परिवर्तन से गुजरना । फिर भी, सुसंस्कृत कोशिकाओं immunoअपूर्ण चूहों में ट्यूमर फार्म कर सकते हैं जब वे पूंछ शिरा में इंजेक्शन कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, माउस मॉडल प्रणाली में, प्रतिदीप्ति लेबल ट्यूमर कोशिकाओं है कि शरीर में इन कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति इस्तेमाल किया जा सकता है । ट्यूमर कोशिकाओं परिसंचारी के व्यवहार के रूप में वे कैंसर रोगियों10में अंतिम परिणाम निर्धारित महत्वपूर्ण है । रक्त ट्यूमर कोशिकाओं2के अस्तित्व के लिए एक अच्छी जगह नहीं है । उन्हें मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा हमले से बचने और शारीरिक समर्थन की कमी के कारण एपोप्टोसिस को रोकने के लिए एंटी-एपोप्टोटिक संकेतों की आवश्यकता होती है । मेटास्टैटिक साइटों पर ट्यूमर दीक्षा के उच्च क्षमताओं के साथ ट्यूमर कोशिकाओं अधिक ट्यूमर पिंड उत्पन्न करते हैं । ट्यूमर कोशिकाओं को विशिष्ट अंग अनुवर्तन दिखाने के लिए, मेटास्टेसिस उन विशेष अंगों में मनाया जाना चाहिए । इस परख में, मेटास्टेटिक झरना (प्राथमिक ट्यूमर विकास और आक्रमण) के प्रारंभिक कदम शामिल नहीं हैं, और इसलिए ध्यान केंद्रित ट्यूमर कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं (endothelial कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, और रक्त कोशिकाओं) परिसंचारी के बीच बातचीत पर है । पारंपरिक ट्यूमर सेल इंजेक्शन assays में, शोधकर्ताओं मेटास्टेसिस का पता लगाने के लिए ट्यूमर पिंड एक ठोस आकार के लिए बढ़ने तक इंतजार करना होगा । इस मामले में, रक्त वाहिनियों में ट्यूमर कोशिकाओं की सही संख्या quantified नहीं किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, इस प्रक्रिया में ट्यूमर regrowth चरण शामिल है, जो यह दर्शाता है कि ट्यूमर कोशिकाओं में अन्य कारक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं ।
एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत लेबल ट्यूमर कोशिकाओं की गिनती एक सरल प्रक्रिया है । stereomicroscope देखने का एक व्यापक क्षेत्र प्रदान करता है ताकि पूरे फेफड़ों को स्कैन किया जा सके । प्रवाह cytometry भी तुरंत ऊतक में ट्यूमर कोशिकाओं की एक सटीक संख्या देता है कि एक उपयोगी उपकरण है । एक संनाभि खुर्दबीन के तहत ऊतक में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की गिनती भी संभव है और मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के सबसे सटीक चित्र प्रदर्शित करता है, लेकिन यह समय लेने वाली है और अगर केवल एक चयनित क्षेत्र गिना जाता है पक्षपातपूर्ण परिणाम दे सकता है. इस परख के अंतिम लक्ष्य को देखने के लिए कितनी आसानी से ट्यूमर कोशिकाओं फेफड़ों में जमा है । के रूप में पहले की रिपोर्ट3,4, फेफड़ों पूर्व मेटास्टेटिक प्राथमिक ट्यूमर से भड़काऊ संकेतन के कारण चरण में हैं, इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं फेफड़ों में जमा करने के लिए प्रवण हैं, इस प्रकार फेफड़ों मेटास्टेसिस की उच्च संभावना का अर्थ. अन्य स्थितियों (रुमेटी गठिया, अस्थमा, आदि), और विरोधी भड़काऊ एजेंटों (जैसे विरोधी tnfα) के साथ उनके उपचार फेफड़ों मेटास्टेसिस attenuate हो सकता है । इस प्रकार, हम निष्कर्ष है कि इस परख फेफड़ों मेटास्टेसिस की संभावना का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है ।
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Protocol
चूहों के साथ प्रदर्शन किया सभी प्रक्रियाओं टोक्यो महिला चिकित्सा विश्वविद्यालय के पशु अनुसंधान समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. लुईस फेफड़ों कार्सिनोमा (LLC) कोशिकाओं की पूंछ नस इंजेक्शन
- dmem में LLC कोशिकाओं को बनाए रखने 10% FCS के साथ पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड 5% सह2 इनकूबेटर में । कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली (जैसे, gfp) शामिल करना चाहिए ।
- एक नॉन-एंजाइमेटिक सेल वियोजन अभिकर्मक का उपयोग करके कल्चर डिश से कोशिकाओं को निकालें । निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करें, और 3 मिनट के लिए ४०० एक्स जी में सेंटरेन्ज करें । पीसीबी की 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पाइपेटिंग द्वारा resuspend, और ट्यूब (४०० एक्स जी, 3 मिनट) को सेंट्रेसेज । फिर, supernatant निकालें ।
- दोहराएं इस धुलाई कदम एक और समय ।
- दूसरा धोने के बाद, एक सेल छलनी (४० μm ताकना आकार) के माध्यम से कोशिकाओं को पारित, और pbs में resuspend 1 x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम सेल घनत्व देने के लिए/एमएल ।
- सेल निलंबन (1 x 105 कोशिकाओं, 29g सुई) प्रत्येक C57BL/6 माउस (8-10 सप्ताह पुराने पुरुषों) में पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्शन के ०.१ मिलीलीटर सुई ।
2. फेफड़ों के अलगाव और एक प्रतिदीप्ति stereomicroscope के तहत कोशिकाओं की गिनती
- सह2 साँस लेना द्वारा चूहों euthanize.
- छाती के अधर सतह पर त्वचा को कैंची से हटा दें । फिर, पसलियों और डायाफ्राम वक्ष गुहा को बेनकाब करने में कटौती । फ्लश पीबीएस (१०० cmh2हे, कुल 15 मिलीलीटर) एक पंखों वाला जलसेक 25g सुई और टयूबिंग के साथ सही वेंट्रिकले के माध्यम से ।
- दिल और थाइमस बाहर कट । संदंश के साथ श्वासनली पकड़, और खींच, कैंची के साथ श्वासनली के आसपास संयोजी ऊतकों विदारक । फेफड़ों बाहर काटना और उंहें pbs में धोने ।
- प्रत्येक पालि को अलग करें और इसे प्रतिदीप्ति स्टीरियोमिकरोस्कोप के नीचे देखें ।
3. फेफड़ों के पाचन
- कोलेजिन के 10 मिलीग्राम, डिटाबेस के 10 मिलीग्राम, और dnase की 10 मिलीलीटर में सीरम मुक्त dmem के 10μg भंग । एक ०.२२ μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर एंजाइमेटिक पाचन समाधान तैयार करने के लिए ।
- कैंची के साथ अलग पुच्छ पालि पासा । एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में फेफड़ों के टुकड़े प्लेस, प्लंजर द्वारा पीछा किया ।
- डुबकी पर वापस खींच द्वारा सिरिंज में पाचन समाधान (5 मिलीलीटर) महाप्राण । डुबकी ऊपर और नीचे संचालित जब तक समाधान में फेफड़ों डूब । फिर, एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में फेफड़े और पाचन बफर रखें ।
- एक पारस्परिक शेखर (१५० rpm) पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए ट्यूब हिला । इस ऊष्मायन के दौरान फेफड़े टटर्ड हो सकते हैं ।
- पिपेट ऊपर और नीचे तक फेफड़ों की कोशिकाओं को पूरी तरह से फैलाया जाता है । एक पारस्परिक शेखर (१५० rpm) पर ३७ डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए ट्यूब हिला ।
- एक ४० μm सेल छलनी के माध्यम से फेफड़ों की कोशिकाओं को पास । 3 मिनट के लिए ४०० एक्स जी पर कोशिकाओं नीचे स्पिन ।
4. फेफड़ों की कोशिकाओं के प्रवाह cytometry
- pbs के 10 मिलीलीटर में bsa के १०० मिलीग्राम भंग और पीबीएस-1% bsa तैयार करने के लिए एक ०.२२ μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर ।
- एक पिपेट का उपयोग करके चरण ३.६ पर प्राप्त नमूने के सतह पर तैरनेवाला निकालें और लाल रक्त कोशिका lysis समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें । फिर, 3 मिनट के लिए ४०० एक्स जी पर कोशिकाओं को स्पिन । सुपरनाटंट छोड़ें ।
- पीसीबी-1% bsa के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को पाइपेटिंग द्वारा पुनर्निर्मित करें, और ट्यूब (४०० एक्स जी, 3 मिनट) को सेंट्रेसेज सुपरनांट को त्याग दें ।
- दोहराएं इस धुलाई कदम एक और समय ।
- pbs-1% bsa के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को निलंबित और एक नया ४० μm सेल छलनी के माध्यम से गुजरती हैं ।
- ट्यूमर कोशिकाओं (gfp-LLC के लिए फ़िल्टर सेटअप FL1 का उपयोग) की गणना करने के लिए एक प्रवाह cytometer के साथ कोशिकाओं का विश्लेषण.
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Representative Results
फेफड़ों के कई gfp-LLC कोशिकाओं 2 एच इंजेक्शन के बाद (चित्रा 1a) मौजूद है । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फ्लोरोसेंट स्पॉट भी लाल फिल्टर में पता लगाया सेल संख्या गिनती से बाहर रखा जाना चाहिए । LLC कोशिकाओं के विशाल बहुमत इंजेक्शन (चित्रा 1c) के बाद फेफड़ों 24 एच से गायब हो जाते हैं ।
फेफड़ों में gfp-LLC की संख्या की पुष्टि करने के लिए, पालियों में से एक प्रवाह cytometric विश्लेषण (चित्रा 2) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
चित्रा 1 : एक प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत gfp-LLC कोशिकाओं का पता लगाने. (क) फेफड़ों अलग कर रहे हैं 2 एच (एक: फ़िल्टर सेट gfplp, बी: फ़िल्टर सेट एट/CY3) या 24 एच (सी: फ़िल्टर सेट gfplp, डी: फ़िल्टर सेट एट/CY3) 3 x 104 gfp-LLC कोशिकाओं के इंजेक्शन के बाद. (C) में, एक gfp-LLC कक्ष एक पीले तीर से चिह्नित है. नीले तीर द्वारा चिह्नित धब्बे gfp-LLC कोशिकाओं नहीं हैं । स्केल बार ७५० μm इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 2 : फेफड़ों की कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण । (क) और (ख); पूंछ शिरा इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता gfp-LLC कोशिकाओं का फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण. मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए कोशिका निलंबन बफर प्रोपिडियम आयोडाइड निहित (1 μg/ (क) fsc बनाम एसएससी प्लॉट दिखाता है, और (C) के क्षेत्र में कोशिकाओं को (ख) FL1 बनाम FL3 प्लॉट दिखाने के लिए विकसित कर रहे हैं । क्षेत्र में कोशिकाओं (डी) gfp-LLC कोशिकाओं माना जाता है. (ङ) और (च); पुच्छ पालि कोशिकाओं के डॉट भूखंड आइसोलेटेड 24 एच पूंछ शिरा इंजेक्शन के बाद. gfp-LLC कोशिकाओं (डी) क्षेत्र में मनाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
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Discussion
ट्यूमर सेल इंजेक्शन से पहले एंटीबॉडी, ड्रग्स, एक उच्च वसा वाले आहार या ट्यूमर-वातानुकूलित माध्यम के साथ चूहों का पूर्व उपचार संभव है । इस परख में सबसे कठिन कदम पूंछ नस इंजेक्शन है । अपूर्ण इंजेक्शन परिणाम अनिर्णायक डेटा में । C57BL/6 में पूंछ शिरा विशेष रूप से, विफल इंजेक्शन में जिसके परिणामस्वरूप की पहचान करने के लिए मुश्किल है । एक हीटिंग पैड (३७ डिग्री सेल्सियस) पर चूहों को रखने में मदद करता है पूंछ शिरा इतना है कि इंजेक्शन आसान हो जाता है चौड़ा करना ।
इस परख की एक बड़ी संख्या का उपयोग करता है (1 x 104 -1 x 105) ट्यूमर कोशिकाओं, जो कि रोगी के रक्त में मनाया से बहुत बड़ा है । कोशिकाओं की इतनी बड़ी संख्या के एक एक बार इंजेक्शन मेजबान जानवरों से अवांछित प्रतिक्रियाओं के बारे में ला सकता है । प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोपी गिनती में, ऊतक के अंदर गहरी ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने के लिए कठिन हैं । प्रवाह cytometry विश्लेषण में, फेफड़ों पूरी तरह से फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं की गणना पचा रहे हैं । इस प्रक्रिया में ट्यूमर सेल स्थान (रक्त वाहिका के अंदर या बाहर) के बारे में मूल्यवान जानकारी की हानि होती है । इसके विपरीत, एक संनाभि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत ट्यूमर कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति देता है दूसरों से रक्त वाहिका में कोशिकाओं के भेद ट्यूमर10.
प्रतिदीप्ति स्टीरियो माइक्रोस्कोपी एक बहुत ही सरल तरीका है । प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं गिनती खुर्दबीन स्कैनिंग के साथ तुलना में कोई पूर्वाग्रह है । यह एक संनाभि प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के तहत पूरे फेफड़ों के वर्गों को स्कैन करने के लिए संभव है; हालांकि, परख तो श्रमसाध्य होगा. ट्यूमर कोशिकाओं या स्ट्रोमल कोशिकाओं के अंय प्रकार के इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं के साथ मिलाया जा सकता है । कैंसर से संबंधित कोशिकाओं के सह-इंजेक्शन मेटास्टेसिस की संभावना को बढ़ाता है । ट्यूमर मेटास्टेसिस दर भारी ट्यूमर सेल के प्रकार और उपयोग किए गए जानवर पर निर्भर करता है ।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम पूंछ शिरा इंजेक्शन है । कोशिकाओं की एक सटीक संख्या के लिए कोई रिसाव के साथ इंजेक्शन की जरूरत है, लेकिन तकनीकी रूप से मुश्किल है । ध्यान से हैंडलिंग कुशल शोधकर्ताओं ने बहुत मदद की हो सकती है ।
माउस मॉडल अध्ययन की एक श्रृंखला की सूचना दी है कि इंजेक्शन ट्यूमर कोशिकाओं का 20% एक्वेकेशन, उनमें से 3% माइक्रोमेटस्टेस का गठन किया गया है, और केवल ०.०२% मूर्त मेटास्टैटिक नोड्यूल2में विकसित की है । gfp-llc सेल इंजेक्शन (3 x 104 कोशिकाओं) के मामले में, 150-300 gfp-llc कोशिकाओं पुच्छ पालि पृथक 2 एच इंजेक्शन के बाद में प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा पाया गया । फेफड़ों में gfp-LLC की कुल संख्या 600-1200 माना जाता है, यह दर्शाता है कि इंजेक्शन कोशिकाओं के 2-4% जीवित रहे । यह अनुपात समय-आश्रित रीति से3,11में घट जाता है । अन्य कोशिकाओं को शारीरिक समर्थन या पोषण, या प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा बहिष्करण के कारण की कमी के कारण एपोप्टोसिस से गुजरना करने के लिए मान लिया जाता है । हमारे हाल के आंकड़ों में, gfp-llc (6 x 104 कोशिकाओं) के इंजेक्शन के बाद 24 ज, फेफड़ों में gfp-llc की संख्या के बारे में 20 पाया गया था । ये परिणाम माउस तनाव, ट्यूमर सेल, और अंय कारकों से प्रभावित हो सकता है । उदाहरण के लिए, यह बताया गया है कि फेफड़ों में ट्यूमर कोशिकाओं की संख्या पूर्व-मेटास्टेटिक चरण12में ऊंचा था, या जीन संशोधित चूहों13,14में ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
कोई नहीं
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Collagenase | Sigma | C6885 | |
Dispase | Gibco | 17105-041 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
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