Summary
Questo manoscritto descrive un metodo per quantificare l'accumulo di cellule del tumore nei polmoni in un modello animale della metastasi del tumore.
Abstract
Per studiare i meccanismi molecolari che regolano la metastasi del tumore, sono stati proposti vari saggi usando il mouse come un animale di modello. Qui, dimostriamo un semplice test per valutare lo stravaso delle cellule di tumore o micrometastasi. In questa analisi, le cellule del tumore sono state iniettate attraverso la vena caudale, e dopo un breve periodo, i polmoni erano dissecati e digeriti per contare le cellule del tumore con etichetta accumulato. Questo test salta il passaggio iniziale dell'invasione del tumore primario nel vaso sanguigno e facilita lo studio di eventi in organi distanti dove si verifica la metastasi del tumore. Il numero di cellule iniettate nel vaso sanguigno può essere ottimizzato per osservare un numero limitato di metastasi. È stato segnalato che le cellule stromal in organi distanti contribuiscano alla metastasi. Così, questo test potrebbe essere uno strumento utile per esplorare il potenziale terapeutici farmaci o dispositivi per la prevenzione della metastasi del tumore.
Introduction
Metastasi del tumore rappresenta alta mortalità nelle malattie legate al cancro. Dal punto di vista delle indagini a livello molecolare, metastasi può essere diviso in più fasi: l'inizio del tumore al luogo primario del tumore, la crescita del tumore primario e invasione nei circostanti tessuti, intravasation, circolazione attraverso i vasi sanguigni , lo stravaso in organi distanti e la ricrescita del tumore. Ogni fase prevede diversi insiemi di molecole/segnali1.
Gli studi fin qui sono stati interessati con eventi che si verificano in organi distanti, prima le cellule tumorali circolanti nel sangue, che è anche conosciuto come la fase pre-metastatico2,3,4,5, 6. I nostri studi di modello del mouse ha rivelato che la fase di pre-metastatica facilita la metastasi del polmone con la creazione di lunga durata e basso livello le risposte infiammatorie nei polmoni. La fase di pre-metastatica è caratterizzata da hyperpermeability di themicrovasculature, reclutamento di cellule di derivazione midollare (BMDC) e il upregulation di citochine/chemochine-come molecole tra cui S100A8 e SAA33,4 . È stato segnalato che lisil ossidasi consente di modificare la matrice extracellulare nei polmoni per reclutare BMDCs7. Un altro rapporto ha rivelato l'importanza della Angpt2, MMP3 e MMP10 nella fase pre-metastatico8. In altre parole, le intricate interazioni tra tumori primari, midollo osseo e organi remoti devono essere capito e correttamente modulata (ad esempio, utilizzando farmaci mirati proteine coinvolte in queste interazioni) per prevenire futura metastasi9 . Per regolare la fase di pre-metastatica, in primo luogo dovrebbe essere visualizzato e valutato per interventi diagnostici o terapeutici. Qui, segnaliamo un'analisi di reclutamento polmonare del tumore delle cellule che consente lo studio della fase pre-metastatico nei polmoni.
Le cellule del tumore iniettate direttamente nel vaso sanguigno del mouse sono simili a fare circolare le cellule del tumore in malati di cancro, anche se ci possono essere differenze tra cellule coltivate e cellule tumorali circolanti. Cellule tumorali circolanti stessi subire alcuni cambiamenti caratteristici quando entrano in circolazione dal tumore primario. Tuttavia, le cellule coltivate possono formare tumori in topi immunodeficienti quando vengono iniettati nella vena caudale. Inoltre, nel sistema modello del mouse, può essere utilizzato fluorescenza etichettato le cellule del tumore che consentono il rilevamento di queste cellule nel corpo. Il comportamento di cellule tumorali circolanti è critico che determinano le estreme conseguenze in cancro pazienti10. Sangue non è un buon posto per la sopravvivenza del tumore le cellule2. Hanno bisogno di fuggire da attacco da sistema immunitario dell'ospite e hanno bisogno di segnali anti-apoptotici per prevenire l'apoptosi dovuto una mancanza di supporto fisico. Le cellule del tumore con maggiore abilità dell'inizio del tumore ai siti metastatici generano più noduli del tumore. Se le cellule tumorali mostrano tropismo organo specifico, metastasi dovrebbe essere osservata in quegli organi particolari. In questa analisi, non sono inclusi i passaggi iniziali della cascata metastatica (crescita primaria del tumore e l'invasione), e così il focus è sull'interazione fra le cellule del tumore e le cellule stromali (cellule endoteliali, cellule epiteliali e le cellule del sangue) di circolazione. Nelle analisi di iniezione delle cellule del tumore convenzionali, i ricercatori devono attendere fino a quando i noduli del tumore crescono a una dimensione tangibile per rilevare la metastasi. In questo caso, il numero esatto delle cellule del tumore nel vaso sanguigno non può essere quantificato. Inoltre, questo processo include una fase di ricrescita del tumore, che indica che altri fattori nelle cellule del tumore possono influenzare il risultato.
Conteggio etichettato le cellule del tumore sotto un microscopio stereoscopico di fluorescenza è un processo semplice. Lo stereomicroscopio fornisce un ampio campo di vista in modo che l'intero polmone può essere scansionato. Citometria a flusso è anche un utile strumento che dà immediatamente un numero preciso di cellule del tumore nel tessuto. Contando le cellule fluorescenti nel tessuto sotto un microscopio confocale è anche possibile e visualizza le immagini più precise delle cellule del tumore metastatico, ma esso richiede tempo e può dare risultati parziale se solo un'area selezionata viene conteggiata. L'obiettivo finale di questo test è quello di osservare come facilmente le cellule del tumore si accumulano nei polmoni. Come riferito precedentemente3,4, se i polmoni sono in fase pre-metastatico a causa della segnalazione infiammatoria dal tumore primario, le cellule tumorali iniettate sono inclini ad accumularsi nei polmoni, così che implica una maggiore probabilità di metastasi del polmone. Altre condizioni (artrite reumatoide, asma, ecc.) e il loro trattamento con agenti anti-infiammatori (ad esempio anti-TNFα) può attenuare la metastasi del polmone. Quindi, possiamo concludere che questo test è un potente strumento per valutare la possibilità della metastasi del polmone.
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Protocol
Tutte le procedure eseguite con i topi sono state approvate da Medical University animale ricerca comitato di Tokyo femminile.
1. iniezione della vena della coda del polmone di Lewis (LLC) delle cellule di Carcinoma
- Mantenere le cellule LLC in DMEM completati con 10% FCS, in un umidificata 5% CO2 incubatore a 37 ° C. Le cellule devono contenere un sistema di espressione della proteina fluorescente (ad es., GFP).
- Rimuovere le cellule dalla piastra di coltura utilizzando un reagente di dissociazione non enzimatica delle cellule. Seguire il protocollo del produttore.
- Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 3 min. Risospendere le cellule in 5 mL di PBS pipettando e centrifugare la provetta (400 x g, 3 min). Quindi, rimuovere il surnatante.
- Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Dopo il secondo lavaggio, passare le cellule attraverso un colino di cella (dimensione dei pori di 40 µm) e risospendere in PBS per ottenere una densità di cella finale di 1 x 106 cellule/mL.
- Iniettare 0,1 mL di sospensione cellulare (1 x 105 celle, ago 29 G) in ogni mouse C57BL/6 (maschi di 8-10 settimane vecchio) tramite vena caudale.
2. isolamento dei polmoni e contando le cellule sotto un microscopio stereoscopico di fluorescenza
- Eutanasia i topi da inalazione di CO2 .
- Togliere la pelle sulla superficie ventrale del torace con le forbici. Quindi, tagliare le costole e il diaframma per esporre la cavità toracica. Filo PBS (100 cmH2O, totale 15 mL) attraverso il ventricolo destro con un ago di 25 G di infusione ad alette e tubi.
- Tagliare il cuore e il timo. Afferrare la trachea con il forcipe e tirare verso l'alto, il tessuto connettivo intorno trachea di dissezione con forbici. Sezionare i polmoni e lavarli in PBS.
- Staccare ogni lobo e osservarlo sotto un microscopio stereoscopico di fluorescenza.
3. polmone digestione
- Sciogliere 10 mg di collagenasi, 10 mg di dispase e 10 µ g di dnasi in 10 mL di DMEM privo di siero. Filtrare attraverso un filtro per siringa da 0,22 µm per preparare la soluzione di digestione enzimatica.
- Tagliare a dadini il lobo caudale isolato con le forbici. Mettere i pezzi di polmone in una siringa da 10 mL, seguita dallo stantuffo.
- Aspirare la soluzione di digestione (5 mL) nella siringa tirando indietro lo stantuffo. Azionare lo stantuffo su e giù fino a che il polmone scende nella soluzione. Quindi, inserire il buffer del polmone e la digestione in un tubo da 50 mL.
- Agitare il tubo per 15 min a 37 ° C in un agitatore reciproco (150 rpm). I polmoni possono diventare brandelli durante questa incubazione.
- Pipettare su e giù fino a quando le cellule del polmone sono completamente dispersi. Agitare il tubo per ulteriori 30 min a 37 ° C in un agitatore reciproco (150 rpm).
- Passare le cellule del polmone attraverso un colino di cella 40 µm. Rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 3 min.
4. flusso Cytometry delle cellule del polmone
- Sciogliere 100 mg di BSA in 10 mL di PBS e filtrare attraverso un filtro per siringa 0,22 µm per preparare PBS - 1% BSA.
- Rimuovere il surnatante del campione ottenuto a passo 3.6 utilizzando una pipetta e aggiungere 2 mL di soluzione di lisi delle cellule di anima rosse. Quindi, lo spin down le cellule a 400 x g per 3 min. eliminare il supernatante.
- Risospendere le cellule in 5 mL di PBS - 1% BSA pipettando e centrifugare la provetta (400 x g, 3 min). Scartare il surnatante.
- Ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta.
- Sospendere le cellule in 1 mL di PBS - 1% BSA e passare attraverso un nuovo filtro cella 40 µm.
- Analizzare le cellule con un citometro a flusso per contare le cellule del tumore (utilizzando filtro installazione FL1 per GFP-LLC).
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Representative Results
I polmoni presentano molte cellule GFP-LLC 2 h dopo l'iniezione (Figura 1A). Dovrebbe essere notato che le macchie fluorescenti anche rilevate nel filtro rosso devono essere escluso dal conteggio del numero di cellulare. La maggior parte delle cellule LLC scomparsa dai polmoni 24 h dopo l'iniezione (Figura 1).
Per confermare il numero della GFP-LLC nei polmoni, uno dei lobi può essere utilizzato per l'analisi cytometric di flusso (Figura 2).
Figura 1 : Rilevazione di GFP-LLC cellule stereo microscopio a fluorescenza. (A) i polmoni sono isolato 2 h (r: filtro impostato GFPLP, b: filtro impostato ET/CY3) o 24 h (GFPLP di set di filtri di c:, d: filtro impostato ET/CY3) dopo l'iniezione di cellule di 3 x 104 GFP-LLC. In (C), una cella di GFP-LLC è contrassegnata da una freccia gialla. I punti contrassegnati dalle frecce blu non sono cellule GFP-LLC. Barra della scala indica 750 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi di flusso cytometry delle cellule del polmone. (A) e (B); Analisi citofluorimetrica delle cellule GFP-LLC utilizzato per iniezione della vena della coda. Per escludere le cellule morte il buffer di sospensione delle cellule contenute ioduro di propidio (1 µ g/mL). (A) Mostra plot FSC vs SSC e cellule nella regione di (C) sono sviluppati (B) per mostrare FL1 vs FL3 trama. Cellule della regione (D) sono considerate essere cellule GFP-LLC. (E) e (F); Piazzole di puntino di lobo caudale cellule isolate 24 h dopo l'iniezione della vena della coda. Le cellule GFP-LLC sono osservate nella regione (D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Pre-trattamento dei topi con anticorpi, farmaci, una dieta ricca di grassi o medio del tumore-condizionato prima dell'iniezione delle cellule del tumore è possibile. Il passo più difficile in questo dosaggio è l'iniezione della vena della coda. Iniezione incompleta provoca dati inconcludenti. La vena della coda in C57BL/6 è particolarmente difficile da identificare, con conseguente iniezioni non riuscite. Ponendo i mouse su un rilievo di riscaldamento (° C 37) aiuta a dilata la vena di coda affinché iniezione diventa più facile.
Questo test utilizza un grande numero di (1 x 104 - 1 x 105) le cellule del tumore, che è molto più grande rispetto a quella osservata nel sangue del paziente. Un'iniezione una tantum di un gran numero delle cellule può provocare risposte indesiderate da ospitare animali. Nella fluorescenza stereo microscopia conteggio, le cellule del tumore dentro il tessuto sono difficili da individuare. In analisi di citometria a flusso, i polmoni sono completamente digeriti per contare le cellule del tumore nei polmoni. Questo processo causa la perdita di informazioni preziose sulla posizione delle cellule del tumore (all'interno o all'esterno del vaso sanguigno). Al contrario, il rilevamento delle cellule del tumore con un microscopio a fluorescenza confocale consente il tumore distintivo delle cellule nel vaso sanguigno dagli altri10.
Stereo microscopia di fluorescenza è un metodo molto semplice. Mediante citometria a flusso per contare le cellule del tumore non ha nessun pregiudizio rispetto con microscopio a scansione. È possibile eseguire la scansione di sezioni del polmone intero sotto un microscopio a fluorescenza confocale; Tuttavia, il test sarà quindi laborioso. Altri tipi di cellule tumorali o cellule stromal possono essere mescolati con le cellule iniettate del tumore. Co-iniezione di cellule cancro-collegata migliora la possibilità della metastasi. Il tasso di metastasi del tumore dipende fortemente dal tipo di cellula del tumore e l'animale utilizzato.
Come accennato in precedenza, il punto più critico in questo protocollo è l'iniezione della vena della coda. Un numero preciso di cellule deve essere iniettato con nessuna perdita, ma è tecnicamente difficile. Osservando attentamente la gestione di ricercatori qualificati può essere di grande aiuto.
Una serie di studi di modello del mouse hanno segnalato che il 20% delle cellule del tumore iniettato ha subito lo stravaso, 3% di loro ha formato i micrometastases, e solo 0,02% sviluppato in noduli metastatici tangibile2. In caso di iniezione di cellule GFP-LLC (3 x 104 cellule), cellule GFP-LLC di 150-300 sono state rilevate dall'analisi di citometria a flusso nel lobo caudale isolato 2 h dopo l'iniezione. Il numero totale di GFP-LLC nei polmoni è considerato uguale a 600-1.200, che indica che 2-4% di cellule iniettate era rimasto vivo. Questo rapporto diminuisce in un modo dipendente dal tempo3,11. Le altre cellule si suppone di andare incontro ad apoptosi dovuto mancanza di supporto fisico o nutrizionale, o a causa di esclusione dal sistema immunitario. In nostri dati recenti, 24 h dopo l'iniezione di GFP-LLC (6 x 104 cellule), il numero di GFP-LLC nei polmoni è stato trovato per essere circa 20. Questi risultati possono essere influenzati dal ceppo del mouse, delle cellule del tumore e altri fattori. Per esempio, è stato segnalato che il numero delle cellule del tumore nei polmoni è stato elevato nella fase pre-metastatico12, o nel gene modifica topi13,14.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Nessuno
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
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