Summary
本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。
Abstract
腫瘍の転移を支配する分子メカニズム解明のため、モデル動物としてマウスを使用してさまざまな試金が提案されています。ここでは、腫瘍細胞の浸潤や微小転移を評価する簡易測定法を示す.この分析では、腫瘍細胞を尾静脈投与と短い期間後肺解剖し、蓄積されたラベル付けされた腫瘍のセルの個数を消化します。このアッセイの血管に原発腫瘍の侵入の最初のステップをスキップして、遠隔臓器転移が発生するイベントの検討が容易になります。転移の限られた数を観察するための血管に注入された細胞の数を最適化できます。それは、遠隔の臓器の間質細胞が転移に貢献することが報告されています。したがって、このアッセイは、潜在的な治療薬や腫瘍転移予防のためのデバイスを探索する便利なツールかもしれない。
Introduction
腫瘍の転移は癌関連疾患の高い死亡率を占めています。分子レベルで調査の観点から転移が複数のステップに分けることができます: 原発腫瘍部位、腫瘍の成長と周囲の組織、intravasation、血管の循環に侵入で腫瘍開始、遠隔臓器や腫瘍の再増殖で血管外漏出。各ステップには、異なる分子/信号の1のセットが含まれます。
研究は、腫瘍細胞が転移前フェーズ2,3,4,5は別名、血の循環を開始する前に、遠く離れた臓器に発生するイベントに注目しました 6。マウス モデル研究では、転移前の相が肺のと低レベルの長期的な炎症性応答を作成することによって肺転移を促進を明らかにしました。転移前の相は themicrovasculature の血管、骨髄由来細胞 (腎不全) の採用、S100A8 と SAA33,4を含むサイトカイン/ケモカインのような分子の発現によって特徴付けられる.そのリジルオキシダーゼ変更黒谷7を募集する肺の細胞外マトリックスといわれています。別のレポートは前転移相8Angpt2、MMP3、および MMP10 の重要性を明らかにしました。つまり、原発性腫瘍、骨髄、およびリモート臓器間の複雑な相互作用を理解し正しく (例えば、によってこれらの相互作用に関与する蛋白質を目標とする薬剤を使用して) 変調必要があります9 今後の転移を防ぐために.転移前の相を調整するため、それする必要があります最初可視化し、診断や治療介入の評価。ここでは、肺の転移前の相の研究を可能にする肺腫瘍細胞募集試験を報告します。
マウスの血管に直接注入する腫瘍細胞は、培養細胞の違いはありますが、癌患者の腫瘍細胞を循環し、循環腫瘍細胞に似ています。原発腫瘍から循環に入るときいくつかの特徴的な変化を受ける循環腫瘍細胞自身。それにもかかわらず、培養細胞は、免疫不全マウスの尾静脈に注入されるとき、腫瘍を形成できます。さらに、マウスの系における蛍光腫瘍細胞を標識使用できます体内でこれらの細胞の追跡を許可します。循環腫瘍細胞の挙動はがん患者10で究極の結果を決定するために重要です。血液は腫瘍細胞2の生存のための良い場所ではないです。彼らは宿主の免疫系による攻撃からの脱出、物理的なサポートの不足のためのアポトーシスを防ぐために抗アポトーシス シグナルを必要とする必要があります。転移巣の腫瘍開始のより高い能力を持つ腫瘍細胞より多くの腫瘍結節を生成します。腫瘍細胞は、特定の臓器親和性を示す、それらの特定の臓器に転移が守らなければ。この分析では、転移の翼列 (原発腫瘍の増殖および浸潤) の最初の手順は含まれていません、循環腫瘍細胞と間質細胞 (内皮細胞、上皮細胞、血液細胞) 間の相互作用にフォーカスがあるので。従来腫瘍細胞注入分析の研究者は腫瘍結節の転移を検出するための具体的なサイズになるまで待たなければなりません。この場合、血管に腫瘍細胞の正確な数を定量化することはできません。さらに、このプロセスには、腫瘍細胞の他の要因が結果に影響を与える可能性がありますを示す腫瘍の再生の段階が含まれています。
カウント標識蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞は単純なプロセスです。個人差は、全肺をスキャンすることができますように、広い視野を提供します。フローサイトメトリーは、また即座に組織に腫瘍細胞の正確な数を与える便利なツールです。共焦点顕微鏡下組織に蛍光セルをカウントも可能です、転移性腫瘍細胞の最も正確な画像が表示されますが、それは時間がかかり、選択した領域がカウントされる場合にのみ偏りのある結果を与える可能性があります。この試金の究極の目標は、腫瘍細胞が肺に蓄積される方法を簡単に観察することです。既に報告されている3,4, 肺前転移段階第一次腫瘍から炎症性シグナル伝達のための場合、注入された腫瘍細胞はこうして肺転移の高い可能性を示唆、肺に蓄積する傾向があります。(慢性関節リウマチ、喘息、等) 他の条件とその治療法 (抗 tnf α) などの抗炎症剤は肺転移を減衰させる可能性があります。したがって、この試金は肺転移の可能性を評価するための強力なツールであることが分かった。
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Protocol
マウスで実行されたすべてのプロシージャは、動物研究委員会の東京女子医科大学によって承認されました。
1. ルイス肺癌細胞 (LLC) の尾静脈注射
- 加湿 5%、10% の FCS を DMEM に LLC 細胞を維持 37 ° C で CO2インキュベーターセルは、蛍光タンパク質の発現システム (例えばGFP) を含める必要があります。
- 培養皿からセルを削除するには、非酵素細胞解離試薬を使用します。製造元のプロトコルに従ってください。
- 3 分ピペットで 5 mL の PBS で細胞を再懸濁します、遠心チューブ (400 × g、3 分) 15 mL チューブで 400 × g で遠心する細胞を収集します。その後、上清を削除します。
- この洗浄工程をあと 1 回繰り返します。
- 第 2 洗浄後セル ストレーナー (40 μ m 孔サイズ) をセルを通過し、1 x 106セル/mL の最終的な細胞密度を与えるため PBS で再懸濁します。
- 各 c57bl/6 マウス (8-10 週古い男性) 尾静脈を介して細胞懸濁液 (1 x 10 の5セル、29 G 針) の 0.1 mL を注入します。
2. 肺と蛍光顕微鏡下で細胞を数えるの分離
- CO2吸入によるマウスを安楽死させます。
- ハサミで胸の腹側表面には、皮膚を削除します。切って、肋骨と横隔膜胸腔内を公開します。翼のある輸液 25 G 針とチューブで右心室を介して PBS (100 cmH2O、合計 15 mL) をフラッシュします。
- 心と胸腺をカットします。鉗子で気管のグリップ、引き上げて、気管周囲の結合織をハサミで切り裂きます。肺を解剖し、PBS で洗浄します。
- 各葉をデタッチして、蛍光顕微鏡下で観察します。
3. 肺消化
- コラゲナーゼ、当期、10 mg および無血清 DMEM の 10 mL の DNase の 10 μ g の 10 mg を溶解します。酵素消化ソリューションを準備する 0.22 μ m シリンジ フィルターをフィルター処理します。
- ハサミで分離された尾葉を刻みます。プランジャーに続いて 10 mL の注射器には、肺の作品を配置します。
- 注射器にプランジャーに引いて消化液 (5 mL) を吸引します。肺がソリューションに沈むまでプランジャーを上下に動作します。その後、50 mL のチューブに肺と消化バッファーを配置します。
- 相互シェーカー (150 rpm) で 37 ° C で 15 分間管を振る。肺は、この潜伏中にボロボロになることがあります。
- ピペットを上下肺細胞が完全に分散するまで。相互シェーカー (150 rpm) で 37 ° C でさらに 30 分の管を振る。
- 40 μ m の細胞のストレーナーを肺の細胞を通過します。3 分間 400 x g で細胞をスピンします。
4. 肺細胞のフローサイトメトリー
- PBS-1 %bsa を準備する 0.22 μ m シリンジ フィルターを介して 10 mL の PBS のフィルターに BSA の 100 mg を溶解します。
- 3.6 ピペットを使用しての手順で得られたサンプルの上清を除去し、赤血球溶解溶液 2 mL を追加します。その後、スピンダウン 400 x g で 3 分間でセルは上澄みを廃棄します。
- ピペットで 5 ml の PBS-1 %bsa の細胞を再懸濁します、遠心チューブ (400 × g、3 分)。上清を捨てます。
- この洗浄工程をあと 1 回繰り返します。
- PBS-1 %bsa の 1 mL の細胞を中断し、新しい 40 μ m の細胞のストレーナを通過します。
- (フィルター セットアップ FL1 を用いた GFP LLC) 腫瘍細胞をカウントする流れの cytometer 細胞を分析します。
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Representative Results
肺は、注入 (図 1 a) 後多くの GFP LLC 細胞 2 h を提示します。また赤のフィルターで検出された蛍光スポットがセル数から除外すべきことに留意。LLC 細胞の大半は肺 24 h から注入 (図 1) 後に消えます。
肺の GFP LLC の数を確認するには、フローサイトメトリーによる解析 (図 2) の葉の 1 つ使用できます。
図 1: GFP LLC の検出の蛍光実体顕微鏡下のセルします。(A) 肺が分離 2 h (a: フィルター セット GFPLP, b: フィルター セット ET/CY3) または 24 h (c: フィルター セット GFPLP、d: フィルター セット ET/CY3) 3 × 104 GFP LLC 細胞の注入後。(C) GFP LLC 細胞は黄色の矢印でマークされます。青色の矢印でマークされたスポットは、GFP LLC 細胞ではないです。スケール バーを示します 750 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 肺細胞のフローサイトメトリー解析します。(A) と (B);尾静脈注射に使用される GFP LLC 細胞のフローサイトメトリーによる解析。死んだ細胞を除外するには、細胞懸濁液バッファーには propidium ヨウ化 (1 μ g/mL) が含まれています。(A) FL1対FL3 プロットを表示するには (B)、FSC の対SSC プロット、および (C) の領域内のセルの開発を示しています。(D) の領域内のセルは、GFP LLC 細胞であると見なされます。(E) 及び (F);尾静脈注射後 24 h を分離した肺細胞のドット プロット。GFP LLC 細胞は (D) の地域で観察されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
マウス抗体、薬、高脂肪の食事療法または腫瘍細胞の注入前に腫瘍エアコン中の前処理が可能です。この試金で最も困難なステップは、尾静脈注射です。不完全な注入は決定的なデータを結果します。C57bl/6 の尾静脈は、失敗した注射の結果を識別し、特に困難です。役立ちます加熱パッド (37 ° C) にマウスを配置する尾静脈注入が容易になるようにを拡張させます。
この試金は、患者の血液よりもはるかに大きいである大型 (1 × 104 - 1 x 10 の5) の数の腫瘍細胞を使用します。細胞のような多数の 1 回注射は、ホスト動物から不要な応答をもたらすかもしれない。蛍光ステレオ顕微鏡カウント、腫瘍細胞の奥深くに組織が検出しにくいです。フロー フローサイトメトリー分析で肺、肺の腫瘍のセルの個数を完全に消化されます。このプロセスは、腫瘍細胞の場所 (血管の内外にかかわらず) に関する貴重な情報の損失を発生します。共焦点レーザー蛍光顕微鏡下で腫瘍細胞の検出により他人から血管内細胞の特徴的な腫瘍、それどころか、10。
蛍光ステレオ顕微鏡は、非常に単純な方法です。腫瘍細胞をカウントするフローサイトメトリーを使用しても、顕微鏡と比較してバイアスはありません。共焦点レーザー蛍光顕微鏡の下の全肺セクションをスキャンすることが可能です。ただし、アッセイは、骨の折れる、なります。異なる種類の腫瘍細胞や間質細胞は、注入された腫瘍細胞と混合する可能性があります。がん関連細胞の共射出は、転移の可能性を向上させます。腫瘍の転移率は腫瘍細胞と使用される動物の種類に大きく依存します。
前述のように、このプロトコルの最も重要なステップは尾静脈注射です。セルの正確な数は漏れを注入する必要があるが技術的に難しい。大きな助けの熟練した研究者による処理を慎重に観察があります。
注入された腫瘍細胞の 20% は、血管外漏出を受けた、3 割形成微小、わずか 0.02% に開発した一連のマウス モデル研究を報告している具体的な転移2。GFP LLC 細胞の注入 (3 x 10 の4セル) の場合 150-300 GFP LLC 細胞は注射後 2 h を分離した尾葉フローサイトメトリー解析によって検出された.肺の GFP LLC の合計数は、600-1,200、挿入されたセルの 2-4% に残った生きていることを示すと見なされます。この比率は、時間依存的3,11に減少します。他の細胞は免疫システムによって物理的なサポート、または栄養の不足のためまたは除外に伴うアポトーシスを受けると見なされます。私たちの最近のデータは、GFP LLC (6 x 104セル) の投与後 24 時間で肺の GFP LLC の数は約 20 ことが判明しました。これらの結果は、マウス緊張、腫瘍細胞、およびその他の要因による影響は。例えば、肺の腫瘍細胞の数が12前転移相に昇格されましたまたは遺伝子の変更マウス13,14報告されています。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
どれも
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
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