Summary
Эта рукопись описывает метод количественной оценки накопления клеток опухоли в легких в животной модели метастазов опухоли.
Abstract
Расследовать молекулярные механизмы, регулирующие метастазов опухоли, были предложены различные анализы, с помощью мыши как модель животных. Здесь мы демонстрируем простой анализа для оценки опухолевых клеток кровоподтек или micrometastasis. В этот assay опухолевые клетки были введены через Вену хвост, и после короткого периода, легких были расчленены и переваривается для подсчета накопленных помечены опухолевых клеток. Этот assay пропускает первый шаг первичной опухоли вторжения в кровеносный сосуд и облегчает исследование событий в далеких органе, где происходит метастазов опухоли. Количество клеток, вводят в сосуд могут быть оптимизированы для наблюдения за ограниченное число метастазов. Сообщается, что стромальных клеток в далеком органа содействовать метастазов. Таким образом этот assay может быть полезным инструментом для изучения потенциальных лекарственных препаратов или устройства для профилактики метастазов опухоли.
Introduction
Метастазы опухоли приходится высокой смертности в заболеваний, связанных с раком. С точки зрения расследования на молекулярном уровне, метастазы можно разделить на несколько этапов: опухоль посвящения в первичной опухоли, рост первичной опухоли и вторжения в окружающие ткани, intravasation, циркуляции через кровеносные сосуды , кровоподтек в отдаленные органы и re рост опухоли. Каждый этап включает в себя различные наборы молекул/сигналы1.
Исследования на сегодняшний день была связана с событиями, происходящими в отдаленных органах, прежде чем начать опухолевые клетки, циркулирующие в крови, который также известен как предварительно метастатического фаза2,3,4,5, 6. Наши мыши модель исследования показали, предварительно метастатическим этап облегчает метастаз в легких путем создания долгосрочных и низкого уровня воспалительных реакций в легких. Предварительно метастатическим фаза характеризуется hyperpermeability themicrovasculature, набор клеток костного мозга производных (BMDC) и upregulation цитокинов/хемокиновых как молекул, включая S100A8 и SAA33,4 . Сообщалось, что что лизил оксидазы изменяет внеклеточного матрикса в легкие, чтобы набрать BMDCs7. Другой отчет показал важность Angpt2, MMP3 и MMP10 в предварительно метастатического этап8. Другими словами, сложные взаимодействия между первичной опухоли, костный мозг и отдаленных органах должны пониматься и модулированных должным образом (например, с помощью лекарств, которые целевых белков, участвующих в этих взаимодействиях) для предотвращения будущих метастазов9 . Регулировать этапа предварительного метастазами, его следует сначала визуализируется и оценены для диагностических или терапевтических вмешательств. Здесь мы приводим assay набора клетки опухоли легких, который позволяет исследование этапа предварительного метастазами в легких.
Опухолевые клетки непосредственно впрыскивается в кровеносный сосуд мыши похожи на циркулирующих клеток опухоли у больных раком, хотя могут существовать различия между культивируемых клеток и циркулирующих клеток опухоли. Циркулирующих клеток опухоли сами проходят некоторые характерные изменения, когда они войти обращения от первичной опухоли. Тем не менее культивируемых клеток могут образовывать опухоли в иммунодефицитных мышей, когда они вводят в Вену хвост. Кроме того в системе модель мыши, флуоресценции помечены опухолевых клеток может использоваться, разрешить отслеживание этих клеток в организме. Поведение циркулирующих клеток опухоли является критическим, поскольку они определяют конечным последствиям в раковых больных10. Кровь не является хорошим местом для выживания опухоли клетки2. Им нужно бежать от нападения принимающей иммунной системы и нуждаются в анти apoptotic сигналы для предотвращения апоптоза из-за отсутствия физической поддержки. Опухолевые клетки с более высокой способности опухоли посвящения в метастатических узлов генерировать больше узелки опухоли. Если клетки тумора тропизм конкретного органа, метастазы должны соблюдаться в тех конкретных органов. В этот assay первые шаги метастатического Каскад (рост первичной опухоли и вторжения) не включены, и поэтому основное внимание уделяется взаимодействию между циркулирующих клеток опухоли и стромальных клеток (эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки и клетки крови). В обычных опухолевых клеток инъекции анализов исследователи должны ждать до тех пор, пока узелки опухоли расти к ощутимым размер для обнаружения метастазов. В этом случае не могут быть количественно точное количество опухолевых клеток в кровеносный сосуд. Кроме того этот процесс включает в себя опухоли фазы отрастания, указав, что другие факторы в опухолевых клетках могут повлиять на исход.
Подсчет помечены опухолевых клеток под стереомикроскопом флуоресценции представляет собой простой процесс. Стереомикроскопом предоставляет широкое поле зрения, чтобы весь легких могут быть проверены. Проточной цитометрии является также полезным инструментом, который мгновенно дает точное количество опухолевых клеток в тканях. Подсчет люминесцентные клеток в тканях под Конфокальный микроскоп также возможен и отображает наиболее точные фотографии метастатические опухоли клеток, но это занимает много времени и может давать предвзятым результаты, если только выбранной области считается. Конечная цель этого анализа заключается в наблюдать, как легко опухолевые клетки накапливаются в легких. Как сообщалось ранее3,4, если предварительно метастатического этапе вследствие воспалительных сигнализации от первичной опухоли легких, вводят опухолевые клетки склонны накапливаться в легких, подразумевая тем самым шансы метастаз в легких. Другие условия (ревматоидный артрит, астма и т.д.) и их лечение с противовоспалительными агентами (например, анти TNFα) может смягчить метастаз в легких. Таким образом мы заключаем, что этот assay является мощным инструментом для оценки возможности легкого метастазов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры выполняются с мышей были утверждены животное исследовательский комитет Токио женщин в медицинский университет.
1. хвост инъекции Вену клеток карциномы (ООО) легкого Льюис
- Поддерживать ООО клетки в DMEM дополнена 10% FCS, увлажненные 5% CO2 инкубатора 37 ° c. Клетки должны содержать флуоресцентный белок выражение системы (например, GFP).
- Удаление ячеек из культуры блюдо с помощью реагента диссоциации неферментативного клеток. Следуйте производителя протокол.
- Соберите клетки в 15 мл трубки и центрифуги на 400 x g 3 мин Ресуспензируйте клетки в 5 мл PBS, закупорить и центрифуги трубки (400 x g, 3 мин). Затем удалите супернатант.
- Повторите этот шаг Стиральная еще один раз.
- После второго мыть пройти клетки через стрейнер клетки (40 мкм поры) и Ресуспензируйте в PBS дать окончательный клеток плотность 1 х 106 клеток/мл.
- Придать каждой мыши C57BL/6 (8-10 недельных самцов) через Вену хвост 0,1 мл суспензии клеток (1 х 105 клеток, 29 G иглы).
2. изоляция легких и подсчета клетки под стереомикроскопом флуоресцирования
- Усыпить мышей вдыханием CO2 .
- Удалите кожу на вентральной поверхности груди с ножницами. Затем вырежьте ребер и диафрагмы подвергать грудной полости. Промойте PBS (100 КМЗ2O, всего 15 мл) через правый желудочек крылатый настой 25 G иглы и трубки.
- Вырежьте из сердца и тимуса. Захват трахеи с щипцами и потяните вверх, рассекает соединительной ткани вокруг трахеи с ножницами. Вскрыть из легких и мыть их в PBS.
- Отсоединение каждого лепестка и наблюдать его под стереомикроскопом флуоресценции.
3. легкого пищеварения
- Растворите 10 мг коллагеназы, 10 мг dispase и 10 мкг DNase в 10 мл сыворотки бесплатно DMEM. Фильтрация через фильтр шприц 0,22 мкм подготовить раствор ферментативного пищеварения.
- Кости изолированных хвостовой лепесток с ножницами. Место частей легкого в 10 мл шприц, а затем поршень.
- Аспирационная пищеварение раствор (5 мл) в шприц, потянув обратно на поршень. Работают плунжера вверх и вниз до тех пор, пока легких погружается в решение. Затем место буфера легких и пищеварения в 50 мл трубки.
- Встряхните трубки для 15 минут при 37 ° C на взаимные шейкер (150 об/мин). Легкие может стать драный во время этой инкубации.
- Пипетка вверх и вниз до тех пор, пока клетки легких полностью рассеяны. Встряхните трубки для дополнительные 30 минут при 37 ° C на взаимные шейкер (150 об/мин).
- Передайте клетки легких через стрейнер клеток 40 мкм. Спин вниз клетки на 400 g x 3 мин.
4. проточной цитометрии клеток легкого
- Растворите 100 мг в 10 мл PBS и фильтра ЗБС через фильтр шприц 0,22 мкм подготовить BSA PBS - 1%.
- Удалить супернатант образца, полученные на шаге 3.6 с помощью пипетки и добавить 2 мл раствора Лизис эритроцитов. Затем спин вниз клетки на 400 g x 3 мин отбросить супернатант.
- Ресуспензируйте клетки в 5 мл PBS - 1% BSA, закупорить и центрифуги трубки (400 x g, 3 мин). Выбросите супернатант.
- Повторите этот шаг Стиральная еще один раз.
- Приостановить клеток в 1 мл раствора БСА PBS - 1% и пройти через стрейнер новой ячейки 40 мкм.
- Анализируйте клетки с проточный цитометр рассчитывать опухолевых клеток (с помощью установки фильтра значения параметров FL1 GFP-ООО).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Легких представляют многие GFP-ООО клетки 2 ч после инъекции (рис. 1A). Следует отметить, что флуоресцентные пятна также обнаружены в красный фильтр должны исключаться из количество клеток. Подавляющее большинство ООО клетки исчезают из легких 24 ч после инъекции (рис. 1 c).
Чтобы подтвердить количество GFP-ООО в легких, одной из долей может использоваться для анализа гранулярных потока (рис. 2).
Рисунок 1 : Обнаружение GFP-ООО клетки под микроскопом стерео флуоресцирования. (A) легких являются изолированные 2 h (A: фильтр установлен GFPLP, набор фильтров B: ET/CY3) или 24 h (GFPLP набор фильтров C:, D: фильтр установлен ET/CY3) после инъекции 3 х 104 GFP-ООО клеток. В (C) GFP-ООО ячейки отмечен желтой стрелкой. Пятна, отмечен синие стрелки не являются GFP-ООО клетки. Указывает, шкалы бар 750 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Cytometry анализ клеток легкого потока. (A) и (B); Анализ потока гранулярных клеток GFP-ООО, используются для инъекции Вену хвост. Чтобы исключить мертвые клетки клетки подвеска буфера содержится пропидий йодидом (1 мкг/мл). (A) показывает, что разрабатываются FSC против SSC сюжет и клетки в регионе (C) в (B) чтобы показать значения параметров FL1 против FL3 сюжет. Клетки в регионе (D) считаются GFP-ООО клетки. (E) и (F); Точка участков клетки хвостовой лепесток, изолированные 24 ч после инъекции Вену хвост. Клетки GFP-ООО наблюдаются в регионе (D). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Возможна предварительная обработка мышей с антителами, наркотиков, высоким содержанием жиров диеты или опухоль кондиционером среднего до инъекции клеток опухоли. Самый трудный шаг в этот assay это инъекции Вену хвост. Неполные инъекции приводит к неопределенным результатом данных. Хвост вен в C57BL/6 особенно трудно определить, что приводит к неудачной инъекции. Размещение мышей на грелку (37 ° C) помогает расширяются вены хвост так, что инъекции становится легче.
Этот assay использует большое количество (1 х 104 - 1 х 105) опухолевых клеток, которая намного больше, чем в крови пациента. Одноразового введения такого большого числа клеток может привести к нежелательных реакций от пребывания животных. В микроскопии флуоресцирования стерео подсчета, опухолевые клетки вглубь ткани трудно обнаружить. В анализе цитометрия потоков легкие полностью усваиваются подсчитать опухолевые клетки в легких. Этот процесс приводит к потере ценной информации о местонахождении опухолевых клеток (внутри или за пределами кровеносного сосуда). Напротив, обнаружение опухолевых клеток под микроскопом конфокальный флуоресценции позволяет отличительный опухолевых клеток в кровеносный сосуд от других10.
Стерео микроскопии флуоресцирования является очень простой способ. С помощью проточной цитометрии для подсчета опухолевых клеток имеет без предвзятости, по сравнению с микроскоп сканирования. Это позволяет сканировать весь легких секции под микроскопом конфокальный флуоресценции; Однако assay затем будет трудоемким. Другие виды опухолевых клеток или стромальные клетки могут быть смешаны с вводят опухолевых клеток. Совместное инъекций связанных рака клеток повышает возможность метастазирования. Скорость метастазов опухоли сильно зависит от типа опухолевых клеток и используется животного.
Как упоминалось выше, наиболее важным этапом в этом протоколе это инъекции Вену хвост. Точное количество клеток должен быть введен с какой-либо утечки, но технически трудно. Внимательно наблюдая обработки квалифицированных исследователей может быть большим подспорьем.
Ряд исследований модель мыши сообщили, что 20% вводят опухолевых клеток прошли кровоподтек, 3% из них формируется микрометастазы и только 0,02% превратился в ощутимые метастатического конкреций2. В случае GFP-ООО инъекции клеток (3 х 104 клетки) 150-300 GFP-ООО клетки были обнаружены cytometry анализ потока в хвостовой лепесток, изолированные 2 ч после инъекции. Предполагается, что общее количество GFP-ООО в легких может быть 600-1200, указав, что 2-4% клеток вводили остался жив. Это соотношение уменьшается в3,образом зависящих от времени11. Предполагается, что другие клетки проходят apoptosis из-за отсутствия физической поддержки или питания, или за счет исключения иммунной системой. В наших последних данных, 24 ч после инъекции GFP-ООО (6 x 104 клетки) количество GFP-ООО в легких оказалась около 20. Эти результаты могут быть затронуты мыши штамм, опухолевых клеток и других факторов. Например сообщалось, что количество опухолевых клеток в легких был возведен в предварительно метастатического этап12, или в гене изменение мышей13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Нет
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
