Summary
Detta manuskript beskriver en metod för att kvantifiera tumör cell ackumulering i lungorna i en djurmodell av tumör metastaser.
Abstract
För att undersöka de molekylära mekanismer som styr tumör metastasering, har olika analyser med hjälp av musen som en modell djur föreslagits. Här visar vi ett enkelt test för att utvärdera tumör cellen extravasering eller micrometastasis. I denna analys, tumörceller injicerades genom svans, och efter en kort period, lungorna var dissekeras och rötas för att räkna de ackumulerade märkt tumörcellerna. Denna analys hoppar över det första steget av primärtumör invasion in i blodkärlen och underlättar studiet av händelser i det avlägsna organ där tumören metastaser uppstår. Antalet celler injiceras i ett blodkärl kan optimeras för att observera ett begränsat antal metastaser. Det har rapporterats att stromaceller i det avlägsna orgeln bidra till metastaser. Denna analys kan således vara ett användbart verktyg för att utforska potentiella terapeutiska läkemedel eller anordningar för förhindrande av tumör metastaser.
Introduction
Tumör metastasering står för hög dödlighet i cancer-relaterade sjukdomar. Från utsiktspunkten utredningar på molekylär nivå, metastaser kan delas in i flera steg: tumör inledande vid primärtumör webbplats, primär tumörtillväxt och invasion in i omgivande vävnader, intravasation, cirkulation genom blodkärlen , extravasering på avlägsna organ, och re-tumörtillväxt. Varje steg innebär olika uppsättningar av molekyler/signaler1.
Studier hittills har sysslar med händelser som inträffar i avlägsna organ innan tumörcellerna börjar cirkulerar i blodet, vilket kallas också pre metastaserande fas2,3,4,5, 6. Våra mus modell studier visade att fasen före metastaserande underlättar lungmetastaser genom att skapa varaktig och lågaktivt inflammatoriskt svar i lungorna. Den pre metastaserande fasen kännetecknas av hyperpermeability av themicrovasculature, rekrytering av härrör benmärgsceller (BMDC) och uppreglering av cytokin/chemokine-liknande molekyler inklusive S100A8 och SAA33,4 . Det har rapporterats att Iysyl oxidas ändrar den extracellular matrisen i lungorna för att rekrytera BMDCs7. En annan rapport har visat vikten av Angpt2, MMP3 och MMP10 i förväg metastaserande fas8. Med andra ord, de intrikata samspelet mellan primära tumörer, benmärg och avlägsna organ behöver förstås och korrekt modulerade (t.ex. genom att använda droger som är avsedda för proteiner involverade i dessa interaktioner) att förhindra framtida metastas9 . För att reglera fasen före metastaserande, ska det först visualiseras och utvärderas för diagnostiska eller terapeutiska interventioner. Här rapporterar vi en lung tumör cell rekrytering analysmetod som möjliggör studier av fasen före metastaserande i lungorna.
Tumörceller direkt sprutas in i blodkärl i musen liknar cirkulerande tumörceller hos cancerpatienter, även om det kan finnas skillnader mellan odlade celler och cirkulerande tumörceller. Cirkulerande tumörceller genomgå själva vissa karakteristiska förändringar när de anger omlopp från den primära tumören. Ändå, odlade celler kan bilda tumörer i nedsatt immunförsvar möss när de injiceras i svansen anda. Dessutom i mus modell systemet, kan fluorescens märkt tumörceller användas som tillåter spårning av dessa celler i kroppen. Beteendet av cirkulerande tumörceller är kritisk, eftersom de avgör de yttersta konsekvenserna i cancer patienter10. Blod är inte en bra plats för överlevnad av tumör celler2. De behöver fly från angrepp av värd immunsystemet och behöver anti-apoptotiska signaler att förhindra apoptos på grund av brist på fysiskt stöd. Tumörceller med högre förmågor av tumör initiering vid metastaserande platser generera mer tumör knölar. Om tumörcellerna visar specifikt organ tropism, bör metastaser observeras i de speciella organ. De första stegen i metastaserande kaskad (primär tumörtillväxt och invasion) ingår inte i denna analys, och så ligger fokus på samspelet mellan cirkulerande tumörceller och stromaceller (endotelceller, epitelceller och blodkroppar). I konventionella tumör cell injektionen analyser har forskare att vänta tills tumören knölar växa till en påtaglig storlek för att upptäcka metastaser. I detta fall kan inte det exakta antalet tumörceller i blodkärlen kvantifieras. Denna process inkluderar dessutom en tumör återväxt fas, vilket indikerar att andra faktorer i tumörcellerna kan påverka resultatet.
Räkna är märkt tumörceller under ett fluorescens-stereomikroskop en enkel process. Stereomikroskopet ger ett brett synfält så att hela lungan kan skannas. Flödescytometri är också ett användbart verktyg som omedelbart ger ett korrekt antal tumörceller i vävnaden. Räkna fluorescerande celler i vävnaden under confocal Mikroskop är också möjligt och visar de mest exakta bilderna av metastaserande tumörceller, men det är tidskrävande och kan ge partisk resultat om bara ett markerat område räknas. Det yttersta målet för denna analys är att iaktta hur lätt tumörceller ansamlas i lungorna. Som rapporterats tidigare3,4, om lungorna är i pre metastaserande fas på grund av inflammatoriska signalering från den primära tumören, är injiceras tumörceller benägna att ansamlas i lungorna, vilket innebär större chanser att lungmetastaser. Andra förhållanden (reumatoid artrit, astma, etc.), och deras behandling med antiinflammatoriska medel (såsom anti-TNFα) kan dämpa lungmetastaser. Således sluta vi att denna analys är ett kraftfullt verktyg för att bedöma möjligheten av lungmetastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer utförs med möss godkändes av djur forskning kommittén av Tokyo Women's Medical University.
1. svans ven injektion av Lewis Lung carcinom (LLC) celler
- Upprätthålla LLC celler DMEM kompletteras med 10% FCS, i en fuktad 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Cellerna bör innehålla en fluorescerande protein uttryck systemet (t.ex. god Jordbrukarsed).
- Ta bort celler från kultur maträtt med en icke-enzymatiska cell dissociation reagens. Följ tillverkarens protokollet.
- Samla in celler i en 15 mL rör och centrifugera vid 400 x g för 3 min. Omsuspendera cellerna i 5 mL PBS av pipettering och centrifugera röret (400 x g, 3 min). Ta sedan bort supernatanten.
- Upprepa detta tvätt en gång.
- Efter den andra tvätten, passera cellerna genom en cell sil (40 µm porstorlek) och återsuspendera i PBS att ge en sista cell densiteten 1 x 106 celler/ml.
- Injicera varje C57BL/6 mus (8-10 vecka gamla hanar) via svans venen 0,1 mL cellsuspension (1 x 105 celler, 29 G nål).
2. isolering av lungorna och räknar cellerna Under ett fluorescens-stereomikroskop
- Euthanize möss av CO2 inandning.
- Ta bort skinnet på bröstet ventrala yta med sax. Sedan skär revbenen och mellangärdet att exponera brösthålan. Spola PBS (100 cmH2O, totalt 15 mL) via höger kammare med en bevingad infusion 25 G nål och slang.
- Klipp ut hjärtat och brässen. Grepp luftstrupen med pincett, och dra upp, dissekera bindväv runt luftstrupen med sax. Dissekera ut lungorna och tvätta dem i PBS.
- Lossa varje LOB och följa den under ett fluorescens-stereomikroskop.
3. lung matsmältningen
- Lös 10 mg kollagenas, 10 mg dispase och 10 µg av DNAS i 10 mL serumfritt DMEM. Filtrera genom ett 0,22 µm spruta filter att förbereda enzymatisk nedbrytning lösningen.
- Tärna den isolera kaudala LOB med en sax. Placera lungcancer bitar i en 10 mL spruta, följt av kolven.
- Sug upp matsmältningen lösningen (5 mL) i sprutan genom att dra tillbaka kolven. Driva kolven upp och ner tills lungan sjunker in i lösningen. Placera sedan, lung- och matsmältningen bufferten i en 50 mL tub.
- Skaka tuben under 15 minuter vid 37 ° C i en ömsesidig shaker (150 rpm). Lungorna kan bli trasiga under denna inkubation.
- Pipettera upp och ner tills lungceller sprids helt. Skaka tuben i ytterligare 30 minuter vid 37 ° C i en ömsesidig shaker (150 rpm).
- Passera en 40 µm cell sil i lungceller. Snurra ner cellerna vid 400 x g i 3 min.
4. flödescytometri av lungceller
- Lös 100 mg BSA i 10 mL PBS och filtrera genom ett 0,22 µm spruta filter att förbereda PBS - 1% BSA.
- Ta bort supernatanten i provet erhålls vid steg 3.6 med pipett och tillsätt 2 mL röd blod cell lysis lösning. Sedan, spinn ner cellerna vid 400 x g i 3 min. avlägsna supernatanten.
- Att resuspendera cellerna i 5 mL PBS - 1% BSA genom pipettering och centrifugera röret (400 x g, 3 min). Kassera supernatanten.
- Upprepa detta tvätt en gång.
- Avbryta celler i 1 mL PBS - 1% BSA och passera genom en ny 40 µm cell sil.
- Analysera cellerna med en flödescytometer räkna tumörceller (med filterinställningar FL1 för GFP-LLC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lungorna presenterar många GFP-LLC celler 2 h efter injektion (figur 1A). Det bör noteras att de fluorescerande fläckarna som också upptäckt i den röda filtret bör undantas från det antal celltalet. Den stora majoriteten av LLC celler försvinner från lungorna 24 h efter injektion (figur 1 c).
För att bekräfta antalet GFP-LLC i lungorna, kan en av loberna användas för flöde flödescytometrisk analys (figur 2).
Figur 1 : Påvisande av GFP-LLC celler under en fluorescens-stereomikroskop. (A) lungorna är isolerad 2 h (A: filtret inställt GFPLP, B: filtret inställt ET/CY3) eller 24 h (C: filtret inställt GFPLP, D: filtret inställt ET/CY3) efter injektion av 3 x 104 GFP-LLC celler. (C), är en GFP-LLC cell markerad med en gul pil. De ställen som markerats med blå pilar är inte GFP-LLC celler. Skalstapeln anger 750 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Flow flödescytometri analys av lungceller. (A) och (B); Flöde flödescytometrisk analys av GFP-LLC celler som används för svans ven injektion. För att utesluta döda celler cell suspension bufferten innehöll propidium jodid (1 µg/mL). (A) visar FSC vs. SSC tomt och celler i regionen i (C) har utvecklats i (B) för att Visa FL1 vs. FL3 tomt. Celler i regionen (D) anses vara GFP-LLC celler. (E) och F. Dot tomter av stjärtfenan LOB celler isolerade 24 h efter svans ven injektionen. GFP-LLC celler observeras i regionen (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förbehandling av möss med antikroppar, droger, en fettrik kost eller tumör-villkorade medium före tumör cell injektion är möjligt. Det svåraste steget i denna analys är svansen ven injektionen. Ofullständig injektion resulterar i ofullständiga data. Svans venen i C57BL/6 är särskilt svårt att identifiera, vilket resulterar i misslyckade injektioner. Utsläppande mössen på en värmedyna (37 ° C) vidgas hjälper svans venen så att injektionen blir lättare.
Denna analys används ett stort antal (1 x 104 - 1 x 105) tumörceller, som är mycket större än den som observerades i patientens blod. En enstaka injektion av ett så stort antal celler kan medföra oönskade Svaren från värddjur. I den stereo fluorescensmikroskopi räkna, tumörceller djupt inne i vävnaden är svårt att upptäcka. I flödescytometri flödesanalys, är lungorna helt rötas försäljningsbonus tumörcellerna i lungorna. Denna process medför förlust av värdefull information om tumör cell läge (inom eller utanför blodkärlen). Tvärtom, upptäckt av tumörceller i confocal fluorescens Mikroskop tillåter särskiljande tumören celler i blodkärlen från de andra10.
Stereo fluorescensmikroskopi är en mycket enkel metod. Med hjälp av flödescytometri för att räkna tumörcellerna har ingen partiskhet jämfört med mikroskopet skanning. Det är möjligt att skanna hela lungan sektioner under en confocal fluorescens Mikroskop; analysen kommer sedan dock mödosamt. Andra typer av tumörceller eller stromaceller kan blandas med injicerade tumörcellerna. Samtidig injektion av cancer-associerade celler ökar risken för metastaser. Andelen tumör metastasering beror mycket på vilken typ av tumör cellen och djuret används.
Som nämnts ovan, är det mest kritiska steget i detta protokoll svans ven injektionen. Ett korrekt antal celler måste injiceras med inget läckage, men är tekniskt svårt. Att noggrant Observera hanteringen av skickliga forskare kan vara till stor hjälp.
En rad mus modell studier har rapporterat att 20% av de injicerade tumörcellerna genomgick extravasering, 3% av dem bildade micrometastases och endast 0.02% utvecklats till materiella metastaserande knölar2. Om GFP-LLC cell injektion (3 x 104 celler) upptäcktes 150-300 GFP-LLC celler av flödescytometri flödesanalys i den kaudala LOB isolerad 2 h efter injektionen. Det totala antalet GFP-LLC i lungorna antas vara 600-1200, att 2-4% av de injicerade cellerna fortfarande är vid liv. Detta förhållande minskar i en tidsberoende sätt3,11. De andra cellerna antas genomgå apoptos på grund av bristande fysisk stöd eller näring, eller på grund av utslagning av immunsystemet. I vår senaste data, 24 h efter injektion av GFP-LLC (6 x 104 celler), befanns numrera av GFP-LLC i lungorna vara ca 20. Dessa resultat kan påverkas av mus stammen, tumör cell och andra faktorer. Exempelvis har det rapporterats att antalet tumörceller i lungorna var förhöjda i förväg metastaserande fas12eller i gen modifierade möss13,14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ingen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
