Summary
Bu el yazması tümör hücresi birikimi Akciğerlerde tümör metastazı, bir hayvan modeli ölçmek için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Tümör metastazı yöneten moleküler mekanizmaları araştırmak için çeşitli deneyleri fareyi kullanarak bir modeli hayvan olarak önerilmiştir. Burada, tümör hücre ekstravazasyonu veya micrometastasis değerlendirmek için basit bir tahlil göstermektedir. Bu tahlil, tümör hücreleri kuyruk ven enjekte edildi ve kısa bir süre sonra akciğerleri disseke ve birikmiş etiketli tümör hücreleri saymak için sindirilmiş. Bu tahlil birincil tümör işgalinin ilk adımı damar atlar ve tümör metastazı oluştuğu uzak organ etkinlikte çalışma kolaylaştırır. Damar enjekte hücre sayısı Metastazlari sınırlı sayıda gözlemlemek için optimize edilmiş olması. Stromal hücreler uzak organ metastazı için katkıda rapor edildi. Böylece, bu tahlil potansiyel terapötik uyuşturucu ya da tümör metastazı önlenmesi için aygıt keşfetmek için yararlı bir araç olabilir.
Introduction
Tümör metastazı kanserle ilgili hastalıklarda yüksek ölüm oranı hesaplar. Moleküler seviyede araştırmalar bakış açısıyla, metastaz birden çok adımı ayrılabilir: tümör başlangıcında birincil tümör sitesi, birincil tümör büyüme ve çevreleyen dokular, intravasation, kan dolaşımı kan damarları aracılığıyla içine işgali , uzak organlara ve tümör yeniden büyüme ekstravazasyonu. Her adım molekülleri/sinyalleri1farklı grupları içerir.
Çalışmalar bugüne tümör hücreleri olarak da bilinen önceden metastatik faz2,3,4,5olan kanda dolaşan başlamadan önce uzak organlarda meydana gelen olaylarla ilgili, 6. Fare modeli çalışmalarımız önceden metastatik faz akciğerlerde uzun ömürlü ve düşük seviyeli inflamatuar yanıt oluşturarak akciğer metastazı kolaylaştırır saptandı. Önceden metastatik faz ile karakterize themicrovasculature hyperpermeability, kemik iliği türetilmiş hücre (BMDC) alımı ve upregulation3,4 S100A8 ve SAA3 de dahil olmak üzere sitokin/Kemokin-gibi moleküllerin tarafından . Bu o lysyl oksidaz BMDCs7askere akciğerlerde hücre dışı matriks değiştirir bildirilmiştir. Başka bir rapor önceden metastatik faz8' Angpt2, MMP3 ve MMP10 önemini ortaya koymuştur. Başka bir deyişle, birincil tümörler, kemik iliği ve uzak organlara arasındaki karmaşık etkileşimler anlaşılır olması ve düzgün (örneğin, proteinler bu etkileşimlerde yer hedef uyuşturucu kullanarak) modülasyonlu gerek gelecekteki metastaz9 önlemek için . Önceden metastatik faz düzenlemek için olmalı ilk görüntülenir ve tanı veya tedavi müdahaleler için değerlendirilir. Burada, önceden metastatik akciğer aşamasında çalışma sağlar bir akciğer tümör hücre işe alım tahlil raporu.
Tümör hücreleri doğrudan fareyi damar enjekte olabilir her ne kadar kültürlü hücreleri arasındaki farklar tümör hücreleri kanser hastalarında dolaşan ve tümör hücreleri dolaşan benzer. Dolaşım birincil tümöründen girdiğinizde tümör hücreleri dolaşan kendilerini bazı karakteristik değişiklikleri meydana. Yine de, onlar kuyruk damarda enjekte edildiğinde kültürlü hücreleri immünyetmezligi farelerde tümör oluşabilir. Ayrıca, fare modeli sistemi tümör hücreleri etiketli Floresans izleme bu hücreler vücuttaki izin kullanılabilir. Onlar kanser hastaları10nihai sonuçları belirlemek gibi kritik tümör hücreleri dolaşan davranıştır. Kan tümör hücreleri2hayatta kalmak için iyi bir yer değil. Ana bilgisayar bağışıklık sistemi tarafından saldırısından kaçıp apoptosis fiziksel destek eksikliği nedeniyle önlemek için anti-apoptotik sinyal gerekir ihtiyaçları var. Tümör hücrelerinin tümör başlama metastatik sitelerde daha yüksek yetenekleri ile daha fazla tümör nodüller oluşturur. Tümör hücreleri belirli organ tropism gösterirsen, metastaz belirli organları dikkat edilmelidir. Bu tahlil, metastatik cascade (birincil tümör büyüme ve işgali) ilk adımlar dahil değildir de odak dolaşan tümör hücreleri ve stromal hücreler (endotel hücreleri, epitel hücreleri ve kan hücreleri) arasındaki etkileşimi öyle. Geleneksel tümör hücre enjeksiyon deneyleri araştırmacılar tümör nodüller metastaz algılamak için somut bir boyuta büyümek kadar beklemek zorunda. Bu durumda, tümör hücreleri kan damarı içinde tam sayısını sayısal olamaz. Ayrıca bu işlem tümör hücreleri diğer faktörler sonucu etkileyebilir gösteren bir tümör büyütme aşama içerir.
Sayma tümör hücreleri floresan stereomicroscope altında etiketli basit bir işlemdir. Böylece bütün akciğer taranabilir stereomicroscope geniş görüş alanı sağlar. Akış Sitometresi da tümör hücreleri doku doğru sayıda anında veren yararlı bir araçtır. Floresan confocal mikroskop altında doku hücrelerinde sayma olanağı da sağlar ve metastatik tümör hücreleri en doğru resimlerini görüntüler, ama zaman alıcı ve seçili bir alanın sayılır Eğer sadece önyargılı sonuçlar verebilir. Bu tahlil, nihai hedefi ne kadar kolay Akciğerlerde tümör hücreleri birikir gözlemlemektir. Akciğerleri inflamatuar birincil tümöründen sinyal nedeniyle önceden metastatik aşamasında ise3,4, daha önce bildirildiği gibi enjekte tümör hücreleri böylece daha yüksek akciğer metastazı olasılığı ima akciğerlerde biriken yatkındır. Diğer koşullar (romatoid artrit, astım, vb) ve anti-enflamatuar ajanlar (gibi anti-TNFα) ile tedavi akciğer metastazı azaltmak. Böylece, bu tahlil akciğer metastazı olasılığı değerlendirmek için güçlü bir araç olduğu sonucuna varıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare ile gerçekleştirilen tüm yordamları hayvan Araştırma Komitesi, Tokyo kadın Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. kuyruk ven enjeksiyon Lewis akciğer Karsinomu (LLC) hücre
- Bir oksijen % %5 10 FCS ile takıma DMEM LLC hücreleri korumak CO2 kuluçka 37 ° C'de Hücreleri bir floresan protein ifade sistemi (Örneğin, GFP) içermelidir.
- Hücre kültür yemek bir enzimatik olmayan hücre ayrılma reaktif kullanarak kaldırın. Üreticinin iletişim kuralı izleyin.
- 3 dk. 5 mL PBS de hücrelerde pipetting tarafından Resuspend ve tüp (400 x g, 3 dk) santrifüj kapasitesi 15 mL tüp ve santrifüj 400 x g de hücreleri toplamak. Ardından süpernatant kaldırın.
- Bir kez daha bu çamaşır tekrarlayın.
- İkinci yıkama sonra hücreleri hücre süzgeç (40 µm gözenek boyutu) aracılığıyla geçmek ve 1 x 106 hücre/mL son hücre yoğunluğu vermek için PBS içinde resuspend.
- Hücre süspansiyon (1 x 105 hücreleri, 29 G iğne) 0.1 mL kuyruk ven yoluyla her C57BL/6 fare (8-10 hafta eski erkek) içine enjekte.
2. izolasyon akciğerler ve floresan Stereomicroscope altında Hücre sayımı
- Fareler CO2 inhalasyon tarafından ötenazi.
- Göğüs ventral yüzeyinde deri makasla kaldırmak. Sonra kaburga ve göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için diyafram kesti. PBS (100 cmH2O, toplam 15 mL) ile sağ ventrikül kanatlı infüzyon 25 G iğne ve boru ile yıkayın.
- Kalp ve timus kesip. Trakea Forseps ile kavrama ve kaldırın, Trakea etrafında bağ dokusu makasla anatomi. Ciğerlerini teşrih ve PBS içinde yıkayın.
- Her LOB bağlantısını kesin ve floresan stereomicroscope altında gözlemlemek.
3. akciğer sindirim
- Collagenase, dispase 10 mg ve Dnaz 10 µg serum-Alerjik DMEM 10 ml 10 mg geçiyoruz. Enzimatik sindirim çözüm hazırlamak için 0,22 µm şırınga filtre ile filtre.
- İzole Kaudal LOB makasla zar. Dalgıç tarafından takip bir 10 mL şırınga akciğer alin.
- Sindirim çözüm (5 mL) şırınga üzerinde pistonu geri çekerek Aspire edin. Akciğer çözüm içine batar kadar pistonu yukarı ve aşağı çalışır. Sonra akciğer ve sindirim arabellek bir 50 mL tüp içinde yer.
- Karşılıklı shaker (150 devir/dakika) olarak 37 ° C'de 15 dakika tüp sallamak. Akciğerler bu kuluçka sırasında parçalanmış olabilir.
- Yukarı ve aşağı pipet kadar akciğer hücreleri tamamen dağılmış. Karşılıklı shaker (150 devir/dakika) olarak 37 ° C'de ek 30 dk için tüp sallamak.
- Akciğer hücreleri 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek. Spin aşağı 3 dk 400 x g de hücreleri.
4. Akış Sitometresi akciğer hücre
- BSA 100 mg 10 ml PBS ve filtre PBS - %1 BSA hazırlamak için bir 0,22 µm şırınga filtreden geçiyoruz.
- Bir pipet kullanarak 3.6 adımda elde edilen örnek süpernatant kaldırın ve 2 mL kırmızı kan hücre lizis çözeltisi ekleyin. Sonra 400 x g 3 dakika süreyle de hücreleri aşağı spin süpernatant atmak.
- Pipetting tarafından 5 mL de PBS - %1 BSA hücrelerde resuspend ve tüp (400 x g, 3 dk) santrifüj kapasitesi. Süpernatant atmak.
- Bir kez daha bu çamaşır tekrarlayın.
- PBS - %1 BSA 1 mL hücrelerde askıya alma ve yeni bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
- (Filtre kurulumu FL1 GFP-LLC için kullanarak) tümör hücreleri saymak için bir Akış Sitometresi hücrelerle analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akciğerler birçok GFP-LLC hücreleri 2 h sonra enjeksiyon (şekil 1A) mevcut. Bu da kırmızı filtrede tespit floresan noktalar dan hücre sayı say silinmemesi gerektiğini belirtmek gerekir. LLC hücreler büyük çoğunluğu akciğerlerden 24 h enjeksiyon (şekil 1 c) sonra kaybolur.
Akciğerlerde GFP LLC sayısını doğrulamak için bir LOB akış sitometrik analizi (Şekil 2) için kullanılabilir.
Resim 1 : GFP-LLC algılama hücreleri floresan stereo mikroskop altında. (A) akciğer izole 2 h vardır (A: filtre ayarlamak GFPLP, B: filtre ayarlamak ET/CY3) veya 24 h (C: filtre ayarlamak GFPLP, D: filtre ayarlamak ET/CY3) 3 x 104 GFP-LLC hücre enjeksiyon sonra. (C), GFP-LLC hücre tarafından sarı bir ok işaretlenir. Mavi oklarla işaretlenmiş noktalar GFP-LLC hücreler değildir. Ölçek çubuğu gösterir 750 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Akış Sitometresi Analizi akciğer hücre. (A) ve (B); Akış sitometrik çözümlemesi kuyruk ven enjeksiyon için kullanılan GFP-LLC hücre. Ölü hücreleri dışlamak için propidium iyodür (1 µg/mL) hücre süspansiyon arabellek içeriyor. (A) FSC vs SSC arsa ve (C) bölgedeki hücreler içinde (B) FL1 vs FL3 arsa göstermek için geliştirilir gösterir. (D) bölgedeki hücreler GFP-LLC hücre olarak kabul edilir. (E) ve (F); 24 saat sonra kuyruk ven enjeksiyon izole Kaudal LOB hücre nokta araziler. GFP-LLC hücreleri bölgesi (D) gözlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ön arıtma farelerin antikorlar, uyuşturucu, yüksek yağlı diyet ya da tümör şartına orta önce tümör hücre enjeksiyon ile mümkündür. En zor bu tahlil kuyruk ven enjeksiyon adımdır. Eksik enjeksiyon sonuçsuz verilerde sonuçlanır. Kuyruk ven C57BL/6 başarısız enjeksiyonları sonucu tespit etmek, özellikle zordur. Enjeksiyon daha kolay olur, böylece bir Isıtma yastığı (37 ° C) fareyi yerleştirerek yardımcı olur kuyruk ven genişletmek.
Bu tahlil çok hasta kan içinde gözlenen daha büyük büyük bir sayı (1 x 104 - 1 x 105) tümör hücreleri kullanır. Tek seferlik bir enjeksiyon hücreleri gibi bir çok sayıda ev sahibi hayvanlardan istenmeyen tepkiler hakkında getirebilir. Sayma, Floresans stereo mikroskobu içinde tümör hücreleri derin iç doku tespit etmek zor bulunur. Akış Sitometresi Analizi, akciğerler Akciğerlerde tümör hücreleri saymak için tamamen sindirilmiş. Bu işlem tümör hücre konumu (içinde veya dışında kan damarı) hakkında değerli bilgi kaybına neden olur. Aksine, hücrelerinin damar diğerlerinden ayırt edici tümör tümör hücreleri confocal floresan mikroskop altında algılanmasını sağlar10.
Stereo Floresans mikroskobu çok basit bir yöntemdir. Tümör hücreleri saymak için Akış Sitometresi kullanarak tarama mikroskop ile karşılaştırıldığında hiçbir önyargı vardır. Tüm akciğer bölümleri confocal floresan mikroskop altında taramak mümkündür; Ancak, tahlil-ecek o zaman var olmak zahmetli. Diğer türlü tümör hücreleri ya da stromal hücre enjekte tümör hücreleri ile karışık. Hücrelerin kanser ilişkili ortak enjeksiyon metastaz olasılığını artırır. Tümörün metastaz hızı ağır tümör hücre ve kullanılan hayvan türüne göre değişir.
Yukarıda belirtildiği gibi bu iletişim kuralı en kritik adımda kuyruk ven enjeksiyon var. Doğru bir hücre sayısı hiçbir sızıntı ile enjekte edilebilir gerekiyor, ancak teknik olarak zordur. Dikkatle gözlemleyerek yetenekli araştırmacılar işleyerek çok yardımcı olabilir.
Fare modeli çalışmalar bir dizi enjekte tümör hücrelerinin % 20 uygulandı ekstravazasyonu, bunların %3 micrometastases oluşan ve yalnızca %0.02 geliştirilen içine bildirdin somut metastatik nodüller2. GFP-LLC hücre enjeksiyon (3 x 104 hücreleri) durumunda, 150-300 GFP-LLC hücreleri Akış Sitometresi Analizi 2 h sonra enjeksiyon izole Kaudal LOB tarafından tespit edildi. Akciğerlerde GFP-LLC toplam sayısı 600-1200, eklenen hücrelerin % 2-4 hayatta kalabilentek gösteren olduğu varsayılır. Bu oran bir saat-bağımlı bir şekilde3,11' azalır. Diğer hücrelerde apoptoz fiziksel destek veya beslenme eksikliği nedeniyle veya dışlama nedeniyle geçmesi bağışıklık sistemi tarafından kabul edilir. Son verilerimizi GFP-LLC (6 x 104 hücreleri), enjeksiyon sonra 24 saat içinde GFP-LLC sayısı akciğerlerde 20 hakkında bulundu. Bu sonuçlar fare zorlanma, tümör hücre ve diğer faktörlerden etkilenebilir. Örneğin, Akciğerlerde tümör hücreleri içinde önceden metastatik faz12yükseltilmiş veya fare13,14geni değiştirilmiş bildirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Hiçbiri
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase | Sigma | C6885 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | no calcium, no magnesium |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | DN-25 | trace amount |
| RBC lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer | BD | 352340 | 40 micrometer mesh |
| Fluorescence labeling kit | Sigma | MIN26-KIT | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| 0.22 μm syringe filter | sartorius | 17597K | |
| O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution | Wako | 163-20145 |
References
- Valastyan, S., Weinberg, R. A. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms. Cell. 147 (2), 275-292 (2011).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438 (7069), 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., Watanabe, A., Aburatani, H., Maru, Y. Tumour-mediated upregulation of chemoattractants and recruitment of myeloid cells predetermines lung metastasis. Nature Cell Biology. 8 (12), 1369-1375 (2006).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nature Cell Biology. 10 (11), 1349-1355 (2008).
- Tomita, T., Sakurai, Y., Ishibashi, S., Maru, Y. Imbalance of Clara cell-mediated homeostatic inflammation is involved in lung metastasis. Oncogene. 30 (31), 3429-3439 (2011).
- Deguchi, A., et al. Serum amyloid A3 binds MD-2 to activate p38 and NF-κB pathways in a MyD88-dependent manner. Journal of Immunology. 191 (4), 1856-1864 (2013).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Huang, Y., et al. Pulmonary vascular destabilization in the premetastatic phase facilitates lung metastasis. Cancer Research. 69 (19), 7292-7237 (2009).
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Möller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Reviews. 32 (3-4), 449-464 (2013).
- Castle, J., Shaker, H., Morris, K., Tugwood, J. D., Kirwan, C. C. The significance of circulating tumor cells in breast cancer: A review. The Breast. 23, 552-560 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Endothelial CCR2 signaling induced by colon carcinoma cells enables extravasation via the JAK2-Stat5 and p38MAPK pathway. Cancer Cell. 22 (1), 91-105 (2012).
- Hiratsuka, S., et al. Primary tumours modulate innate immune signalling to create pre-metastatic vascular hyperpermeability foci. Nature Communications. 4, 1853 (2013).
- Deguchi, A., et al. Eritoran inhibits S100A8-mediated TLR4/MD-2 activation and tumor growth by changing the immune microenvironment. Oncogene. 35 (19), 1445-1456 (2016).
- Ieguchi, K., et al. ADAM12-cleaved ephrin-A1 contributes to lung metastasis. Oncogene. 33 (17), 2179-2190 (2014).
