Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT

Published: September 2, 2015 doi: 10.3791/53175
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biochemistry and Biophysics, Texas A&M University

Abstract

Makromolekylære strategier levering typisk udnytter endocytiske vej som en rute for cellulær indrejse. Men endosomale indfangning alvorligt begrænser den effektivitet, hvormed makromolekyler trænger cytosol plads af celler. Vi har for nylig omgået dette problem ved at identificere reagenset dfTAT, en disulfidbinding dimer af peptidet TAT mærket med fluorophoren tetramethylrhodamin. Vi har genereret en fluorescens-mærket dimer af prototypiske cellepenetrerende peptid (CPP) TAT, dfTAT, som trænger levende celler og når det cytosoliske rum af celler med en særlig høj effektivitet. Cytosolisk levering af dfTAT opnås på flere cellelinier, herunder primære celler. Desuden indeholder levering ikke mærkbart påvirker celle levedygtighed, proliferation eller genekspression. dfTAT kan levere små molekyler, peptider, antistoffer, biologisk aktive enzymer og en transkriptionsfaktor. I denne rapport beskriver vi er involveret i frihandelsaftale protokollerT-syntese og cellulær levering. Manuskriptet beskriver, hvordan man styrer mængden af ​​protein leveret til cytosoliske rum af celler ved at variere mængden af ​​indgivet protein ekstracellulært. Endelig er de nuværende begrænsninger i denne nye teknologi og trin i validering levering diskuteret. De beskrevne protokoller bør være særdeles nyttige til cellebaserede assays samt til ex vivo manipulation og omprogrammering af celler.

Introduction

Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler er ofte ønskeligt i mange biologiske eller bioteknologiske anvendelser (cellulær billeddannelse, funktionelle assays, cellulære omprogrammering osv.) 1-4. Mange leveringsmetoder er allerede blevet rapporteret, herunder mikroinjektion, elektroporation, eller brug af carrier stoffer (f.eks., Celle-gennemtrængende peptider såsom TAT, lipider) 5-7. Hver teknik typisk har specifikke fordele og ulemper, der kan gøre disse tilgange tilstrækkelig til visse anvendelser, men ikke for andre. Almindelige problemer omfatter dårlige levering effektivitet og / eller manglende kontrol med, hvor meget materiale leveres 8,9, toksicitet eller skadelig fysiologisk virkning 10,11, manglende tidsmæssig kontrol, levering i få celler, men ikke i en hel befolkning (f.eks., mikroinjektion) 12 og komplekse kemiske konjugationsfremgangsmåder eller formulering ordninger 11.

s = "jove_content"> For nylig har vi udviklet en ny leverance strategi, der omgår disse begrænsninger. Denne strategi er baseret på en peptid med navnet dfTAT (dimer fluorescerende TAT) 13. dfTAT er afledt af det velkendte cellepenetrerende peptid (CPP) TAT. dfTAT indeholder to disulfidbundne kopier af TAT mærket med fluorophoren tetramethylrhodamin. På trods af deres ligheder, TAT og dfTAT afviger betydeligt i aktivitet. TAT typisk internaliseres i cellerne ved endocytose. Dette CPP forbliver dog det meste fanget inde endosomer (dette normalt føre til en punktformet fordeling af peptidet inde celler, når undersøgt ved fluorescens mikroskopi). Ligesom TAT, er dfTAT effektivt endocytose af celler. Men dfTAT ikke holde fanget inde endosomer. I stedet er det medierer endosomale lækage på en måde, der er yderst effektiv. Den endosomolytic aktivitet dfTAT kan derpå udnyttes til at opnå makromolekyler ved simpel inkubering assay.

ntent "> Den nuværende forståelse af leveringen proces er som følger. dfTAT inducerer macropinocytosis. Som et resultat, celler inkuberet med dfTAT tage op opløselige proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler af interesse, MOI) er til stede i medier ved fluid-fase endocytose (se figur 1). Interaktioner mellem dfTAT og MOI er ikke nødvendige, så længe begge enheder trafik sammen inden for endocytiske pathway. Som dfTAT når en vis tærskel i lumen endocytiske organeller, det udtrykker sin endosomal lækage aktivitet (de molekylære detaljer fortsat at være fuldstændigt karakteriseret). Indholdet af lumen utætte organeller, og derfor MOI, frigives derpå i cellerne. Denne fremgangsmåde er derfor meget praktisk som ingen konjugationsprocedurer eller formulering ordninger med MOI er påkrævet. Desuden, på grund dfTAT er ikke direkte at modificere en MOI, bør det heller ikke forstyrre MOI fungere, når intracellulær administration opnås. Hertil kommer, at koncentrationen afdfTAT brugte levering er uafhængig af MOI i medierne. For eksempel kan dfTAT koncentration holdes konstant mellem forskellige forsøg på at sikre reproducerbare effektivitet i endosomale lækage. I modsætning hertil kan koncentrationen af ​​MOI i medier gradvis ændres for at medføre ønskede niveauer af MOI leveres i cytosol.

Den høje endosomale lækage effektivitet opnås med dfTAT er bemærkelsesværdigt uskadeligt for mange af de hidtil testede celler. Dette er en overraskelse, fordi endocytiske organeller er vigtig del af cellerne, og man ville forvente, at den dramatiske lækage medieret af dfTAT ville blive ledsaget af ødelæggende cellulære responser. Alligevel behandlede celler formere i samme tempo som ubehandlede celler, og viser ikke nogen væsentlige ændringer i deres transkriptom. Desuden kan leveringen blive gentaget inden for få minutter med reproducerbare levering effektivitet, hvilket indikerer, at cellerne enten kan tåle eller inddrive fra leveringen processen uden at mistederes evne til endocytose eller endosomale lækage. Subtile cellulære reaktioner kan finde sted i løbet dfTAT levering og de molekylære detaljer om, hvad disse reaktioner kan være mangler at blive udforsket. Men ved at kombinere høj effektivitet, bekvemmelighed protokoller, og mangel på toksicitet, bør denne levering tilgang vise sig umiddelbart anvendelige i mange cellebaserede applikationer. De protokoller, der præsenteres heri, til formål at gøre denne teknologi tilgængelig for forskningsverdenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Syntese

Bemærk: dfTAT fremstilles i to trin: syntese af monomeren fTAT ved fastfasepeptidsyntese efterfulgt af disulfidbinding dimerisering for at danne dfTAT.

  1. Swell 500 mg Rink amid resin MBHA i dimethylformamid (DMF) i en standard 50 ml SPPS beholder i 1 time.
  2. Udfør Fmoc-afbeskyttelse ved at inkubere Fmoc-beskyttede harpiks i en 20% piperidin-opløsning (20% piperidin i DMF, 10 ml (0,30 mmol). Der foretages afbeskyttelsestrin to gange (1 x 5 min og 1 x 15 min) med et vasketrin ved anvendelse af DMF (vasketrinet omfatter skylning af harpiksen flere gange med et totalt volumen på ca. 150 ml DMF og fjernelse af opløsningsmidlet ved vakuumfiltrering) mellem reaktioner.
  3. Syntetisere CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) på skøjtebanen amid MBHA-harpiks. Brug følgende Fmoc-beskyttede aminosyrer: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (kun på N-terminalen), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, og Fmoc-Cys (Trt) -OH. Gennemføre reaktionen under anvendelse af N 2 (20 PSI) at omrøre reaktionsblandingen. Udføre alle reaktioner ved stuetemperatur.
    1. Udføre hver aminosyre koblingsreaktion i 4 timer. For hver kobling, bruge Fmoc-beskyttede aminosyre (1,2 mmol), N, N, N ', N' -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-yl) uronium (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) og diisopropylethylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) opløst i DMF. Efter 4 timers kobling vaskes harpiksen med DMF og udfører Fmoc afbeskyttelsestrin som beskrevet i trin 1.2.
    2. Gentag, indtil den lineære peptidkæde fTAT (Linear peptidkæde: CKRKKRRQRRRG ingen TMR) blev syntetiseret.
    3. Derefter vaskes harpiksen grundigt med første DMF og efter med dichlormethan (DCM). Resinen skylles flere gange med et totalt volumen på ca. 150 ml DMF eller DCM, og opløsningsmidlet fjernes ved vakuumfiltrering.
    4. USE MALDI-TOF at bekræfte, at peptidet opnås har den korrekte molekylvægt.
      1. Foretag en matrix mix ved tilsætning af 1 mg af matrix til en opløsning bestående af 50 pi 0,01% TFA i vandig opløsning og 50 pi acetonitril.
      2. For at bekræfte lineære peptidkæde masse, anvender α-cyan-4-hydroxykanelsyre. Kør en analytisk HPLC af det rå peptid og indsamle 50 pi fra toppen af ​​den rene top.
      3. For at forberede prøven til pladen på MALDI plade: Tilføj 8 pi af peptidet til 2 pi af matricen og anbringes på MALDI pladen lufttørre eller på et 37 ° C varme plade.
        Bemærk: Arginin er kendt for at være en aminosyre vanskeligt at par i SPPS. Vellykket kobling etableres ved at udføre en Kaiser-test 14 (f.eks ninhydrintest). Denne test muliggør påvisning af frie aminer, som kan forblive koblet på harpiksen. I tilfælde påvises en blå farve (indikation af tilstedeværelsen af ​​frie aminer), kobling sTEP gentages.
  4. For CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), spalte MTT beskyttelsesgruppen på aminogruppen af ​​Lys på CK (-NH-MTT) TATG med en opløsning bestående af 1% trifluoreddikesyre (TFA) og 2% triisopropylsilan (TIS) i DCM.
    1. Som fjernelse af MTT beskyttelsesgruppe vil resultere i fremkomsten af ​​en gul farve, inkuberes harpiksen med 20 ml af ovennævnte opløsning i 5 minutter, gentage dette, indtil der ikke gul farve observeres. Vask harpiksen med DCM og DMF i mellem. Derudover da TIS er en scavenger der ville opfange MTT, når ingen gul farve vises i opløsningen i nærværelse af MTT.
    2. Tilføje en ekstra opløsning med 1% TFA i DCM (ingen TIS) til harpiksen for at sikre ikke mere MTT er fjernet, og opløsningen forbliver klar.
  5. Opløs tre komponenter: carboxytetramethylrhodamin (TMR), HBTU, og DIEA (4, 3,9 og 10 ækvivalens i forhold til mængden af ​​harpiks (i mg)) i DMF og denne blandingtil harpiksen og udføre omsætningen O / N anvendelse af tør N2 for at tilvejebringe omrøring.
  6. Efter Fmoc-afbeskyttelse og aminosyre konjugation, vaske harpiksen med DCM og lad det tørre. For fuldstændig spaltning af peptidet fra harpiksen, tilsættes en opløsning indeholdende 92,5% TFA, 2,5% H2O, 2,5%, TIS og 2,5% ethandithiol (EDT) (totalvolumen = 4 ml) til peptidylharpiksen for 3 timer ved stuetemperatur for at opnå global afbeskyttelse og spaltning fra harpiksen.
    1. Udfældning af rå peptid produkter ved hjælp af koldt vandfri ethylether (Et2O) ved dræning af opløsningen fra trin 1.6 i 40 ml Et2O, spinde dette ned ved 4 ° C og 4000 x g i 20 - 25 min. Gentag dette trin for at tillade vask af bundfaldet med kold vandfri Et2O
    2. Resuspender bundfaldet i vand (5 ml eller indtil bundfaldet er fuldstændigt opløst) og lyofiliseres. Derefter opblande fremstillet i 0,1% vandig TFA / acetonitril produkter.
    7. <li> Udfør HPLC-analyse med en analytisk C18-kolonne (5 um, 4 x 150 mm) til at analysere hvert peptid. Brug en strømningshastighed på 1 ml / min, og påvisning ved 214 nm og 550 nm.
  7. Udfør semipræparativ HPLC på en C18 10 x 250 mm søjle for peptid oprensning. Brug en strømningshastighed på 4 ml / min, og påvisning ved 214 nm og 550 nm. For alle kørsler, anvender lineære gradienter af 0,1% vandig TFA (opløsningsmiddel A) og 90% acetonitril, 9,9% vand og 0,1% TFA (opløsningsmiddel B).
  8. Bekræft, at identiteten af ​​de peptider ved MALDI-TOF henhold til producentens protokol: fTAT, forventede masse: 2,041.17, observerede masse: 2040,66. DEAC-K9, forventede masse: 1,412.97, observerede masse: 1,415.59. Brug en α- cyano-4-hydroxykanelsyrematrix for MALDI-TOF.

2. oxidationsreaktion: dfTAT Generation

  1. Beluftes phosphatbufret saltvand (PBS) pH 7,4 i 1 time (mindst 5 ml til reaktionen nedenfor).
  2. Opløs fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) i aerated PBS pH 7,4 (5 ml). Sørge for, at pH-værdien er mellem 7,0 - 7,5 efter tilsætning af peptidet. Hvis ikke tilføje natriumhydroxid (1 M, i små trin 1 - 5 pi) for at bringe pH tilbage til 7,4.
  3. Bemærk: Oxygen opløst i PBS virker ved at oxidere thiolgrupper på fTAT og danne en disulfidbinding.
  4. Nutate reaktionen O / N at gøre det muligt at reagere indtil afslutning (100% udbytte baseret på HPLC-analyse). Oprens produktet med omvendt-fase-HPLC og analysere ved hjælp af massespektrometri (MALDI-TOF) som i trin 1.9. Forventet masse: 4,080.34, observerede masse: 4,084.21.
  5. Lyofilisere ren dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) og resuspender i 200 pi vand (koncentration ren dfTAT = 356,3 uM).

3. Måling dfTAT Koncentration

  1. Resuspender en portion af det oprensede dfTAT (typisk 1 pi afhængigt af mængden af ​​peptid oprenset) i en 149 pi 50 mM TCEP opløsning.
  2. Bemærk: I dette trin dfTAT er reduceret til sin monomer modstykke fTAT at fjerne absorbansen quenching, der opstår på grund af den tætte nærhed af TMR fluoroforen i dfTAT (ekstinktionskoefficienten ε af TMR i dfTAT er reduceret i forhold til ε af TMR i reduceret fTAT).
  3. Lad prøven at reagere i ca. 20 min (kan analytisk HPLC anvendes til at bekræfte dannelsen af ​​fTAT).
  4. Tilføj hele opløsningen til kvartscuvette og måle absorbansen ved 556 nm.
  5. Brug Øl lov (A = εcl: ε = 91500 M -1 cm-1) til at beregne koncentrationen af fTAT, bestemme koncentrationen af dfTAT, og deler [fTAT] med to.

4. Cellular Levering Eksperimenter

  1. Pode celler (HeLa, HDF, osv.) I en skål med en konfluens på 80 - 90% (f.eks 8 brønde eller 24 brønde skål). Grow celler i et passende medium (f.eks DMEM suppleret med 10% FBS og Pen / Strep) indtil 80 - 90% konfluens i en 37 ° Cfugtig atmosfære indeholdende 5% CO2.
  2. Vask cellerne tre gange (3x) med PBS (ved tilsætning af 200 pi PBS og derefter fjerne det tre gange).
  3. Lav en 5 uM arbejder koncentration af dfTAT ved at fortynde en bestand af dfTAT (i vand) i NRL-15 medier (for en 8 godt parabol det samlede volumen skal være 200 ul). En koncentration på 5 uM dfTAT fører til effektiv levering (højt cytosolisk levering i mere end 90% af cellerne til stede i en skål) i de fleste celletyper er testet til dato (figur 3). Imidlertid kan lavere eller højere koncentrationer være mere passende for celletyper med en høj eller lav tilbøjelighed til penetration.
    BEMÆRK OM MEDIER: NRL-15 anvendes til levering af dfTAT da den ikke indeholder cystein, som kunne reducere disulfidbindingen i dfTAT. Vores data viser imidlertid, at både almindelige L-15 (med cystein), og DMEM kan anvendes som levering medier. L-15 indeholder den reducerende aminosyren cystein, men cystein presumably oxiderer i medierne til at danne cystin (DMEM er formuleret med cystin). dfTAT derfor forbliver intakt i disse medier og levering fungerer på samme effektivitet som det, der opnås med nrL15.
  4. Cellerne inkuberes med dfTAT (5 uM) med eller uden last (f.eks., EGFP (10 uM)) og holde ved 37 ° C i 1 time (inkubationstiden kan reduceres, men dfTAT kræver typisk cirka 30 til 45 minutter for at inducere endosomale lækage ).
  5. Vask cellerne med heparin (1 mg / ml) i L-15 (3 vaske anbefales) for at fjerne dfTAT bundet til plasmamembranen af ​​celler.
  6. Cellerne inkuberes med celleimpermeable nuklear farvning, f.eks., Sytox blå, Sytox Green (2 uM i NRL-15), at bestemme, om cellers plasmamembran er kompromitteret (døde celler vil blive farvet, mens levende celler ikke) ifølge producentens protokol.
  7. Billede celler ved hjælp af en fluorescens mikroskop (100X olieimmersion eller 20X mål). Billede dfTAT anvendelse af en RFP filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
    Bemærk: vellykket levering fører til en diffus fluorescens af dfTAT hele cellen (vurdering af levering af protein eller peptid af interesse vil afhænge af anvendelsen). Farvning af kernelegemer af fTAT (det reducerede produkt i dfTAT upon cytosolisk post) kan anvendes som en indikation af, at fluorescens detekteres er intracellulært. fTAT vil nedbrydes inden for få timer. På dette tidspunkt, vil fluorescensen af ​​nedbrydningsfragmenter vises som punktformet. Dette må ikke forveksles for punktformig fordeling, der ses også, hvis dfTAT forbliver uden held fanget inde endosomer (dette kan ske, hvis dfTAT er til stede ved for lav af en fusion).

5. kontrollerende Koncentration af MOI Delivered

  1. Identificere den "optimale levering" koncentration, der kræves for at opnå en effektiv cytosol frigivelse af dfTAT i celletype anvendes. Udfør fluorescensmikroskopi på celler inkuberet med increasing koncentrationer af dfTAT. Den optimale koncentration dfTAT er defineret som den minimale koncentration, der medfører klare cytosol "diffuse" TMR fluorescens i ca. 100% af celler i en kultur.
  2. Varierer koncentrationen af MOI anvendes i co-inkubering protokollen, samtidig med at holde koncentrationen af dfTAT konstant (f.eks hjælp dfTAT optimale koncentration levering). Ændring af inkubationstiden til mindre end 1 time kan også være en mulighed for at variere mængden af ​​MOI leveret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at vurdere forskellen mellem fTAT og dfTAT, er HeLa-celler inkuberet i 1 time med hvert peptid for at bestemme forskellen i deres cellulære lokalisering. Internaliseringen af de to CPP blev vurderet ved anvendelse af fluorescensmikroskopi. Figur 2 viser, fTAT (20 uM) lokaliserer i en punktformet fordeling. Denne fordeling er i overensstemmelse med peptidet forbliver indesluttet inden i endosomer. I modsætning hertil fluorescenssignalet af dfTAT (5 uM) viser en homogen fordeling i hele cytosolen og kernen. Figur 3 viser, at den cytosoliske fordeling af dfTAT observeres i en række forskellige cellelinjer, herunder COLO 316, NIH 3T3, HaCaT, den vanskeligt at transficere Neuro-2a, MCH58, den primære cellelinie HDF, DRG-F11 og NCL-H1299. 20X billeder viser, at en meget høj procentdel (> 80%) i et fad vise en cytosolisk fordeling af dfTAT uden cellulær toksicitet (ingen Sytox blue nukleare staining).

For at bestemme om dfTAT-medieret endosomale lækage leverer store proteiner i cytosolen af ​​celler. EGFP (26 kDa) er valgt som model protein. Dette skyldes, at fluorescens kan anvendes til at påvise dets levering ind i cellerne ved at observere lokalisering af grøn fluorescens (hvis korrekt foldet). For at gøre dette assay blev EGFP og dTAT inkuberet i 1 time med celler, som vist i figur 4, EGFP vises et cytosol og nuklear grønt fluorescerende fordeling svarer til, hvad der observeres for dfTAT i mere end 90% af cellerne uden observerbar toksicitet.

Figur 1
Figur 1. Skematisk Viser Princippet om dfTAT-medieret Molekylær Delivery. Fra venstre mod højre. Skematisk viser dfTAT cellulære levering sammen med en celle uigennemtrængeligt last. Første dfTAT inducerer endocytose, der resulterer i uptake af dfTAT sammen med lasten i endocytiske vesikler. I det andet trin dfTAT undslipper fra endocytiske vesikler, hvilket resulterer i frigivelsen af ​​dfTAT og celleimpermeabelt molekyle i cytosolen af ​​celler. Cytosol pattedyrceller er en reduktiv miljø, derfor i cytosolen dfTAT er reduceret til sin monomer modstykke fTAT. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. fluorescens og Bright Field Billeder af begge HeLa celler inkuberet med 20 pM fTAT (venstre panel) og 5 uM dfTAT (højre panel) ved hjælp af en 100X Mål. FTAT monokrome billeder viser celler, der udviser en fluorescens punktformet fordeling, mens dfTAT billeder viser celler visning af en homogen cytosol og nuklear fluorescenc e distribution. Målestok:. 10 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. effektiv levering af dfTAT i levende celler blev opnået i flere cellelinjer. De testede cellelinier var følgende: HeLa, NIH 3T3, COLO 316 og HaCaT, Neuro-2a, MCH58, HDF, DRG-F11 og NCL- H1299. Celler blev inkuberet med 5 uM dfTAT i 1 time efterfulgt af et vasketrin ifølge protokollen og afbildes. Fluorescens-signalet opdaget var i cytosolen og kernen af ​​celler (øverste panel: 20X målsætning, bundplade: 100X mål). Den celleimpermeable nuklear farvning SYTOX Blå blev anvendt til at vurdere cellernes levedygtighed efter dfTAT behandling. Scale barer, 20X objektive: 50 um; 100X mål: 10 pm.jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. dfTAT leverer Intakt EGFP i forskellige cellelinier. Blev (A) HeLa (øverste panel) og NIH 3T3 (bundpanel) celler blev inkuberet med EGFP (10 uM) og dfTAT (5 uM) i 1 time og efterfølgende trin udføres ifølge protokollen. Billeder viser en homogen cytosolisk fluorescens fordeling af EGFP i begge cellelinier. Målestokke 10 um. (B) HeLa og primære HDF celler blev inkuberet med EGFP (10 uM) og dfTAT (5 uM) ifølge protokollen. 20X billeder viser en homogen cytosolisk fluorescens fordeling af EGFP og dfTAT i HeLa og primære HDF celler. Overlay (pseudofarve: hvid) indikerer tilstedeværelsen af ​​dfTAT (pseudofarve: lilla), EGFP (pseudocoleller: grøn) i cytosoliske rum af både HeLa og HDF celler. Sytox blå (vist med blåt) blev anvendt til æsler for cellelevedygtighed. Scale barer:. 50 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De celler, der anvendes til dfTAT levering bør ikke være alt for sammenflydende (> 90% konfluens), da dette kan påvirke leveringen effektivitet. Cellerne skal også være sundt: døde celler i kulturen kan frigive apoptotiske fragmenter, som dfTAT kan interagere (f.eks DNA fra nedbrudte kerner). Dette kan forstyrre leveringen effektiviteten og kvaliteten af ​​billedbehandling. Cellerne skal vaskes grundigt for at fjerne FBS, før du tilføjer dfTAT. BSA til stede i FBS kan binde til dfTAT og dette kan sænke levering effektivitet dfTAT. Vaskene bør dog udføres med forsigtighed, da overdreven kraft kan forårsage adhærente celler at løsne sig fra dyrkningsskålen eller forårsage stress, der resulterer i lavere endocytiske uptake.When levere et protein / peptid ved hjælp dfTAT, protein / peptid stamopløsning prøven skal være tilstrækkelig koncentreret for at undgå overdreven fortynding af NRL-15 medier under inkubation: f.eks tilsætning på 5 - 10 pi prøve til 200 μl NRL-15 anbefales.

Fluorescensmærkede cellepenetrerende peptider kan vise en lys-inducerbar membran forstyrrelser aktivitet. 15 Dette er tilfældet for dfTAT når der anvendes lys med høj intensitet doser. Det kan manifestere sig ved brud af intracellulære organeller (f.eks endosomer, mitokondrier), celleoverfladen blebbing og celledød. For at minimere disse effekter, der skal sørges for at holde lys eksponering til et minimum (standard betingelser for billeddannelse ved konfokal eller epifluorescens typisk tolereres).

Ved levering MOI såsom proteiner, er en konfronteret med det problem, at hvert makromolekyle er unik, og at der følgelig kan hver levering eksperiment kræver finjustering (mere end i tilfælde af DNA-transfektion, hvor molekylerne leverede altid en negativt ladet polymer fremstillet af A, T, G og C). Fejlfinding er derfor vigtigt og flere aspekter bør overvejes.For det første kan proteiner med meget lave pI binde elektrostatisk til dfTAT og inaktivere det. I modsætning hertil kan proteiner med meget høj pI konkurrere med dfTAT om binding med negativt ladede glycosaminoglycaner på celleoverfladen. Dette kan derefter reducere endocytose og mindske optagelsen under endosomolytic tærskler. I begge tilfælde er en mulig løsning på dette problem stigende dfTAT koncentration.

Som man kunne forvente, på grund af tilstedeværelsen af cellulære proteaser (såsom cathepsin 16) langs endocytiske proces, nedbrydning af MOI under fødslen er et problem. Mens dfTAT kan levere intakte proteiner, ikke er blevet godtgjort af mængden af ​​protein, der er helt eller delvist nedbrudt under leveringsprocessen. Dette er igen et spørgsmål, er MOI-afhængig, og som bør overvåges afhængigt af anvendelsen forfølges.

dfTAT er en meget effektiv tilførsel middel. Den molekylære basis for dfTAT aktivitet remains dog uklart. Især har de strukturelle eller kemiske funktioner, der er nødvendige for at opnå endosomal flugt ikke blevet identificeret. Det er derfor på nuværende tidspunkt ikke muligt at forudsige, hvor meget struktur dfTAT kan ændres uden at ændre levering effektivitetsgevinster. Vi har allerede etableret, at disulfidbindingen til stede i dfTAT kan erstattes af en ikke-reducerbar linker uden skadelige virkninger. Yderligere relationer struktur-aktivitet er i øjeblikket ved at blive etableret.

Vores data tyder på, at det er muligt at nedsætte inkubationstiden af ​​peptidet til mindre end 1 time (så lavt som 5 min er blevet udført). Imidlertid er frigivelsen af ​​dfTAT i celler ikke observeret i en stor population af celler indtil ca. 15-30 min. Dette antyder, at korte inkubationstid kan være tilstrækkelig til dfTAT endocytose eller cellulær optagelse. Men tid er nødvendig for endosomal modning nødvendige for dfTAT flygte fra endocytiske pathway.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heparin  Sigma CAS 9041-08-1
SYTOX Blue Invitrogen S11348
SYTOX Green Invitrogen S7020
nrL15 L-15 (–) cysteine Hyclone Special order
Fmoc-protected Amino acids Novabiochem
dfTAT Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)
Biosafety Cabinet
Inverted epifluorescence microscope Olympus model IXB1 equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). 
37 °C humidified, 5% CO2 incubator
Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
  2. Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
  3. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
  4. Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
  5. Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
  6. Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
  7. Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
  8. Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
  9. Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
  10. Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
  11. Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
  12. Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
  13. Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
  14. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
  15. Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
  16. Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).

Tags

Bioengineering cellepenetrerende peptid cytosolisk levering protein fluorescensmikroskopi cellekultur.
Levering af proteiner, peptider eller celleimpermeable små molekyler i levende celler ved inkubering med Endosomolytic Reagent dfTAT
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Najjar, K., Erazo-Oliveras, A.,… More

Najjar, K., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT. J. Vis. Exp. (103), e53175, doi:10.3791/53175 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter