Abstract
Makromolekylära leveransstrategier utnyttjar typiskt endocytiska vägen som en väg av cellulär inträde. Men endosomala inneslutning begränsar allvarligt effektiviteten med vilken makromolekyler penetrera cytosoliska utrymmet av celler. Nyligen har vi kringgås detta problem genom att identifiera reagenset dfTAT, en disulfidbindning dimer av peptiden TAT märkt med fluorofor tetrametylrodamin. Vi har genererat en fluorescensmärkt dimer av den prototypiska cellpenetrerande peptid (CPP) TAT dfTAT, som tränger levande celler och når den cytosoliska rymden av celler med en särskilt hög verkningsgrad. Cytosoliskt leverans av dfTAT uppnås på flera cellinjer, inklusive primärceller. Dessutom är leverans inte märkbart påverka cellviabilitet, spridning eller genuttryck. dfTAT kan leverera små molekyler, peptider, antikroppar, biologiskt aktiva enzymer och en transkriptionsfaktor. I denna rapport beskriver vi de protokoll som är involverade i dfTAT-syntes och cellulär leverans. Handskriften beskriver hur man styr den mängd protein som levereras till den cytosoliska utrymmet av celler genom att variera mängden av protein som administreras extracellulärt. Slutligen de nuvarande begränsningarna av den nya tekniken och stegen i att validera leverans diskuteras. De beskrivna protokoll bör vara mycket användbart för cellbaserade analyser samt för ex vivo manipulation och omprogrammering av celler.
Introduction
Leveransen av proteiner, peptider eller celltäta små molekyler i levande celler är ofta önskvärt i många biologiska eller biotekniska tillämpningar (cellulär imaging, funktionella analyser, cellulär omprogrammering, osv.) 1-4. Många frisättningsmetoder har redan rapporterats, inklusive mikroinjektion, elektroporering, eller användning av bärare medel (t ex., Cellpenetrerande peptider såsom TAT, lipider) 5-7. Varje teknik har typiskt specifika fördelar och nackdelar som kan göra dessa metoder tillräckligt för vissa tillämpningar, men inte för andra. Vanliga problem innebär dålig leverans effektivitet och / eller brist på kontroll över hur mycket material levereras 8,9, toxicitet eller skadlig fysiologisk effekt 10,11, brist på tidskontroll, leverans i några celler, men inte i en hel befolkning (t.ex.., mikroinjektion) 12, och komplex kemisk konjugering eller formuleringssystem 11.
s = "jove_content"> Nyligen har vi utvecklat ett nytt leveransstrategi som kringgår dessa begränsningar. Denna strategi bygger på en peptid som heter dfTAT (dimer fluorescerande TAT) 13. dfTAT härleds från välkända cellpenetrerande peptid (CPP) TAT. dfTAT innehåller två disulfidbundna kopior av TAT märkta med fluoroforen tetrametylrodamin. Trots deras likheter, TAT och dfTAT skiljer sig avsevärt i aktivitet. TAT är typiskt internaliseras i celler genom endocytos. Detta CPP förblir dock mestadels instängd endosomer (detta brukar leda till en punktformig fördelning av peptiden inuti celler vid undersökning av fluorescensmikroskopi). Liksom TAT är dfTAT effektivt endocytoseras av cellerna. Däremot dfTAT inte hålla instängd endosomer. Istället förmedlar det endosomala läckage på ett sätt som är extremt effektiv. Den endosomolytic aktivitet dfTAT kan sedan utnyttjas för att leverera makromolekyler genom en enkel inkubation analys.
ntent "> Den nuvarande förståelsen av leveransprocessen är som följer. dfTAT inducerar macropinocytosis. Som ett resultat av celler inkuberade med dfTAT ta upp lösliga proteiner, peptider eller små molekyler (molekyler av intresse, MOI) som föreligger i media genom fluid fas endocytos (se figur 1). Interaktioner mellan dfTAT och MOI är inte nödvändigt så länge båda enheterna trafik tillsammans inom endocytiska vägen. Som dfTAT når en viss tröskel inom lumen endocytic organ, uttrycker den sin endosomal läckage aktivitet (de molekylära detaljerna återstår att vara fullt karakteriserad). Innehållet i lumen av läckande organeller, och därför MOI, släpps sedan in i cellerna. Denna metod är därför mycket bekväm eftersom inga konjugering eller formuleringssystem med MOI krävs. Dessutom, på grund dfTAT är inte direkt modifiera en MOI, bör det inte heller störa MOIs funktion när intracellulär leverans uppnås. Dessutom koncentrationen avdfTAT används leverans är oberoende av MOI i media. Exempelvis kan dfTAT koncentration hållas konstant mellan olika experiment för att garantera reproducerbara effektivisera endosomal läckage. Däremot kan koncentrationen av MOI i media gradvis ändras för att uppnå önskade nivåer av MOI levereras i cytosolen.Den höga endosomala läckage effektivitet uppnås med dfTAT är anmärkningsvärt oskadlig för många av de testade hittills celler. Detta är en överraskning eftersom endocytic organ är viktig del av cellerna och man skulle förvänta sig att den dramatiska läckage förmedlas av dfTAT skulle åtföljas av skadliga cellulära svar. Ändå behandlade cellerna föröka sig i samma takt som obehandlade celler och visar inte några väsentliga förändringar i deras transkriptom. Dessutom kan leverans upprepas inom några minuter med reproducerbara leverans effektivitet, vilket tyder på att celler kan antingen tolererar eller återhämta sig från leveransprocessen utan att förloraderas förmåga till endocytos eller endosomal läckage. Subtila cellulära svar kan ske under dfTAT leverans och de molekylära detaljerna i vad dessa svar skulle kunna återstår att utforskas. Men genom att kombinera hög effektivitet, bekvämlighet protokoll, och brist på toxicitet, bör denna leverans tillvägagångssätt vara omedelbart användbar i många cell-baserade applikationer. De protokoll som presenteras här syftar till att göra denna teknik tillgänglig för forskarsamhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Syntes
Obs: dfTAT framställs i två steg: syntes av monomeren fTAT genom fastfas-peptidsyntes följt av disulfidbindning dimerisering för att bilda dfTAT.
- Swell 500 mg Rink Amide MBHA-harts i dimetylformamid (DMF) i en standard 50 ml SPPS kärlet under en timme.
- Utför Fmoc-avskyddning genom inkubation av Fmoc-skyddade hartset i en 20% piperidinlösning (20% piperidin i DMF, 10 ml (0,30 mmol). Utför avskyddande steg två gånger (1 x 5 min och 1 x 15 min) med ett tvättsteg med användning av DMF (tvättningssteget innefattar sköljning av hartset ett flertal gånger med en total volym på ca 150 ml DMF och avlägsna lösningsmedlet genom vakuumfiltrering) i mellan reaktioner.
- Syntetisera CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) på rinken amid MBHA. Använd följande Fmoc-skyddade aminosyror: Fmoc-Lys (Mtt) -OH (endast på N-änden), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- Gln (Trt) -OH, och Fmoc-Cys (Trt) -OH. Genomföra reaktionen med användning av N 2 (20 PSI) att omröra reaktionen. Utför alla reaktioner vid RT.
- Utför varje aminosyra kopplingsreaktion för fyra timmar. För varje koppling, använd Fmoc-skyddade aminosyran (1,2 mmol), N, N, N ', N'-Tetramethyl- O- (1 H-bensotriazol-1-yl) uronium-hexafluorofosfat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ), och diisopropyletylamin (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) upplöst i DMF. Efter 4 h kopplingen, tvätta hartset med DMF och utföra Fmoc avskyddningssteget såsom beskrivs i steg 1,2.
- Upprepa tills den linjära peptidkedjan av fTAT (Linear peptidkedjan: CKRKKRRQRRRG ingen TMR) syntetiserades.
- Tvätta sedan harts noggrant med första DMF och efter det med diklormetan (DCM). Skölj hartset flera gånger med en total volym på approximativt 150 ml DMF eller DCM och avlägsna lösningsmedlet genom vakuumfiltrering.
- USE MALDI-TOF för att bekräfta att den erhållna peptiden har den korrekta molekylvikten.
- Gör en matrisblandning genom att tillsätta 1 mg av matris till en lösning bestående av 50 | il av 0,01% TFA i vattenlösning och 50 | il acetonitril.
- För att bekräfta linjära peptidkedja massa, använd α-cyano-4-hydroxikanelsyra. Kör en analytisk HPLC av den råa peptiden och samla 50 | il från toppen av den rena topp.
- För att preparera provet att plätera på MALDI plattan: Tillsätt 8 | il av peptiden till 2 | il av matrislösningen och placera på MALDI plattan lufttorka eller på en 37 ° C värmeplatta.
Obs: Arginin är känt för att vara en aminosyra svårt att par i SPPS. Framgångsrik koppling etableras genom att utföra en Kaiser-test 14 (t.ex. ninhydrintest). Detta test möjliggör detektion av fria aminer som kan förbli okopplad på hartset. Om en blå färg detekteras (indikerande närvaro av fria aminer), kopplings spakterna upprepas.
- För CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), klyva Mtt skyddsgruppen på a-aminogruppen hos Lys på CK (-NH-MTT) TATG med en lösning som består av 1% trifluorättiksyra (TFA) och 2% triisopropylsilan (TIS) i DCM.
- Eftersom avlägsnandet av MTT skyddsgruppen skulle resultera i uppkomsten av en gul färg, inkubera hartset med 20 ml av ovanstående lösning för 5 minuter, upprepa detta tills ingen gul färg observeras. Tvätta hartset med DCM och DMF i mellan. Dessutom eftersom TIS är en asätare som skulle rensar MTT, när ingen gul färg uppträder i lösningen i närvaro av MTT.
- Tillsätt en ytterligare lösning med 1% TFA i DCM (ingen TIS) till hartset för att försäkra inte mer MTT avlägsnas och lösningen förblir klar.
- Lös tre komponenter: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU, och DIEA (4, 3.9 och 10 likvärdighet i förhållande till mängden harts (i mg)) i DMF och tillsätt denna blandningtill hartset och utföra reaktionen O / N med användning torr N 2 för att åstadkomma omröring.
- Efter Fmoc-avskyddning och aminosyra konjugering, tvätta hartset med DCM och låt den torka. För fullständig klyvning av peptiden från hartset, tillsätt en lösning innehållande 92,5% TFA, 2,5% H2O, 2,5%, TIS, och 2,5% etanditiol (EDT) (total volym = 4 ml) till peptidyl-hartset under 3 h vid RT för att uppnå global avskyddning och klyvning från hartset.
- Fälla ut de råa peptidprodukter med hjälp av kall vattenfri etyleter (Et 2 O) genom avtappning av lösningen från steg 1,6 till 40 ml Et 2 O, snurra detta ned vid 4 ° C och 4000 x g under 20 - 25 minuter. Upprepa detta steg för att möjliggöra tvättning av fällningen med kall vattenfri Et 2 O.
- Resuspendera fällningen i vatten (5 ml eller tills fällningen är fullständigt upplöst) och lyofilisera. Sedan resuspendera produkter som framställs i 0,1% vattenbaserad TFA / acetonitril.
<li> Utför HPLC-analys med en analytisk C18-kolonn (5 | j, m, 4 x 150 mm) för att analysera varje peptid. Använd en flödeshastighet av 1 ml / min, och detektion vid 214 nm och 550 nm. - Utför semipreparativ HPLC på en C18 10 x 250 mm kolonn för peptidrening. Använd en flödeshastighet av 4 ml / min, och detektion vid 214 nm och 550 nm. För alla körningar, använda linjära gradienter av 0,1% vattenbaserad TFA (lösningsmedel A) och 90% acetonitril, 9,9% vatten och 0,1% TFA (lösningsmedel B).
- Bekräfta rätt identitet av peptider genom MALDI-TOF enligt tillverkarens protokoll: fTAT, förväntade massan: 2,041.17, observerade massan: 2040,66. DEAC-K9, förväntade massan: 1,412.97, observerade massan: 1,415.59. Använd en α- cyano-4-hydroxikanelsyramatris för MALDI-TOF.
2. oxidationsreaktion: dfTAT Generation
- Lufta fosfatbuffrad saltlösning (PBS), pH 7,4 under 1 timme (minst 5 ml för reaktionen nedan).
- Lös fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) i Aerated PBS pH 7,4 (5 ml). Se till att pH-värdet ligger mellan 7,0 - 7,5 efter tillsatsen av peptiden. Om inte lägga till natriumhydroxid (1 M, i små steg 1 - 5 pl) för att bringa pH tillbaka upp till 7,4.
- Obs: Syrgas löst i PBS verkar för att oxidera de tiolgrupper på fTAT och bilda en disulfidbindning.
- Vicka reaktions O / N för att tillåta den att reagera tills fullbordan (100% utbyte baserat på HPLC-analys). Rena produkten med användning av omvänd-fas-HPLC och analysera genom masspektrometri (MALDI-TOF) som i steg 1,9. Förväntade massan: 4,080.34, observerade massan: 4,084.21.
- Lyofilisera ren dfTAT (0,71 x 10 -4 mmol) och återsuspendera i 200 pl vatten (koncentration ren dfTAT = 356,3 M).
3. Mätning dfTAT Koncentration
- Resuspendera en alikvot av den renade dfTAT (typiskt 1 | j, l, beroende på mängden peptid renad) i en 149 | il 50 mM TCEP lösning.
- Obs: I detta steg dfTAT reduceras till sin monomer motsvarighet fTAT att eliminera absorbans utsläckning som uppstår på grund av närheten till TMR fluoroforen i dfTAT (extinktionskoefficienten ε av TMR i dfTAT reduceras i jämförelse med den ε av TMR i reducerad fTAT).
- Låt provet reagera under ca 20 min (kan analytisk HPLC användas för att bekräfta bildandet av fTAT).
- Lägg all lösning till kvartskyvett och mät absorbansen vid 556 nm.
- Använda Beers lag (A = εcl: ε = 91.500 M -1 cm -1) för att beräkna koncentrationen av fTAT, bestämma koncentrationen av dfTAT och dividera [fTAT] av två.
4. Cellulära Leverans Experiment
- Seed cellerna (HeLa, HDF, osv.) I en maträtt på en confluency av 80-90% (t.ex. 8-brunn eller 24-bra maträtt). Odla celler i ett lämpligt medium (t.ex., DMEM kompletterat med 10% FBS och Pen / Strep) tills 80 - 90% konfluens i en 37 ° Cfuktig atmosfär innehållande 5% CO2.
- Tvätta cellerna tre gånger (3X) med PBS (genom tillsats av 200 pl av PBS och därefter avlägsna den tre gånger).
- Gör en 5 iM arbetskoncentration av dfTAT genom att späda ett lager av dfTAT (i vatten) i NRL-15 media (för en 8 väl dela den totala volymen bör vara 200 l). En koncentration av 5 pM dfTAT leder till effektiv leverans (hög cytosolic leverans i mer än 90% av celler som finns i en skål) i de flesta celltyper som hittills testats (Figur 3). Emellertid kan lägre eller högre koncentrationer vara lämpligare för celltyper med en hög eller låg benägenhet för penetration.
OBS OM MEDIA: NRL-15 används för tillförsel av dfTAT eftersom den inte innehåller cystein som kan reducera disulfidbindningen i dfTAT. Men våra data tyder på att både vanliga L-15 (med cystein) och DMEM kan användas som leveransmedia. L-15 innehåller den reducerande aminosyran cystein men cystein presumably oxiderar i media för att bilda cystein (DMEM formuleras med cystein). dfTAT förblir därför intakt i dessa medier och leverans arbetar på samma effektivitet som erhålles med nrL15. - Inkubera cellerna med dfTAT (5 M) med eller utan last (t.ex.., EGFP (10 ^ M)) och hålla vid 37 ° C under 1 timme (inkubationstiden kan reduceras men dfTAT kräver normalt cirka 30 till 45 minuter för att inducera endosomal läckage ).
- Tvätta cellerna med heparin (1 mg / ml) i L-15 (3 tvättar rekommenderas) för avlägsnande dfTAT bundet till plasmamembranet hos celler.
- Inkubera cellerna med cellimpermeabel nukleär färgning, t.ex.., Sytox Blå, Sytox Green (2 pM i NRL-15), för att bestämma huruvida plasmamembranet hos celler äventyras (döda celler kommer att färgas medan levande celler inte kommer att) enligt tillverkarens protokoll.
- Bildceller med hjälp av ett fluorescensmikroskop (100X oljeimmersion eller 20X mål). Bild dfTAT med hjälp av en RFP filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm).
Obs: Lyckad leverans leder till en diffus fluorescens dfTAT hela cellen (bedöma leverans av protein eller peptid av intresse beror på ansökan). Färgning av nukleoler från fTAT (den reducerade produkten enligt dfTAT vid cytosoliskt post) kan användas som en indikation på att fluorescensen detekteras är intracellulär. fTAT kommer att brytas ned inom några timmar. Vid denna punkt kommer fluorescens nedbrytningsfragment visas som punktat. Detta ska inte förväxlas för punktat distribution som även ses om dfTAT förblir framgång instängd endosomer (detta kan hända om dfTAT är närvarande vid alltför låg koncentration).
5. controling Koncentration av MOI Levereras
- Identifiera den "optimala leverans" koncentration som krävs för att uppnå effektiv cytosoliskt frisättning av dfTAT i celltyp som används. Utför fluorescensmikroskopi på celler inkuberade med increasing koncentrationer av dfTAT. Den optimala dfTAT koncentrationen definieras som den minsta koncentration som leder till klara cytosoliskt "diffusa" TMR fluorescens i cirka 100% av cellerna i en kultur.
- Variera koncentrationen av MOI används tillsammans inkubation protokoll samtidigt som koncentrationen av dfTAT konstant (t.ex. med hjälp av dfTAT optimala leveranskoncentration). Ändra inkubationstiden till mindre än 1 timme kan också vara ett alternativ för att variera mängden MOI levereras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att bedöma skillnaden mellan fTAT och dfTAT är HeLa-celler inkuberades under 1 h med varje peptid för att bestämma skillnaden i deras cellulära lokalisering. Internalisering av de två CPP: s bedömdes med användning av fluorescensmikroskopi. Figur 2 visar att fTAT (20 | iM) lokaliserar i en punktformig fördelning. Denna fördelning stämmer överens med peptiden förblir infångat inuti endosomer. Däremot fluorescenssignalen av dfTAT (5 pM) visar en homogen fördelning genom cytosolen och kärnan. Figur 3 visar att den cytosoliska fördelningen av dfTAT observeras i ett antal olika cellinjer inklusive COLO 316, NIH 3T3, HaCaT, den svårt att transfektera Neuro-2a, MCH58, den primära cellinje HDF, DRG-F11 och NCL-H1299. 20x bilderna visar att en mycket hög andel (> 80%) i en skål visa en cytosoliskt fördelning av dfTAT utan cellulär toxicitet (ingen Sytox blå kärn staining).
För att bestämma huruvida dfTAT-medierad endosomala läckage levererar stora proteiner in i cytosolen hos cellerna. EGFP (26 kDa) väljs som ett modellprotein. Detta beror på att dess fluorescens kan användas för att detektera dess avgivning in i cellerna genom att observera lokalisering av grön fluorescens (om korrekt veckat). För att göra denna analys var EGFP och dTAT inkuberades under 1 h med celler, såsom visas i fig 4, EGFP visas ett cytosoliskt och kärn grönfluorescerande fördelning liknande vad som observerats för dfTAT hos mer än 90% av cellerna utan observerbar toxicitet.
Figur 1. Schematisk Visar Principen om dfTAT-medierad Molecular leverans. Från vänster till höger. Schematisk visar dfTAT cellulär leverans tillsammans med en cell ogenomtränglig last. Första dfTAT inducerar endocytos, vilket resulterar i uptake av dfTAT tillsammans med lasten i endocytiska vesiklar. I det andra steget dfTAT flyr från endocytiska vesiklar, vilket resulterar i frisättningen av dfTAT och celltäta molekylen in i cytosolen hos cellerna. Cytosolen av däggdjursceller är en reducerande miljö, därför i cytosolen dfTAT reduceras till dess monomer motsvarighet fTAT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fluorescens och Bright fält bilder av båda HeLa-celler inkuberade med 20 | iM fTAT (till vänster) och 5 iM dfTAT (högra panelen) med hjälp av en 100X mål. FTAT monokroma bilder visar celler som uppvisar en fluorescens punktformig distribution medan dfTAT bilder visar celler visning av en homogen cytosoliska och nukleära fluorescenc e fördelning. Skala bar:. 10 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Effektiv Leverans av dfTAT i levande celler uppnåddes i flera cellinjer. Cellinjerna som testades var följande: HeLa, NIH 3T3, COLO 316 och HaCaT, Neuro-2a, MCH58, HDF, DRG-F11 och NCL- H1299. Celler inkuberades med 5 | iM dfTAT för en timme, följt av ett tvättsteg i enlighet med protokollet och avbildas. Fluorescenssignalen detekteras var i cytosolen och kärnan av celler (övre panelen: 20X mål, bottenpanelen: 100X mål). Den cellimpermeabel nukleär färgning Sytox Blue användes för att bedöma cellviabilitet efter dfTAT behandling. Skalstrecken, 20X objektiv: 50 pm; 100X mål: 10 pm.jove.com/files/ftp_upload/53175/53175fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. dfTAT levererar Intakt EGFP in olika cellinjer. (A) HeLa (övre panelen) och NIH 3T3 (nedre panelen) celler inkuberades med EGFP (10 | iM) och dfTAT (5 | iM) i 1 timme och efter steg utfördes enligt protokoll. Bilderna visar en homogen cytosoliskt fluorescens distribution av EGFP i båda cellinjerna. Skalstrecken, 10 | j, m. (B) HeLa och primära HDF-celler inkuberades med EGFP (10 | iM) och dfTAT (5 pM) enligt protokoll. 20X bilder visar en homogen cytosolisk fluorescens distribution av EGFP och dfTAT i HeLa- och primära HDF-celler. Overlay (pseudo: vit) indikerar närvaro av dfTAT (pseudo: lila), EGFP (pseudocoleller: grön) i den cytosoliska utrymmet både HeLa och HDF-celler. Sytox blå (visas i blått) användes för att bedöma för cellviabilitet. Skala barer:. 50 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De celler som används för dfTAT leverans bör inte vara alltför sammanflytande (> 90% konfluens) eftersom detta kan påverka leveranseffektiviteten. Cellerna bör också vara friska: döda celler i kulturen kan frisätta apoptotiska fragment med vilka dfTAT kan interagera (t.ex., DNA från nedbrutna kärnor). Detta i sin tur kan interferera med leveranseffektiviteten och kvaliteten på avbildning. Celler bör tvättas noggrant för att avlägsna FBS innan du lägger dfTAT. BSA närvarande i FBS kan binda till dfTAT och detta kan sänka leveranseffektiviteten av dfTAT. Tvättar bör emellertid utföras med försiktighet eftersom överdriven kraft kan orsaka vidhäftande celler att lösgöra från odlingsskålen eller orsaka en påkänning som resulterar i lägre endocytiska uptake.When leverera ett protein / peptid med användning dfTAT, prov protein / peptidstamlösningen bör vara tillräckligt koncentrerades att undvika överdriven utspädning av NRL-15 media under inkubation: t.ex., lägga på 5 - 10 il prov till 200 μl NRL-15 rekommenderas.
Fluorescensmärkta cellpenetrerande peptider kan visa ett Ijusinducerbara membranrubbande aktivitet. 15 Detta är fallet för dfTAT när högintensiva ljusdoser används. Det kan ta sig uttryck genom bristning av intracellulära organeller (t.ex. endosomer, mitokondrier), cellyte blåsbildning och celldöd. För att minimera dessa effekter, bör försiktighet iakttas för att hålla ljusexponering till ett minimum (standard villkor som krävs för avbildning av konfokala eller epifluorescence typiskt tolereras).
Vid leverans MOI såsom proteiner, är en konfronteras med problemet att varje makromolekyl är unik och att det därför kan varje leverans experiment kräver finjustering (mer så än i fallet med DNA-transfektion, där molekylerna levereras är alltid en negativt laddad polymer framställd av A, T, G och C). Felsökning är därför viktigt och flera aspekter bör övervägas.För det första kan proteiner med mycket låga pl binda elektrostatiskt till dfTAT och inaktivera det. I motsats härtill kan proteiner med mycket höga pl konkurrera med dfTAT för bindning med negativt laddade glykosaminoglykaner på cellytan. Detta kan då minska endocytos och minskar upptaget under endosomolytic trösklar. I båda fallen är en möjlig lösning på detta problem ökar dfTAT koncentration.
Som man skulle förvänta sig, på grund av närvaron av cellulära proteaser (såsom katepsiner 16) längs den endocytiska reaktionsvägen, är nedbrytning av ifrågavarande MOI under leverans ett bekymmer. Medan dfTAT kan leverera intakta proteiner, har mängden protein som helt eller delvis bryts ned under leveransen inte fastställts. Detta är återigen en fråga som är MOI beroende och som bör följas beroende på applikationen som eftersträvas.
dfTAT är en mycket effektiv leveransmedel. Den molekylära grunden för dfTAT verksamhet remains dock oklar. Framför allt har de strukturella eller kemiska egenskaper som krävs för att uppnå endosomal fly inte identifierats. Det är därför för närvarande inte möjligt att förutsäga hur mycket struktur dfTAT kan ändras utan att ändra leverans effektivitet. Vi har redan konstaterat att disulfidbindningen närvarande i dfTAT kan ersättas med en icke-reducerbar linkern utan skadliga effekter. Ytterligare struktur-aktivitetssamband är under uppbyggnad.
Våra data antyder att det är möjligt att minska inkuberingstiden av peptiden till mindre än 1 timme (så lite som 5 minuter har utförts). Emellertid är lanseringen av dfTAT inuti cellerna inte observerats i en stor population av celler tills ca 15-30 min. Detta tyder på att korta inkubationstiden kan vara tillräcklig för dfTAT endocytos eller cellulärt upptag. Men tid krävs för endosomal mognad som krävs för dfTAT fly från endocytiska vägen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heparin | Sigma | CAS 9041-08-1 | |
| SYTOX Blue | Invitrogen | S11348 | |
| SYTOX Green | Invitrogen | S7020 | |
| nrL15 L-15 (–) cysteine | Hyclone | Special order | |
| Fmoc-protected Amino acids | Novabiochem | ||
| dfTAT | Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu) | ||
| Biosafety Cabinet | |||
| Inverted epifluorescence microscope | Olympus | model IXB1 | equipped with a heating stage maintained at 37 °C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging). |
| 37 °C humidified, 5% CO2 incubator | |||
| Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis |
References
- Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies. Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).
- Takeuchi, T., et al. Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate. ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).
- Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).
- Zhang, H., et al. Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors. Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).
- Torchilin, V. Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics. Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).
- Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses. Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).
- Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).
- Fittipaldi, A., et al. Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins. J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).
- Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide. Chembiochem. 11, 325-330 (2010).
- Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans. Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).
- Erazo-Oliveras, A., et al. Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent. Nat methods. 11, 861-867 (2014).
- Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).
- Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells. Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).
- Lautwein, A., et al. Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner. J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).
