Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifikation af sjældne bakterielle patogener ved 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Der er en række sjældne, og derfor utilstrækkeligt beskrevet bakterielle patogener som indberettes til forårsage alvorlige infektioner, især hos immunkompromitterede patienter. I de fleste tilfælde kun få data, for det meste udgivet som case-rapporter, er tilgængelige, som undersøger betydningen af ​​sådanne patogener som et smitstof. Derfor, for at tydeliggøre den patogene karakter af sådanne mikroorganismer, er det nødvendigt at udføre epidemiologiske undersøgelser, som omfatter et stort antal af disse bakterier. De anvendes i en sådan undersøgelse overvågning metoder skal opfylde følgende kriterier: identifikation af stammerne skal være nøjagtig i henhold til den gældende nomenklatur, bør de være nemme at håndtere (robusthed), økonomisk i rutinediagnostik og de har til at generere sammenlignelige resultater blandt forskellige laboratorier. Generelt er der tre strategier til identifikation af bakteriestammer i en rutinemæssig indstilling: 1) fænotypisk identifikation kendetegner Biochemical og metaboliske egenskaber af bakterierne, 2) molekylære teknikker, såsom 16S rRNA-genet sekventering og 3) massespektrometri som en ny proteom tilgang. Da massespektrometri og molekylære metoder er de mest lovende værktøjer til identifikation af en lang række bakteriearter, er disse to metoder beskrevet. Forskud, begrænsninger og potentielle problemer, når du bruger disse teknikker diskuteres.

Introduction

Sikker identifikation af sjældne patogener i rutinediagnostikken hæmmes af, at de klassiske kulturelle og biokemiske metoder er besværlige og til tider tvivlsom. Endvidere er en diagnostisk mikrobiologiske laboratorium skal bearbejde et stort antal patogener, der spænder fra nogle få hundrede til flere tusinde, dagligt, hvilket kræver brug af automatiserede systemer. Ud over forvaltningen af ​​en høj daglig kapacitet, er der behov for nøjagtig identifikation af bakteriearter. Dette er berettiget, da de adskiller sig i deres antimikrobiel følsomhed mønster og derfor korrekt identifikation giver klinikeren med væsentlige oplysninger til at vælge passende antibiotika (f.eks Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Automatiserede mikrobielle identifikationssystemer (AMIS) anvende standardiserede sæt enzymatiske reaktioner til at karakterisere de metaboliske egenskaber af bakterielle isolater fx 47 i GN kort af Amis anvendt i denne undersøgelse 52, denne strategi tillader sikker identifikation kun for et begrænset sæt af bakterier. Endvidere er databasen, et avanceret ekspertsystem, klart fokuseret på påvisning af relevante og yderst relevante bakterier af medicinsk betydning 13,15,16,36. Yderligere to systemer, er meget udbredt i laboratorier, gælder også denne biokemiske fremgangsmåde for bakteriel identifikation. Nylige undersøgelser viser en sammenlignelig identifikation nøjagtighed mellem amis anvendt i denne undersøgelse, og en af konkurrenterne (93,7% og 93,0%), mens den 3. Amis har en identifikation nøjagtighed på kun 82,4% på artsniveau 35. Sådanne uoverensstemmelser kan forklares ved kvaliteten af ​​de underliggende identifikation data referencer, versioner af kits og software, forskelle i metabolism og færdigheder af teknisk personale 35,36.

To automatiserede MALDI-TOF MS-systemer (MALDI-TOF mikrobielle identifikationssystem, mMIS) anvendes hovedsageligt. Disse systemer giver mulighed for påvisning af en lang række bakteriearter baseret på deres protein fingeraftryk massespektre. For eksempel databasen over de mMIS anvendte indeholder 6.000 referencespektrer. Identifikationssystemer baseret på massespektrometri tilbyder hurtig og pålidelig detektering af en bred vifte af mikroorganismer, herunder sjældne patogener 11,48,51. Til dato kun få direkte sammenligninger er tilgængelige mellem mMIS anvendt i denne undersøgelse og dens konkurrent 19,33. Ifølge Dæk et al. Begge systemer giver en tilsvarende høj identifikation nøjagtighed, men de mMIS anvendt i denne undersøgelse synes at være mere pålidelige til identifikation af arter 19.

Tilsvarende adressering molekylære teknikker velbevarede men også distinkte gener ( rpoB) tillader en klar arter identifikation 3,22,61. Blandt disse, 16S rDNA er den mest udbredte housekeeping-genet på grund af sin tilstedeværelse i alle bakterier 34. Dens funktion er uændret og endelig med omtrent 1500 bp, den er lang nok til at være egnet til bioinformatik 14,34. Mange forskere anser 16S rRNA-genet analyse som "gold-standard" for bakteriel identifikation 21. Dette skyldes det faktum, at kun få laboratorier anvender DNA-DNA-hybridisering teknikker til dato for identifikation af sjældne eller nye bakterier 14,34. Derudover flere og flere databaser er tilgængelige, som kan anvendes til 16S rRNA-genet analyse 50. har det imidlertid tages i betragtning, at 16S rDNA baserede påvisningssystemer har en begrænset følsomhed sammenlignet med standard-PCR-protokoller. Desuden er den molekylære tilgang er sofistikeret, tidskrævende og kræver højtuddannet personale samtdedikerede laboratoriefaciliteter og er derfor ikke let implementeres i rutinediagnostik 55. Endvidere er det blevet vist, at kombinationen af ​​mindst to forskellige metoder til bakteriel identifikation fører til meget nøjagtige stamme identifikation. Kombinationen af ​​MALDI-TOF MS og 16S rDNA-sekventering muliggør identifikation af et stort antal forskellige bakteriearter med stor nøjagtighed. For nylig kombinationen af MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet analyse blev præsenteret for bakteriel identifikation studere epidemiologiske spørgsmål og sjældne patogener 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ekstraktion af bakteriel DNA

  1. Fremstilling af PBS-opløsning
    1. Afvej 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O og 8,80 g NaCl i en kolbe og fyld op med destilleret vand til et slutvolumen på 1000 ml. Justere pH til 7,4. For den endelige anvendelse filtreres gennem et bakterie-bevis (0,22 um) filter.
  2. DNA Ekstraktion af gramnegative bakterier
    1. Streak patienten materiale på passende kulturmedier (fx Columbia blodagar), identificere og isolere potentielle patogener.
    2. Forbered ren kultur og udføre Gram-farvning for at bestemme morphotype og bekræfte renhed og af kulturen 49.
    3. Pick en enkelt bakteriekoloni og overføres ved en 1 pi engangsbrug inokulation loop i en steril 2,0 ml reaktionsrør, der indeholder 1 ml PBS-opløsning.
    4. Inkuber denne suspension i en THERMOMIXis to 95 ° C i 10 min. Efter inkubation lad den bakterielle ekstrakt (indeholdende det opløste DNA) afkøles til stuetemperatur og enten bruge det direkte til amplifikation eller opbevares ved -20 ° C til yderligere anvendelse (figur 1a).
  3. DNA Ekstraktion af grampositive bakterier
    1. Streak patienten materiale på passende kulturmedier (fx Columbia blodagar), identificere og isolere potentielle patogener. Udfør Gram-farvning for at bekræfte morphotype af kulturen.
    2. Forbered ren kultur og udføre Gram-farvning for at bestemme morphotype og bekræfte renheden af ​​kulturen.
    3. Pick en enkelt bakteriekoloni med en steril 1 pi podning loop og suspendere det i 500 pi PBS-opløsning i en 2,0 ml reaktionsglas.
    4. Der tilsættes 500 pi glasperler og overføre røret til en oscillerende homogenisator, der arbejder ved maksimal frekvens og amplitude (50 Hz), i 5 minutter. Brug glasperler på 1,0 mm i diameterat forstyrre de bakterielle cellevægge.
    5. Inkubér dette rør i 10 minutter ved 95 ° C og afkøles til stuetemperatur. Brug ekstrakten enten direkte til PCR-reaktionen eller opbevares ved -20 ° C til yderligere anvendelse.

2. 16S rDNA-PCR

  1. Fremstilling af amplifikationsprimere
    1. Brug primerne TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) som forward primer og RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') som revers primer 25. Forbered en primer stamopløsning med DNAse og RNAse frit vand, med en koncentration på 100 pmol / ul (100 uM) og fortynde det videre til en fungerende løsning på 10 pmol / pl. Opbevar primer materiel og brugsopløsning ved -20 ° C eller bruge direkte.
  2. Fremstilling af PCR-reaktionsblandingen
    1. Afpipetteres 1 pi af hver primer, 1 pi dNTP-blanding (100 mM), 2,5 pi af DNA-ekstrakt, 5 pi 10 x PCR-buffer (indeholdende 25 mM MgCI2), 0,25 pi Taq-polymerase (5 enheder / pl) og 39,25 pi DNAse- og RNase-frit PCR vand i en steril 200 pi reaktionsrør.
  3. PCR-protokol
    1. Start PCR program bygget som følger: Først en indledende inkuberingstrin ved 95 ° C i 5 min, som er nødvendig for at aktivere Taq-polymerase. For det andet, 35 amplifikationscykler, indeholdende en 1 min. denatureringstrin ved 95 ° C, en 1 min. primerhybridiseringstrin ved 50 ° C, og en 1,5 min primerforlængelse ved 72 ° C. Tredje, en endelig forlængelse i 10 minutter ved 72 ° C. Endelig er PCR-reaktionen afkølet til 4 ° C.
      BEMÆRK: Staphylococcus aureus og H2O tjener som positiv og negativ kontrol (figur 1b).
    2. Anbring rør indeholdende PCR-reaktionsblandingen i thermocycler og starte programmet.
  4. Oprensning af PCR-produktet
    BEMÆRK: For at oprense PCR-produktet, adskillige protokoller entenenzymbaseret eller med en silica adsorptionsmatrixen kan anvendes. Den fælles-trins PCR oprydning bruges her udnytter to hydrolytiske enzymatiske reaktioner. Mens exonuklease I (Exo I) fjerner enkeltstrenget DNA, reje-alkalisk phosphatase (SAP) hydrolyserer ikke-inkorporerede dNTP'er. Den anden procedure er baseret på en silica-membran adsorptionsteknik med en høj saltkoncentration hurtig binding - vask - lav salteluering cyklus.
    1. Tilføj 1,5 pi af en enzymatisk blanding indeholdende både Exo I og SAP til 25 pi PCR-produkt, blandes omhyggeligt og overføres til en thermocycler anvende en simpel protokol af første 15 minutter ved 37 ° C efterfulgt af 15 minutter ved 80 ° C. Opbevar det oprensede PCR-produkt enten ved -20 ° C eller bruge det direkte som mål for mærkning PCR.

3. DNA Agarosegelelektroforese

  1. Fremstilling af elektroforesebufferen (TBE-puffer)
    1. Titrere 54,0 g (445 mM) Tris-base, 27,5 g (445 mM) borsyre og 20 ml af en 0,5 M EDTA (10mM) ved pH 8,0 med NaOH i en kolbe og fylde den med destilleret vand til et samlet volumen på 1000 ml. Derefter fortyndes denne 5x buffer 1:10 med destilleret vand (0,5 x TBE) til elektroforese.
  2. Forberedelse af Loading Buffer
    1. Bland 250 mg bromphenolblåt, 250 mg xylencyanol FF og 15 g polysucrose (Materialetabel) i en kolbe. Og fyld den med 0,5x TBE puffer til et samlet volumen på 100 ml. Alikvot lastning farvestof til 1 ml portioner og opbevares ved -20 ° C til yderligere anvendelse.
  3. Støbning af agarosegelen
    1. Afvej 6 g standard elektroforese agarose til 300 ml 0,5x TBE puffer (se afsnit 3.1.1) i en kolbe, til fremstilling af en 2% (vægt / volumen) agarosegel. Derefter sætte agarose blandingen i en mikrobølgeovn, varme det nær kogepunkt, indtil agarose er helt opløst, og opløsningen er klar.
    2. Lad de smeltede agarose afkøles tilstrækkeligt, og der tilsættes 10 ul af en 1% (vægt / volumen) ethidiumbromid stock Solution. Hæld opløsningen i en støbt og placere en gel kam (tillader i 30 brønde) i afstøbningen. Fjern kammen, når gelen er helt størknet, og gelen ind i elektroforese kammer indeholdende 0,5x TBE puffer.
      BEMÆRK: Ethidiumbromid er giftigt og mutagent. Det bør derfor håndteres med forsigtighed. Det er tilrådeligt at bruge nitrilhandsker. Der findes alternative interkalerende nucleinsyrefarver der kan anvendes som et ikke-toksisk alternativ.
  4. Agarosegelelektroforese af PCR-produkterne
    BEMÆRK: For at kontrollere den korrekte størrelse af PCR amplikoner og at estimere DNA-koncentration det rensede PCR-produkt separeres i en agarose gel.
    1. Pipetter 2 ul af ladningsbuffer til en PCR-reaktion rør og tilsæt 8 pi af PCR-produktet. Pipettere denne blanding i brøndene på gelen. Tilsæt 8 pi af en molekylvægt størrelsesmarkør (DNA-stige) i en separat brønd at anslå størrelsen af ​​PCR-produktet.
    2. Ansøgeen konstant spænding på 10 V / cm og stoppe elektroforese som snart bromphenolblåt markør har nået ca. ¾ af den samlede længde af gelen. Visualisere de adskilte PCR-fragmenter ved anvendelse af en UV-transilluminator (bølgelængde 302 nm) og dokumentere dem ved hjælp af en gel-dokumentationssystem. Anslå størrelsen af ​​DNA ved visuel sammenligning med DNA-stige. Brug ca. 10 ng som mål for mærkning PCR.

4. Sanger sekventering

  1. Cycle Sequencing PCR
    BEMÆRK: Udfør PCR mærkning i en 10 pi reaktion under anvendelse af et kommercielt kit (Materialer tabel).
    1. Tilsæt 2 pi 5x reaktion mastermiksens, 2 pi af DNA-præparat, 1,5 pi TPU1 eller RTU4 arbejdsopløsning (10 pmol / pl) og 4,5 pi DNAse og RNase-frit vand.
    2. Put denne sekventering reaktion mix i en thermocycler og køre en anden PCR. I alt proces 25 cykler bestående af et denatureringstrin (96 ° C,10 sek), et udglødningstrin (45-60 ° C, 5 sek) og en forlængelsestrin (60 ° C, 2 min). Endelig afkøles reaktionsblandingen til 4 ° C.
  2. Oprensning af sekventeringsreaktionen
    1. Oprens mærkning reaktionsblandingen under anvendelse af kommercielle spin-søjler til PCR oprensning (Materialer tabel).
    2. Load 10 pi af sekventeringsreaktionen på præ-hydreret gel-filtrering matrix og udføre en centrifugeringstrin ved 750 xg i 3 min.
      BEMÆRK: Ved anvendelse af denne procedure ikke-inkorporerede farvestof terminatorer tilbageholdes i gelmatrixen.
    3. Tør derefter det vandige eluat i et vakuum koncentrator. Centrifuger ved 2.500 xg i 20 til 30 minutter ved 40 ° C til fuldstændig tørhed.
    4. Tilsæt 10 pi stærkt deioniseret formamid derefter denaturering ved 90 ° C i 2 minutter og afkøl blandingen på is. Afpipetteres 10 pi af de denaturerede prøver på en 96 brønds pi plade. Opbevar tørret og renset PCR-produkt ved -20 ° C, hvis analysen erskal udføres på et senere tidspunkt.
  3. 16S rRNA Gene sekventering og analyse af DNA-sekvensen
    BEMÆRK: Udfør sekvensanalyse på et automatisk sekventeringsapparat (Materialer tabel). Sequenceren anvendt her er en automatiseret fluorescens-baserede kapillarelektroforesesystem, der analyserer 4 prøver samtidigt (50 cm 4-kapillararray) med en flydende polymer 67 (fig 1c).
    1. Placer mikrotiterpladen i sequencer. Skriv en prøve plade (plade rekord) som fastlagt i to, gemme det og start sekventering køre / analyse efter trinene i en.
      BEMÆRK: Varighed af en sekvens køre er 2 timer og tilvejebringer data fra 800 til 1.000 bp.
    2. Åbn sekventering analyse software (Materialer tabel). Sekvensdata er givet som en tekstfil (.seq) og en fil, der indeholder elektroferogrammet herunder kvalitet værdier (QV) (.ab1).
      BEMÆRK: Base kald er automatisk prdannet af sekvensanalyse-software og den underliggende elektroferogram kontrolleres visuelt (f.eks tophøjde, peak separation) før sekvensen anvendes til yderligere anvendelser.
    3. Sammenlign den lagrede DNA-sekvens fil til NCBI nr databasen ved hjælp af BLAST-algoritmen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

BEMÆRK: massespektrometer bruger en 337 nm N2 laser og drives af en specifik kontrol software (Materialer tabel). Spektre er optaget i lineær tilstand og en masse på mellem 2.000 til 20.000 Da er dækket. Datafortolkning og fordeling af scores til prøverne udføres i realtid ved en analyse software (Materialetabel) (figur 1d).

  1. Fremstilling af bakterier til MALDI-TOF MS Analyse
    1. Grow bakterier af interesse (f.eks Myroides odoratimimus) på Columbia blod agar indeholdende 5% hesteblod ved 37 ° C i 18 til 24 timer, afhængigt af den bakterielle stamme (figur 2a). Udfør Gram-farvning for at verificere morphotype af organismen, der undersøges, samt renheden af ​​kulturen.
    2. Brug en tandstikker af træ til overføring af en enkelt bakteriekoloni til en brønd i en 96-brønds stål mål (figur 2b og 2c). Spot 1 pi 70% myresyre oven på lufttørret organisme på stål mål og lad det tørre i ca. 2-3 min.
    3. Derefter overlejre stedet med 1 pi matrixopløsning, indeholdende 50 mg / ml CHCA (α-cyan-4-hydroxykanelsyre) i et organisk opløsningsmiddel (50% acetonitril, 2,5% trifluoreddikesyre, 47,5% H2O).
      BEMÆRK: Syren overlay metode (på plade fremstillingsmetode) kan anvendes til at forbedre kvaliteten af ​​den massespektre. Det har vist sig, at for Gram-positive bakterier, såsom et "syreangreb" øger score values af den målte spektre 45.
      BEMÆRK: Alternativt et automatiseret prøveforberedelse systemet (Materialetabel) kan anvendes, hvor kontaktfri pletter af 1 pi 70% myresyre opløsning, og efter en første tørrecyklus, er 1 pi matrix påført på den bakterielle smear. Prøverne tørres derefter under standardiserede betingelser ved 60% relativ fugtighed og er klar til brug til analyse.
    4. Lad overhældes med matrix overlejret lufttørre igen i ca. 5 min i en hætte. Denne bakterielle overhældes med matrixen anvendes, er nu stabil i mange timer.
      BEMÆRK: Bakterielle udstrygninger uden matrix kan ikke være stabil på grund af protein nedbrydning.
  2. Udførelse af MALDI-TOF MS Analyse
    1. Indførelse af prøver
      1. Åbn styresoftware af vores mMIS (Materialer tabel).
      2. Luftes prøve lastning porten på massespektrometer ved at trykke på IN / OUT-knappen af ​​instrumentet.
      3. Åbn lastning havn efter et klik og indsæt MALDI-TOF MS target plade med den tørrede bakteriel smøre plus matrix.
      4. Luk porten og evakuere igen. Observere vakuum og når den når 4,5 x 10 -6 mbar starte måling.
    2. Sample Analysis
      1. Åbn analyse software af vores mMIS (Materialer tabel), og klik på menuen "Filer". Vælg "Ny klassifikation" og et nyt vindue "MALDI biotyper realtid klassifikation guiden" åbner. Skriv navnet på projektet, for eksempel "Myroides måling project_1, i feltet" Projektnavn ", og tryk på knappen" Ny ". Under den nye dialogboks med navnet" Nyt projekt "afkrydsningsfeltet projektnavn og fortsæt ved at trykke på knappen" OK ".
      2. I "wizard MALDI biotyper realtid klassifikation" den observere "analyt placering" vinduet åbent. Vælg målpositioner (fx A1, A2, A3 ...), højre-click enhver valgte position (angivet med en blå firkant) og vælg "Føj prøver". I automatisk åbnede tabel view type prøve navn, prøve-ID og eventuelt en kommentar. Klik på knappen "Næste" for at fortsætte.
      3. I "wizard MALDI biotyper realtid klassifikation" den observere "Valg af MALDI biotyper metoder" vinduet åbent. Vælg "Bruker Taxonomy" fra "MSP'er fra taksonomi træer" og klik på "Næste" for at fortsætte.
      4. I "wizard MALDI biotyper realtid klassifikation" den observere "Projekt resumé" vinduet åbent. Tjek de indsatte poster givet ovenfor for den faktiske klassifikation projektet. Start klassificeringen køre ved at trykke på knappen "Finish" (figur 2d - f). Målingen starter automatisk, når der er nået en passende vakuum.
      5. Følg klassificering køre, indtil målingen er fuldført. Se resultater tabellen i than "MALDI Biotyper Realtime Klassifikation Project Myroides måling project_1" åbne menuen "Vis" og klik på "Resultater".
      6. Se de "Bruker Daltonics MALDI Biotyper klassifikation Results" som HTML-fil i standard webbrowser. Print og gemme resultaterne.
    3. Mål en test standard daglig før prøve analyse for at kalibrere instrumentet og udføre instrument validering ugentligt (instrument selvtest).
      BEMÆRK: Under målingen MALDI-TOF spektre analyseres i realtid ved den analyse software (Materialer tabel). En liste over ti arter med deres respektive scorer er angivet, og fødes ind i laboratoriet informationssystem (LIS) til rapportering.
    4. Kritisk vurdere MALDI-TOF MS resultater (se repræsentative resultater) og eventuelt, omfatte andre tests, såsom biochemical- og antibiotiske følsomhed profiler eller 16S rRNA-genet sekventering og om nødvendigt, Gram-farvning fortildele en bakterieart til den mikrobiologiske rapport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS er en hidtil ukendt, hurtig og billig fremgangsmåde til mikrobiologiske rutinediagnostik. Bakteriearter identifikation ved MALDI-TOF MS producerer spektre hovedsagelig består af ribosomale proteiner, men også andre "meget konserverede proteiner med hus-føring funktioner påvirket til en minimal grad af miljøforhold" 17 .Den database over denne mMIS indeholder et stort sæt af henvisning spektre og endda bakterier, der sjældent findes i kliniske isolater kan være forsvarligt identificeres 7,56,57. Score værdier viser pålideligheden af ​​de identificerede arter. Scores over 2.300 repræsenterer en meget sandsynlig identifikation arter, en score mellem 2,000 og 2,300 indikerer en sikker identifikation art, en score mellem 1.700 og 2.000 står for en sandsynlig identifikation af arter og en score under 1.700 er ikke pålidelige. I tilfælde af mere end én art er identificeret med en score på over 2.000, yderligere TESts skal anvendes, og det er grunden til, at vi har kombineret forskellige metoder såsom 16S rDNA sekventering, API og teknikker rettet den bakterielle morpho- og / eller fænotype såsom Gram-farvning, motilitet etc. I tilfælde, hvor score er under 1.700 ovennævnte prøver skal anvendes til at opnå pålidelige artsidentifikation. En kombination af MALDI-TOF MS og 16S rDNA sekventering er påvist for nylig 56-58. Det skal understreges, at klare retningslinjer for opgørelse arter baseret på 16S rDNA sekvenshomologier stadig mangler 22,61. Til praktisk fortolkning, homologier ≥97%, som foreslået af Stackebrandt og Göbel 61, anvendes 56. Fremskridt inden DNA-sekventering tillader bestemmelsen af ​​hele bakterielle genomer ved næste generation teknikker med relativt lave omkostninger, og derfor i princippet identifikation af bakterier baseret på deres genom sekvens. Denne teknik er allerede blevet anvendt igenome baseret udbrud ledelse eller i epidemiologi 9,29. Men den stærkeste begrænsning dag er manglen på nem at bruge softwarepakker for slutbrugeren 65.

Syv eksempler på sjældne forekommende bakterier, isoleret fra patientprøver under rutinediagnostikken og analyseret ved både MALDI-TOF MS og 16s rRNA genet sekventering er anført i tabel 1. MALDI-TOF spektra af stamme # 1 til # 6 er vist i figur 3 og et spektrum af stamme # 7, Sphingobacterium spiritivorum, er vist i figur 1e. Alle isolater viser høje scores i MALDI-TOF MS-analyse og 99 til 100% 16S rDNA sekvenshomologier. Således begge teknikker fører til sikre slægt og art identifikation. Men som påpeget i en nylig publikation på sammenligning identifikation metoder Myroides sp., Kombinationen af MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekventering ført til mere pålidelig r,esultater 56. Disse data illustrerer, at en enkelt metode ikke altid er tilstrækkelig til at opnå en pålidelig identifikation resultat. Kombinationen af to uafhængige metoder fører til en højere nøjagtighed og udvider den kommercielle MALDI-TOF MS-database med in-house poster resulterede i en utvetydig identifikation art 56.

Stamme # 1 blev identificeret som Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS score 2.490, sekvenshomologi 99%). Chryseobacteria er gramnegative, ikke-fermenterende stænger og relateret til Myroides spp. Chryseobacterium spp. betragtes som nye patogener, associeret med septikæmi, pneumoni og urinvejsinfektioner. Slægten Chryseobacterium består af et stort antal arter og de ​​bedst undersøgte arter er Chryseobacterium indologenes. Svarende til infektioner forårsaget af Myroides sp., Er for det meste immunkompromitterede patienter påvirket6,10,60. Stamme # 2 blev identificeret som Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS score 2,436, sekvenshomologi 99%) og stamme # 3 som Myroides odoratus (MALDI-TOF MS score 2.237, sekvenshomologi 99%) Myroides sp. er gramnegative, nonfermenting stænger, som er forbundet med alvorlige sygdomme, såsom sepsis, cellulitis eller lungebetændelse. Overvejende immunkompromitterede patienter med underliggende hæmatologiske eller onkologiske sygdomme påvirkes 8,18,42. Stamme # 4 blev identificeret som Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS score 2.092, sekvenshomologi 99%).

Bakterierne er gramnegative ikke-gærende stænger, som kan forårsage sepsis hos immunkompromitterede patienter 5,24,44,53. Desuden er der rapporteret et tilfælde af fatale meningoencephalitis 70. Pletterne # 5 (MALDI-TOF MS score 2,282, sekvenshomologi 100%) og # 6 (MALDI-TOF MS score 2.289, sekvens homology 100%) blev identificeret som Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Disse bakterier er korte, ikke-bevægelige, Gram-negative stave, der først blev isoleret fra larver af den parasitiske flue Wohlfahrtia magnifica og beskrevet i 2008 66. Disse zoonotiske bakterier betragtes som nye patogener og sygdomsfremkaldende agenter for bakteriæmi, sepsis eller bløddelsinfektioner 4,40,64. Interessant, de fleste patienter indberettet enten hjemløse og / eller led af alkoholisme, og derfor kan forekomsten af disse sjældne patogener forklares med højere ektoparasitter i hjemløse 4,54. Stamme # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS score 2,269, sekvenshomologi 100%), er en sjælden patogen. Det kan forårsage infektioner hos immunkompromitterede patienter og første menneskelige isolater blev beskrevet i 1982 31,71. En nylig rapport identificerer Sphingobacterium spiritivorum som agens for en fatal tilfælde af bacteremia og sepsis hos en patient med akut myeloid leukæmi 38.

figur 1
Figur 1:. Arbejdsgang for nukleinsyre og / eller massespektrometri baseret påvisning af klinisk relevante bakterier i den medicinske mikrobiologiske laboratorium Startende fra en ren kultur (a), mål-DNA amplificeres i en thermocycler (b). PCR amplikoner sekvenseres i en fire kapillær sequencer under anvendelse Sanger teknologi (c). Sekventeringsresultaterne opgøres som procent homologier af forespørgslen sekvenser til database poster ved computer assisteret sammenligning. En anden, proteomics metode anvender massespektrometri (d) og i midten en massespektroskopisk resultat af stamme # 1 i tabel 1, Sphingobacterium spiritivorum, herunder dens MALDI-TOF MS score, er angivet (e </ Strong>). En kombination af massespektrometri og 16S rRNA-genet sekventering kan være nødvendig, for at opnå en mere pålidelig og præcis identifikation arter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2:. Analyse under anvendelse MALDI-TOF MS til identifikation af klinisk relevante bakterier En operatør tager helcelle bakterielle materiale (a) med en tandstikker fra en ren kultur (b) og placerer bakterielle udstrygninger på en stål mål (c). Målet stål indsættes i lastehavnen af ​​massespektrometeret. Når tiden for korrekt vakuum på 5 x 10 -6 mbar, vil målet blive flyttet til ioniseringskammeret. Ved anvendelse af en N2--laser, er ioner skabt af blød desorption som derefter accelereret i et elektrostatisk felt (d) og separeret i flyvningen røret (e). Flyvetiden (TOF) nødvendig for ionerne til at nå detektoren af flyvningen rør (f) er direkte relateret til deres masse og danner grundlag for efterfølgende beregninger af masse toppe. Specifik identifikation software (Materialer Table) derefter tildeler score værdier til massespektret fingeraftryk af ioniserede bakterielle proteiner. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: MALDI-TOF spektre og tildelte snesevis af sjældne patogener i denne figur, repræsentativt MALDI-TOF spektre af de første seks sjældne patogener lis.ted i tabel 1 er vist. Arter navn og tilsvarende MALDI-TOF MS score er noteret i hvert spektrum. Klik her for at se en større version af dette tal.

# 3
Strain identifikation MALDI MALDI score 16s rDNA resultat BLAST homologi
# 1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% identitet
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% identitet
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% identitet
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% identitet
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabel 1: Repræsentativ MALDI-Tofferne resultater af sjældne forekommende bakterier i sammenligning med 16s rRNA genet sekventering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Både MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekventering giver mulighed for at identificere et stort antal forskellige bakterier. MALDI-TOF MS er en hurtig og billig metode, som er let at håndtere og store databaser af bakteriel massespektre er tilgængelige. Derfor MALDI-TOF MS er en hurtig, omkostningseffektiv og pålidelig metode til at foretage screening undersøgelser fokuserede på sjældne bakterielle patogener 17,20,39,51. I et prospektivt studie, der sammenlignede MALDI-TOF MS med andre fænotypiske identifikationsmetoder, Seng et al. Demonstreret omkostningseffektivitet og hastighed af MALDI-TOF MS 59 og Tan et al. Rapporterede en reduktion af reagenser og lønomkostninger for bakteriel identifikation i deres laboratorium indstilling med 56,9% årligt 62. Sådanne omkostningsbesparelser er understøttet af et notat af Gaillot et al. 28

På den anden side, 16S rDNA-sekventering er mere tidskrævende, arbejdskrævende og warrants specialiseret personnel at foretage analysen 34. Ikke desto mindre er begge tilgange er velegnede til rutinediagnostik og det kunne påvises, at kombinationen af disse to metoder fører til en højere pålidelighed og mere sikker identifikation nøjagtighed, hvilket er særligt gavnligt i tilfælde af tvivlsomme resultater 56. Derfor foreslår vi en kombination af begge metoder som den bedste metode til at kontrollere identifikation af sjældne forekommende bakterier i rutinediagnostikken. For pålidelig identifikation art, er det absolut nødvendigt at bruge rene bakteriekulturer fordi blandede kulturer forhindrer artsbestemmelse. Som sandsynlighedskontrol, artsidentifikation opnået med enten MALDI TOF MS eller 16S rDNA-sekventering skal være i overensstemmelse med resultaterne fra Gram-farvning, biokemisk karakterisering og den kliniske præsentation 49.

Massespektrometri som et analytisk redskab for bakteriel identifikation blev først foreslået i 197551. Det tog dog indtil slutningen af 1980'erne for at etablere en praktisk tilgang til protein analyse. Den "bløde desorption ionisering" teknologi blev introduceret af Koichi Tanaka i 1985 63, som modtog Nobelprisen i kemi i 2002, tillader analyse af intakte proteiner. Samtidig den matrix-assisteret ionisering time of flight-massespektrometri blev introduceret af Hillenkamp og Karas, som de var den første til at anvende en organisk syre for at analysere biomolekyler 37 og det er den metode, der stadig bruges i dag. Selv om MALDI teknologi er blevet anvendt sporadisk 23,30,41, det tog indtil 2004, hvor Bruker Daltonics introducerede sin MicroFlex MALDI Biotyper systemet (Pittcon Conference & Expo, 2004 pressemeddelelse), at MALDI-TOF MS baserede mikrobiel identifikation blev en rutine diagnostisk teknik 46. De seneste tiltag i MALDI-TOF MS-teknikker gav mulighed for at identificere gær, opdage multiresistente bakterierog udføre antimikrobiel resistensbestemmelse 17,51. Desuden er visse procedurer giver mulighed for direkte at analysere bakterier fra delprøver, såsom urin eller blod kulturer 17,51.

Selv om anvendelsen af ​​dette system er hovedsageligt let, er der nogle faldgruber, som kan påvirke resultaterne. Alderen af ​​mikroorganismerne for eksempel påvirker det bakterielle proteinekspression og derfor reproducerbarheden af ​​resultaterne. For det første kan vækstbetingelser være et problem. Som et eksempel enterobakterier, såsom Escherichia coli vokser hurtigere end ikke-fermenterende bakterier (f.eks Pseudomonas aeruginos a) og derfor skal analyseres tidligere 17. Det andet den anvendte matrix for MALDI-TOF MS består af små organiske-molekyler, der har en stærk laser optiske absorption til bølgelængden af ​​den anvendte laser. Før analyse tilsættes matrixen til prøven og begge komponenter undergår en crystallization proces danner en fast opløsning.

Dette forklarer, hvorfor ændringer i matricen kan påvirke nøjagtigheden af den bakterielle identifikation 17. Derfor frisklavet matrix-løsninger, ikke ældre end 7 dage, bør anvendes. Tredje, mediet fra hvilke bakterier plukkes kan påvirke identifikationen resulterer 17,68. For eksempel, krystalviolet, som er en komponent af MacConkey agar, interfererer med massespektre 17. Derudover vil alt for mange bakterier anvendes på stål mål føre til lavere score og derfor påvirke identifikation nøjagtighed. Derfor er det tilrådeligt at fastlægge klare kriterier for, hvordan en analyse udføres. Dog er misvisende resultater udført af MALDI-TOF MS oftest forårsaget af utilstrækkelig henvisning spektre i databasen. (I øjeblikket databasen indeholder> 6.000 poster.) Dette er især stadig tilfældet til identifikation af anaerobe bakterier 17. Men enYDERLIGERE spektre kan tilføjes af brugeren. MALDI-TOF MS-bibliotek for eksempel indeholder 98 yderligere henvisning spektre af isolater, der ikke er tilstrækkeligt behandlet i den oprindelige database, såsom Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Og Chryseobacterium sp. Derfor vil yderligere henvisning spektre føre til en højere identifikation nøjagtighed 59,69. Endelig er der i visse tilfælde spektre af forskellige arter er meget ens. Dette kan føre til fejlagtig identifikation i tilfælde som diskrimination af Escherichia coli og Shigella spp. eller Streptococcus pneumoniae og Streptococcus mitis 17,51.

Sekventering af 16S rDNA og yderligere gener, såsom rpoB har forenklet molekylær identifikation af sjældne eller ukendte bakterier. Disse gener er almindelige i de fleste bakterier og deres individuelle funktion eridentisk. Men da de besidder tilstrækkelig genetisk variabilitet for at give resultater, der tillader en differentiering på slægt og art niveau, de kan anvendes til bakterieidentifikation 34. Ifølge Stackebrandt og Göbel, homologier <97% repræsenterer forskellige arter 61. Men homologier> 97% fører ikke nødvendigvis til en sikker identifikation art 34,47. Disse usikkerheder har flere årsager.

Kvaliteten af de databaser, som anvendes til at beregne homologier er undertiden tvivlsom 34. I tilfælde, hvor høje homologier på 16S rDNA-niveau eksisterer, kan usikkerheden resultere i identifikation af arter. En kombination af forskellige genetiske regioner kan derfor føre til mere sikre resultater. Desuden er der ingen generelle retningslinjer for fortolkningen af 16S rDNA sekventering data 22,34,61. øge pålideligheden af ​​de eksisterende databaser, vil imidlertid føre til en højere accutighed for bakteriel identifikation ved hjælp af denne molekylære tilgang 34. Med hensyn til sekventering reaktion, vi har brug for at nævne, at nøjagtigheden af ​​sekventering resultater meste afhængig af kvaliteten af ​​den underliggende PCR. Da resultaterne bliver opnået ved at sammenligne dem med angivelserne i offentlige databaser, kvaliteten af ​​sekvens poster og vedligeholdelse af data er af afgørende betydning.

Generelt selv om begge tilgange, MALDI-TOF MS og 16S rRNA-genet sekventering, har fordele de har også svagheder. Kombinationen af ​​begge metoder fører imidlertid til en høj nøjagtighed for bakteriel identifikation. For eksempel, i en tidligere undersøgelse kunne vi vise, at MALDI-TOF MS er i stand til at skelne mellem Myroides odoratimimus og Myroides odoratus 56. I enkelte tilfælde MALDI score foreslog upålidelige identifikation arter, mens de opnåede resultater af 16S rDNA sekventering kunne bekræfte de arteridentitet. Masse spektrale fingeraftryk af disse isolater blev derefter skabt og indført i vores MALDI henvisning spektre database. Fremtidig forskning med fokus på andre sjældne bakterier kan demonstrere anvendeligheden af ​​den foreslåede strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

Infektion Bakterier identifikation 16S rRNA-genet sekventering MALDI-TOF MS sjældne patogener sammenligning af diagnostiske metoder mikrobiologi
Identifikation af sjældne bakterielle patogener ved 16S rRNA Gene Sequencing og MALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter