Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Er zijn een aantal zeldzame en derhalve onvoldoende beschreven bacteriële pathogenen die naar verluidt ernstige infecties name in immuungecompromitteerde patiënten. Meestal slechts weinig gegevens, meestal gepubliceerd als case reports, beschikbaar die de rol van dergelijke pathogenen als een infectieus agens onderzoeken. Teneinde het pathogene karakter van dergelijke micro-organismen te verduidelijken, moet worden epidemiologische studies waarbij grote aantallen van deze bacteriën omvatten voeren. De in dergelijke surveillance onderzoeksmethoden moeten de volgende criteria voldoen: de identificatie van de stammen moet nauwkeurig volgens de geldende nomenclatuur zijn, moeten ze gemakkelijk te hanteren (robuustheid), zuinig routine diagnostiek en zij vergelijkbaar moeten genereren resultaten tussen verschillende laboratoria. Over het algemeen zijn er drie strategieën voor het identificeren van bacteriële stammen in een routine instelling: 1) het karakteriseren van de fenotypische identificatie Biochemical en metabolische eigenschappen van de bacteriën, 2) moleculaire technieken zoals 16S rRNA gensequentie en 3) massaspectrometrie als nieuw proteoom benadering. Aangezien massaspectrometrie en moleculaire benaderingen zijn de meest veelbelovende hulpmiddelen voor het identificeren van een grote verscheidenheid aan bacteriën, zijn deze twee methoden beschreven. Vorderingen, beperkingen en mogelijke problemen bij het gebruik van deze technieken worden besproken.

Introduction

Secure identificatie van zeldzame pathogenen in routine diagnostiek wordt bemoeilijkt door het feit dat de klassieke culturele en biochemische methoden zijn omslachtig en soms twijfelachtig. Verder is een diagnostische microbiologie laboratorium een ​​groot aantal pathogenen, variërend van enkele honderden tot enkele duizenden, dagelijks, die het gebruik van geautomatiseerde systemen moeten verwerken. Naast de behandeling van een hoge dagelijks volume wordt de nauwkeurige identificatie van bacteriële species nodig. Dit is gerechtvaardigd omdat zij verschillen in hun antimicrobiële gevoeligheid patroon en dus correcte identificatie geeft de clinicus met essentiële informatie om juiste antibiotica te kiezen (bijvoorbeeld Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Geautomatiseerde microbiële identificatiesystemen (AMIS) gestandaardiseerde sets enzymatische reacties van toepassing op de metabolische eigenschappen van bacteriële isolaten karakteriseren bijvoorbeeld 47 in de GN kaart van het AMIS gebruikt in deze studie 52 Deze strategie toelaat veilige identificatie slechts een beperkt aantal bacteriën. Bovendien is de database een geavanceerd expertsysteem, duidelijk gericht op detectie van relevante en zeer relevante bacteriën van medisch belang 13,15,16,36. Twee andere systemen op grote schaal gebruikt in laboratoria, ook deze biochemische benadering voor bacteriële identificatie passen. Recente studies tonen vergelijkbare identificatie nauwkeurigheid tussen de in deze studie AMIS en één van de deelnemers (93,7% en 93,0% respectievelijk), terwijl de 3 e AMIS een identificatie nauwkeurigheid van slechts 82,4% op species niveau 35. Dergelijke verschillen kunnen worden verklaard door de kwaliteit van de onderliggende identificatiegegevens gevonden, versies van kits en software, verschillen in metabolisme en vaardigheid van technisch personeel 35,36.

Twee automatische MALDI-TOF MS systeem (MALDI-TOF microbiële identificatiesysteem, MMIS) worden hoofdzakelijk gebruikt. Deze systemen zorgen voor detectie van een groot aantal bacteriesoorten basis van hun eiwitten vingerafdruk massaspectra. Bijvoorbeeld, de databank van de MMIS gebruikte bevat 6000 referentiespectra. Identificatiesystemen op basis van massaspectrometrie bieden een snelle en betrouwbare detectie van een grote verscheidenheid aan micro-organismen waaronder zeldzame pathogenen 11,48,51. Tot op heden zijn slechts een paar directe vergelijkingen zijn beschikbaar tussen de in deze studie gebruikte MMIS en zijn concurrent 19,33. Volgens Dæk et al. Beide systemen een soortgelijk hoge nauwkeurigheid van identificatie, maar de in deze studie MMIS lijkt betrouwbaarder soortenidentificatie 19 zijn.

Op dezelfde manier, het aanpakken van moleculaire technieken goed geconserveerd, maar ook verschillende genen ( rpoB) laten een duidelijke soortidentificatie 3,22,61. Van deze, het 16S rDNA is de meest gebruikte housekeeping gen vanwege zijn aanwezigheid in alle bacteriën 34. Zijn functie blijft ongewijzigd en tenslotte, met ongeveer 1500 bp, het is lang genoeg is geschikt voor bio-informatica 14,34 te zijn. Veel onderzoekers beschouwen 16S rRNA-gen-analyse als de "gouden standaard" voor bacteriële identificatie 21. Dit komt door het feit dat weinig laboratoria DNA-DNA-hybridisatie technieken datum voor identificatie van zeldzame of nieuwe bacteriën 14,34. Bovendien, steeds meer databases beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor het 16S rRNA gen analyse 50. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat 16S rDNA gebaseerde detectiesystemen hebben een beperkte gevoeligheid dan standaard PCR-protocollen. Bovendien is de moleculaire benadering is verfijnd, tijdrovend en vereist goed opgeleid personeel engespecialiseerde laboratoria en is daarom niet gemakkelijk geïmplementeerd in routine diagnostische 55. Verder is aangetoond dat de combinatie van ten minste twee verschillende methoden voor bacteriële identificatie leidt tot zeer nauwkeurige stamidentificatienummer. De combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rDNA sequentie maakt de identificatie van grote aantallen verschillende bacteriële soorten met hoge nauwkeurigheid. Onlangs heeft de combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rRNA gen-analyse werd gepresenteerd voor bacteriële identificatie bestuderen epidemiologische vragen en zeldzame ziekteverwekkers 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Winning van bacterieel DNA

  1. Bereiding van PBS oplossing
    1. Weeg 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2H 2 O en 8,80 g NaCl in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een eindvolume van 1000 ml. Breng de pH op 7,4. Voor gebruik in definitieve filteren de oplossing door een bacterie-proof (0,22 pm) filter.
  2. DNA-extractie van Gram-negatieve bacteriën
    1. Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers.
    2. Bereid pure cultuur en het uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype te bepalen en om de zuiverheid te bevestigen en van de cultuur 49.
    3. Kies een enkele bacteriële kolonie en breng het met een 1 pl eenmalig gebruik enting lus in een steriele 2,0 ml reactie buis die 1 ml PBS-oplossing bevat.
    4. Incubeer deze suspensie in een thermomixer bij 95 ° C gedurende 10 minuten. Na incubatie liet het bacteriële extract (die het opgeloste DNA) afkoelen tot kamertemperatuur en ofwel zodanig gebruikt voor amplificatie en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik (figuur 1a).
  3. DNA Extraction van Gram-positieve bacteriën
    1. Streak de patiënt materiaal op de juiste cultuur media (bijvoorbeeld Columbia bloed agar), identificeren en te isoleren potentiële ziekteverwekkers. Uitvoeren Gram-kleuring om morfotype van cultuurbevestigende.
    2. Bereid reincultuur en uitvoeren van Gram-kleuring om morfotype bepalen en zuiverheid van cultuurbevestigende.
    3. Kies een enkele bacteriële kolonie met een steriele 1 pi enting lus en hang deze in 500 ul PBS oplossing in een 2,0 ml reactie buis.
    4. Voeg 500 ul glazen kralen en breng de buis een oscillerende homogenisator werkt bij maximale frequentie en amplitude (50 Hz), gedurende 5 min. Gebruik glazen kralen met een diameter 1,0 mmde bacteriële celwanden verstoren.
    5. Incubeer de buis 10 minuten bij 95 ° C en koel af tot kamertemperatuur. Met het extract rechtstreeks voor de PCR-reactie of bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.

2. 16S rDNA PCR

  1. Bereiding van amplificatieprimers
    1. Gebruik de primers TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) als voorwaartse primer en RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') als reverse primer 25. Bereid een primer voorraad oplossing met DNAse en RNAse gratis water, met een concentratie van 100 pmol / ul (100 uM) en vul het verder om een ​​werkende oplossing bij 10 pmol / pl. Bewaar de primer voorraad en werkende oplossing bij -20 ° C of direct te gebruiken.
  2. Bereiding van de PCR-mix
    1. Pipetteer 1 ul van elke primer, 1 ui dNTP-mengsel (100 mM), 2,5 pi van het DNA-extract, 5 gl 10 x PCR-buffer (bevattende 25 mM MgCl 2), 0,25 pl Taq-polymerase (5 eenheden / ul) en 39.25 pi DNase- en RNAse gratis PCR water in een steriele 200 ul reactie buis.
  3. PCR protocol
    1. Start het PCR programma gebouwd als volgt: Ten eerste, een eerste incubatiestap bij 95 ° C gedurende 5 minuten die nodig is om het Taq-polymerase te activeren. Ten tweede, 35 amplificatiecycli, met een 1 min. denaturatiestap bij 95 ° C, 1 min. primer annealing stap bij 50 ° C, en 1,5 minuten primerverlenging bij 72 ° C. Ten derde, een laatste verlenging gedurende 10 min bij 72 ° C. Tenslotte wordt de PCR reactie afgekoeld tot 4 ° C.
      OPMERKING: Staphylococcus aureus en H 2 O fungeren als positieve en negatieve controle (Figuur 1b).
    2. Plaats de buis met het PCR-reactiemengsel in de thermocycler en start het programma.
  4. Zuivering van het PCR product
    Opmerking: Om de PCR te zuiveren, ofwel verscheidene protocollenenzymen gebaseerde of op silica adsorptie- matrix kan worden gebruikt. De single-step PCR cleanup hier gebruikt maakt gebruik van twee hydrolytische enzymatische reacties. Terwijl exonuclease I (Exo I) enkelstrengs DNA verwijdert, garnalen alkalische fosfatase (SAP) hydrolyseert zonder rechtspersoonlijkheid dNTPs. De tweede procedure is gebaseerd op een silica membraan adsorptie techniek met een hoog zoutgehalte snel binden - wassen - laag zoutelutie cyclus.
    1. Voeg 1,5 ul van een mengsel dat zowel enzymatische Exo I en SAP aan 25 ui PCR-product, meng en overbrengen in een thermocycler toepassing van een eenvoudig protocol van eerst 15 minuten bij 37 ° C gevolgd door 15 min bij 80 ° C. Bewaar het gezuiverde PCR-product, hetzij bij -20 ° C of direct gebruiken als doelwit voor PCR labelen.

3. DNA agarosegelelektroforese

  1. Bereiding van de elektroforese buffer (TBE-buffer)
    1. Titreer 54,0 g (445 mM) Tris-base, 27,5 g (445 mmol) boorzuur en 20 ml van een 0,5 M EDTA (10mM) bij pH 8,0 met NaOH in een kolf en vul met gedestilleerd water tot een totaalvolume van 1000 ml. Verdun deze 5x buffer 1:10 met gedestilleerd water (0,5x TBE) voor elektroforese.
  2. Bereiding van de laadbuffer
    1. Meng 250 mg broomfenolblauw, 250 mg xyleencyanol FF en 15 g polysucrose (Materials Table) in een kolf. Vul vervolgens 0,5x TBE buffer tot een totaal volume van 100 ml. Aliquot de lading kleurstof 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.
  3. Gieten van de Agarose Gel
    1. Weeg 6 g standaard agarose elektroforese 300 ml 0,5x TBE buffer (zie paragraaf 3.1.1) in een kolf, een 2% te bereiden (w / v) agarosegel. Dan zet de agarose mengsel in een magnetron, verwarm het bijna-kookpunt totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing lijkt duidelijk.
    2. Laat de gesmolten agarose afkoelen voldoende en voeg 10 ul van een 1% (w / v) voorraad ethidiumbromide oplostie. Giet de oplossing in een gietvorm en plaats een gel kam (rekening houdend met 30 putjes) in de gietvorm. Verwijder de kam als de gel is volledig gestold en wordt de gel in de elektroforese kamer die 0,5x TBE buffer.
      OPMERKING: Ethidiumbromide is giftig en mutageen. Daarom moet worden behandeld met de nodige voorzichtigheid. Het is raadzaam om nitril handschoenen te gebruiken. Er zijn alternatieve intercalerende nucleïnezuur vlekken die kan worden gebruikt als een niet-toxisch alternatief.
  4. Agarosegelelektroforese van de PCR- producten
    Opmerking: Om de juiste maat van de PCR amplicons verifiëren en de DNA-concentratie van de gezuiverde PCR-product wordt gescheiden in een agarose gel schatten.
    1. Pipetteer 2 pi van de laadbuffer in een PCR-reactie buis en voeg 8 pi van het PCR-product. Pipet dit mengsel in de putjes van de gel. Voeg 8 pi van een molecuulgewicht groottemarker (DNA ladder) in een aparte goed om de grootte van het PCR-product te schatten.
    2. Van toepassing zijneen constante spanning bij 10 V / cm en stop de elektroforese als de broomfenolblauw marker ¾ van de totale lengte van de gel bereikt. Visualiseer de gescheiden PCR-fragmenten met behulp van een UV-transilluminator (golflengte 302 nm) en documenteren ze met behulp van een gel-documentatiesysteem. Schatting van de hoeveelheid DNA door visuele vergelijking met de DNA-ladder. Gebruik ongeveer 10 ng als doelwit voor de etikettering PCR.

4. Sanger Sequencing

  1. Cycle Sequencing PCR
    OPMERKING: Voer de PCR labeling in een 10 ul reactie met behulp van een commerciële kit (Materials tabel).
    1. Voeg 2 pl 5x reactie mastermix, 2 pi van het DNA-preparaat, 1,5 pi TPU1 of RTU4 werkende oplossing (10 pmol / ul) en 4,5 ul DNAse en RNAse gratis water.
    2. Zet deze sequencing reactie mix in een thermocycler en start een ander PCR. In totaal werkwijze 25 cycli bestaande uit een denaturatiestap (96 ° C,10 sec), een annealing stap (45-60 ° C, 5 sec) en een verlengingsstap (60 ° C, 2 min). Koel de reactie bij 4 ° C.
  2. Zuivering van de sequentie reactie
    1. Zuiver het labeling reactiemengsel met behulp van commerciële spin kolommen voor PCR zuivering (Materials tabel).
    2. Load 10 ul van de sequentie reactie op de vooraf gehydrateerde gelfiltratie matrix en voer een centrifugatiestap bij 750 xg gedurende 3 min.
      OPMERKING: Bij de toepassing van deze procedure zonder lokaal kleurstof terminatoren worden vastgehouden in de gelmatrix.
    3. Dan droog het waterige eluaat onder vacuüm concentrator. Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 20 tot 30 minuten bij 40 ° C tot volledig droog.
    4. Voeg 10 ul van zeer gedeïoniseerd formamide dan denatureren bij 90 ° C gedurende 2 minuten en koel het mengsel op ijs. Pipetteer 10 ul van de gedenatureerde monsters op een 96 well plaat ul. Bewaar de gedroogde en gereinigd PCR product bij -20 ° C als de analyseop een later tijdstip worden uitgevoerd.
  3. 16S rRNA Gene sequentiebepaling en analyse van de DNA sequentie
    OPMERKING: Voer sequentie-analyse op een geautomatiseerde sequencer (Materials tabel). De sequencer hier gebruikt is een geautomatiseerde op fluorescentie gebaseerde capillaire elektroforese systeem 4 monsters simultaan geanalyseerd (50 cm 4-capillair array) met een vloeibaar polymeer 67 (figuur 1c).
    1. Plaats de microtiterplaat in de sequencer. Schrijf een staalkaart (plaat record) zoals uiteengezet in 2, sla het op en start de sequencing run / analyse na de stappen in 1.
      LET OP: De duur van een reeks run is 2 uur en levert gegevens van 800 tot 1000 bp.
    2. Open de sequencing analyse software (Materials tabel). Sequence gegevens worden gegeven als een tekstbestand (.seq) en een bestand met de elektroferogram zoals kwaliteits-waarden (QV) (.ab1).
      OPMERKING: Base roeping is automatisch pergevormd door de sequentieanalyse software en de onderliggende elektroferogram visueel onderzocht (bijvoorbeeld piekhoogte, piekscheiding) vóór de sequentie wordt gebruikt voor verdere toepassingen.
    3. Vergelijk de opgeslagen DNA-sequentie-bestand naar de NCBI nr database met behulp van BLAST-algoritme (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF-MS

LET OP: De massaspectrometer maakt gebruik van een 337 nm N2 laser en wordt bediend door een specifieke control software (Materials tabel). Spectra worden in lineaire modus en een massabereik 2.000 tot 20.000 Da valt. Interpretatie van de gegevens en de verdeling van de scores van de monsters wordt uitgevoerd in real time uitgevoerd door een analyse software (Materials Table) (figuur 1d).

  1. Bereiding van bacteriën voor MALDI-TOF MS Analysis
    1. Groeien de bacteriën van belang (bijvoorbeeld, Myroides odoratimimus) op ColUmbia bloed agar met 5% paardenbloed bij 37 ° C gedurende 18 tot 24 uur, afhankelijk van de bacteriestam (Figuur 2a). Uitvoeren Gram-kleuring de morfotype van het onderzochte organisme en zuiverheid van de kweek te controleren.
    2. Gebruik een houten tandenstoker voor het overbrengen van een bacteriële kolonie een putje van een 96 putjes staal target (figuur 2b en 2c). Spot 1 ui 70% mierenzuur bovenop de lucht gedroogd organisme voor het doel staal en laten drogen gedurende ongeveer 2-3 min.
    3. Vervolgens bedekken de plek met 1 pi matrixoplossing, bevattende 50 mg / ml CHCA (α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur) in een organisch oplosmiddel (50% acetonitril, 2,5% trifluorazijnzuur, 47,5% H2O).
      Opmerking: Het zuur overlay methode (op plaat bereidingswijze) gebruikt worden om de kwaliteit van de massaspectra verbeteren. Het is aangetoond dat bij Gram-positieve bacteriën dergelijke "zuuraanval" verhoogt de stand values van de gemeten spectra 45.
      OPMERKING: U een geautomatiseerd monstervoorbereiding (Materials Table) worden toegepast waarin contactloze spots van 1 ui 70% mierenzuur en na een eerste droogcyclus, 1 ui matrixoplossing worden aangebracht op het bacteriële vlek. De monsters worden vervolgens gedroogd onder gestandaardiseerde omstandigheden bij 60% relatieve vochtigheid en zijn klaar om te gebruiken voor analyse.
    4. Laat de uitstrijkjes met matrix bedekt lucht drogen weer voor ongeveer 5 min in een kap. Deze bacteriële uitstrijkje met de toegepaste matrix is ​​nu stabiel gedurende vele uren.
      OPMERKING: Bacteriële uitstrijkjes zonder matrix kan niet stabiel zijn als gevolg van afbraak van eiwitten.
  2. Het uitvoeren van de MALDI-TOF MS Analysis
    1. Introductie van de monsters
      1. Open de besturingssoftware van onze MMIS (Materials tabel).
      2. Beluchten het monster laden haven van de massaspectrometer door op de IN / OUT-toets van het instrument.
      3. Open de laadhaven na een klik en steek de MALDI-TOF-MS doel bord met de gedroogde bacteriële uitstrijkje plus matrix.
      4. Sluit de haven en weer te evacueren. Observeren vacuüm en wanneer zij tot 4,5 x 10 -6 mbar beginnen meting.
    2. monsteranalyse
      1. Open de analyse software van onze MMIS (Materials Table) en klik op het menu "Bestand". Selecteer "Nieuwe classificatie" en een nieuw venster "MALDI biotyper real time classificatie-wizard" wordt geopend. Typ de naam van het project, bijvoorbeeld "Myroides meting project_1, in het veld" naam Project "en druk op de knop" Nieuw ". Onder de nieuwe dialoogvenster met de naam" New project "naam check project en ga door op de knop" OK ".
      2. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Analyt plaatsing" geopend. Selecteer doel posities (bijvoorbeeld A1, A2, A3 ...), rechts-click elke geselecteerde positie (aangegeven met een blauw vierkant) en selecteer "samples toevoegen". In de automatisch geopend tabel type in de steekproef van naam, monster-ID en eventueel een reactie uitzicht. Klik op de knop "Next" om verder te gaan.
      3. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Selectie van MALDI biotyper methods" geopend. Selecteer "Bruker Taxonomie" van "MSP's van taxonomie bomen" en klik op "Next" om verder te gaan.
      4. In de "MALDI biotyper real time classificatie tovenaar" observeren het venster "Project summary" geopend. Controleer de geplaatste inzendingen hierboven gegeven voor de eigenlijke indeling project. Start de indeling gerund door op de knop "Finish" (figuur 2d - f). De meting wordt automatisch gestart wanneer de juiste vacuüm is bereikt.
      5. Volg de kwalificatie run totdat de meting is voltooid. Bekijk hier de resultaten tabel in thij "MALDI Biotyper Realtime Classification Project Myroides meting project_1" opent het menu "View" en klik op "resultaten".
      6. Bekijk de "Bruker Daltonics MALDI Biotyper Classification resultaten" als HTML-bestand in de standaard webbrowser. Afdrukken en de resultaten opslaan.
    3. Meet een testnorm dagelijks voorafgaand aan analyse proeven om het instrument te kalibreren en het uitvoeren van instrument validatie wekelijks (instrument zelftest).
      LET OP: Tijdens de meting MALDI-TOF spectra worden geanalyseerd in real time door de analyse software (Materials tabel). Een lijst van tien soorten met hun scores gegeven en wordt in de laboratorium informatiesysteem (LIS) voor het melden.
    4. Evalueer kritisch de MALDI-TOF MS resultaten (zie representatieve resultaten) en eventueel ook andere tests, zoals biochemische en antibioticagevoeligheid profielen of 16S rRNA gen sequencing en eventueel Gram-kleuring voortoewijzen van een bacteriële soort tot de microbiologische rapport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS is een nieuwe, snelle en goedkope methode voor het microbiologische routine diagnostiek. Bacteriesoorten identificatie door MALDI-TOF MS spectra produceert hoofdzakelijk uit ribosomale eiwitten maar ook andere "zeer geconserveerde eiwitten met huishouding functies die voor een minimale mate door omgevingsfactoren" 17 .De database dit MMIS bevat een groot aantal referentiespectra en zelfs bacteriën die zelden worden gevonden in klinische isolaten kan veilig worden geïdentificeerd 7,56,57. Score waarden van de betrouwbaarheid van de geïdentificeerde species. Scores boven 2.300 vertegenwoordigen een zeer waarschijnlijke soort identificatie, een score tussen 2,000 en 2,300 duidt op een veilige identificatie van soorten, een score tussen 1,700 en 2,000 staat voor een waarschijnlijke soort identificatie en een score lager dan 1.700 is niet betrouwbaar. In het geval van meer dan één soort worden geïdentificeerd met een score boven de 2.000, extra tests moeten worden toegepast en dit is de reden waarom wij verschillende werkwijzen zoals 16S rDNA sequencing, API en technieken aanpakken van de bacteriële morfologisch en / of fenotype zoals Gram kleuring, motiliteit etc. In het geval zou zijn wanneer de gecombineerde score onder 1,700 bovengenoemde tests worden gebruikt om betrouwbare soortenidentificatie bereiken. Een combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rDNA sequentie is onlangs aangetoond 56-58. Hierbij moet worden opgemerkt dat er duidelijke richtlijnen voor soort beslissing op basis van 16S rDNA sequentiehomologieën ontbreken nog 22,61. Voor de praktische invulling, homologieën van ≥97%, zoals voorgesteld door Stackebrandt en Göbel 61, worden gebruikt 56. Vooruitgang in DNA sequentiebepaling kunnen worden bepaald gehele bacteriële genomen volgend generatietechnieken tegen relatief lage kosten en derhalve in principe identificatie van bacteriën op basis van de genoomsequentie. Deze techniek is reeds gebruikt ingenoom gebaseerde outbreak management of in de epidemiologie 9,29. Echter, vandaag de sterkste beperking is het ontbreken van een eenvoudig te gebruiken software pakketten te gebruiken voor de eindgebruiker 65.

Zeven voorbeelden van zeldzame voorkomende bacteriën geïsoleerd uit monsters van patiënten tijdens routinematige diagnose en geanalyseerd door zowel MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie staan ​​in tabel 1. MALDI-TOF spectra van stam # 1 tot # 6 zijn getoond in figuur 3 en een spectrum van stam # 7, Sphingobacterium spiritivorum, wordt getoond in figuur 1e. Alle isolaten vertonen een hoge scores in MALDI-TOF-MS-analyse en 99-100% 16S rDNA sequentiehomologieën. Dus, beide technieken leiden tot geslachten en soorten identificatie te beveiligen. Zoals opgemerkt in een recente publicatie op het vergelijken identificatiemethoden van Myroides sp. De combinatie van MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie tot betrouwbaarder resultaten 56. Deze gegevens illustreren dat één methode niet altijd voldoende om een ​​betrouwbare identificatie resultaat bereiken. De combinatie van twee onafhankelijke methoden leidt tot een grotere nauwkeurigheid en breidt de commerciële MALDI-TOF MS databank met interne data resulteerde in ondubbelzinnige soortidentificatie 56.

Stamnummer 1 werd geïdentificeerd als Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS score 2,490, sequentiehomologie 99%). Chryseobacteria zijn Gram-negatieve, niet-fermenterende staven en gerelateerd aan Myroides spp. Chryseobacterium spp. beschouwd opkomende pathogenen, geassocieerd met sepsis, longontsteking en urineweginfecties. Het geslacht Chryseobacterium bestaat uit een groot aantal soorten en de best bestudeerde soort Chryseobacterium indologenes. Soortgelijke infecties veroorzaakt door Myroides sp., Meestal immunogecompromitteerde patiënten die6,10,60. Stamnummer 2 werd geïdentificeerd als Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS score 2,436, sequentiehomologie 99%) en de stam # 3 als Myroides odoratus (MALDI-TOF MS score 2,237, sequentiehomologie 99%) Myroides sp. Gram-negatieve, nonfermenting staven die worden geassocieerd met ernstige aandoeningen zoals sepsis, cellulitis of longontsteking. Meestal immunogecompromitteerde patiënten met onderliggende hematologische en oncologische aandoeningen worden beïnvloed 8,18,42. Stamnummer 4 werd geïdentificeerd als Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS score 2,092, sequentiehomologie 99%).

De bacteriën zijn Gram-negatieve non-vergisten van staven, die bloedvergiftiging kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde patiënten 5,24,44,53. Daarnaast is een geval van fatale meningo gemeld 70. De vlekken # 5 (MALDI-TOF MS score 2,282, sequentiehomologie 100%) en # 6 (MALDI-TOF MS score 2,289, sequentie homoloogy 100%) geïdentificeerd als Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Deze bacteriën zijn kort, niet-beweeglijk, Gram-negatieve staafjes waarvan eerst werd geïsoleerd uit larven van de parasitaire fly Wohlfahrtia Magnifica en beschreven in 2008 66. Deze zoönotische bacteriën worden beschouwd als meer ziekteverwekkers en verwekkers voor bacteriëmie, bloedvergiftiging of weke delen infecties 4,40,64. Interessant is dat patiënten meldden waren ofwel dakloos en / of lijden aan alcoholisme en daarom kan het optreden van deze zeldzame pathogenen worden verklaard door de hogere ectoparasieten in de daklozenbevolking 4,54. Stamnummer 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS score 2,269, sequentiehomologie 100%), een zeldzame pathogeen. Het kan leiden tot infecties bij immuungecompromitteerde patiënten en de eerste menselijke isolaten werden beschreven in 1982 31,71. Een recent rapport identificeert Sphingobacterium spiritivorum als verwekker voor een fataal geval van bacTeremia en sepsis bij een patiënt met acute myeloïde leukemie 38.

Figuur 1
Figuur 1:. Workflow voor nucleïnezuur en / of massa spectrometrische detectie van klinisch relevante bacteriën in de medische microbiologie laboratorium Vanuit een reincultuur (a), target DNA wordt geamplificeerd in een thermocycler (b). PCR amplicons worden gesequenced vier capillaire sequencer via Sanger technologie (c). Sequencing resultaten worden bepaald als percentage homologieën query sequenties databasevermeldingen door computerondersteunde vergelijking. Een tweede, proteomics gebaseerde methode, gebruikt massaspectrometrie (d) en in het midden een massaspectroscopische gevolg van stam # 1 in tabel 1, Sphingobacterium spiritivorum, inclusief de MALDI-TOF MS score wordt gegeven (e </ Strong>). Een combinatie van massaspectrometrie en 16S rRNA gen sequencing kan het nodig zijn, met het oog op een meer betrouwbare en nauwkeurige soortidentificatie bereiken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Analyse procedure met behulp van MALDI-TOF MS voor de identificatie van klinisch relevante bacteriën exploitant draait gehele cellen bacterieel materiaal (a) met een tandenstoker uit een reincultuur (b) en plaatst bacteriële vlekken op een stalen doel (c). De stalen doelstelling wordt ingebracht in de lading poort van de massaspectrometer. Wanneer de juiste vacuüm van 5 x 10 -6 mbar bereikt is, wordt het doel worden verplaatst naar de ionisatiekamer. Met een N2 LASEr, ionen door zachte desorptie die vervolgens versneld in een elektrostatisch veld (d) en gescheiden in de straalbuis (e). De time of flight (TOF) nodig voor de ionen naar de detector van de straalbuis (f) direct verband met hun massa en vormt de basis voor de volgende berekeningen van massapieken. Specifieke identificatie software (Materials Table) wijst vervolgens score waarden van de massa spectrum vingerafdruk van geïoniseerde bacteriële eiwitten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: MALDI-TOF spectra en scores toegewezen van zeldzame pathogenen In deze figuur representatief MALDI-TOF spectra van de eerste zes zeldzame pathogenen lis.ted in Tabel 1 getoond. Soortnaam en de bijbehorende MALDI-TOF MS score worden genoteerd in elk spectrum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

# 3
spanning MALDI identificatie MALDI score 16s rDNA resultaat BLAST homologie
# 1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% identiteit
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% identiteit
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% identiteit
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% identiteit
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identiteit
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identiteit
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabel 1: Representatieve MALDI-TOFS resultaten van zeldzame voorkomende bacteriën in vergelijking met 16S rRNA gensequentie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zowel MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie bieden de mogelijkheid om grote aantallen verschillende bacteriën te identificeren. MALDI-TOF MS is een snelle en goedkope methode die gemakkelijk te hanteren en grote databases van bacteriële massaspectra zijn. Daarom MALDI-TOF MS is een snelle, kosteneffectieve en betrouwbare methode voor screening studies gericht op zeldzame bacteriële pathogenen 17,20,39,51 voeren. In een prospectieve studie ter vergelijking van MALDI-TOF MS met andere fenotypische identificatiemethoden, Seng et aangetoond kosteneffectiviteit en snelheid van MALDI-TOF MS 59 en Tan al. Et al. Rapporteerde een daling van de reagens en de arbeidskosten voor bacteriële identificatie in hun laboratorium omgeving met 56,9% per jaar 62. Dergelijke kostenverminderingen worden ondersteund door een nota van Gaillot et al. 28

Anderzijds, 16S rDNA sequentie is tijdrovend, arbeidsintensief en garandeert gespecialiseerde pERSONEEL de analyse 34 uitgevoerd. Niettemin beide benaderingen zijn geschikt voor routinematige diagnose en het kan worden aangetoond dat de combinatie van deze twee methoden leidt tot een hogere betrouwbaarheid en veiliger identificatie nauwkeurigheid, wat vooral gunstig bij twijfelachtige resultaten 56. Daarom stellen wij de combinatie van beide methoden als de beste benadering voor de identificatie van zeldzame voorkomende bacteriën verifiëren in routine diagnostiek. Voor een betrouwbare identificatie van soorten, is het absoluut noodzakelijk om zuivere bacterieculturen gebruiken omdat gemengde culturen te voorkomen soort vastberadenheid. Als een plausibiliteitscontrole, soortidentificatie verkregen met ofwel MALDI TOF MS of 16S rDNA sequencing moet in overeenstemming zijn met de resultaten van de Gram-kleuring, biochemische karakterisering en de klinische presentatie 49.

Massaspectrometrie als een analytisch instrument voor bacteriële identificatie werd voor het eerst voorgesteld in 197551. Het duurde echter tot in de late jaren 1980 tot een haalbare aanpak voor eiwitanalyse vast te stellen. De "soft desorptie ionisatie" technologie werd geïntroduceerd door Koichi Tanaka in 1985 63, die de Nobelprijs in 2002 ontving voor chemie, waardoor de analyse van intacte eiwitten. Op hetzelfde moment dat de matrix-geassisteerde ionisatie vluchttijd massaspectrometrie werd geïntroduceerd door Hillenkamp en Karas zij waren de eerste die een organisch zuur om biomoleculen 37 analyseren en dit is de werkwijze die nog steeds wordt toegepast. Hoewel de MALDI-technologie is sporadisch 23,30,41 is gebruikt, het duurde tot 2004 toen Bruker Daltonics introduceerde haar microflex MALDI Biotyper systeem (Pittcon Conference & Expo 2004, persmededeling), die MALDI-TOF MS op basis van microbiële identificatie werd een routine diagnostische techniek 46. Recente benaderingen in MALDI-TOF-MS-technieken gaf de mogelijkheid om gist te identificeren, op te sporen multiresistente bacteriënen uit te voeren op antimicrobiële gevoeligheid getest 17,51. Bovendien bepaalde procedures bieden de mogelijkheid om direct bacteriën uit primaire monsters, zoals urine of bloed culturen 17,51 analyseren.

Hoewel het gebruik van dit systeem is vooral gemakkelijk, zijn er enkele valkuilen die het resultaat kunnen beïnvloeden. De leeftijd van de micro-organismen bijvoorbeeld beïnvloedt de bacteriële eiwitexpressie en derhalve de reproduceerbaarheid van de resultaten. Ten eerste kan groeiomstandigheden een probleem. Als voorbeeld, enterobacteriën, zoals Escherichia coli sneller groeien dan niet-fermenterende bacteriën (bijvoorbeeld Pseudomonas aeruginos a) en hebben bijgevolg eerder 17 worden geanalyseerd. Ten tweede, de matrix voor MALDI-TOF MS bestaat uit kleine organische zuur moleculen die een sterke laser optische absorptie voor de golflengte van de gebruikte laser hebben. Voorafgaand aan de analyse van de matrix wordt toegevoegd aan het monster en beide componenten ondergaan een crystallization werkwijze het vormen van een vaste oplossing.

Dit verklaart waarom veranderingen in de matrix de nauwkeurigheid van de identificatie van bacteriën 17 kunnen beïnvloeden. Daarom vers bereide matrix oplossingen, niet ouder dan 7 dagen, worden gebruikt. Ten derde, het medium waaruit bacteriën worden geplukt kan de identificatie beïnvloeden resulteert 17,68. Bijvoorbeeld kristalviolet, dat deel uitmaakt van MacConkey agar, verstoort massaspectra 17. Daarnaast zal er te veel bacteriën aangebracht op de stalen doel leiden tot lagere scores en dus van invloed op de identificatie nauwkeurigheid. Daarom is het raadzaam om duidelijke criteria hoe een analyse wordt uitgevoerd. Echter misleidende resultaten uitgevoerd door MALDI-TOF MS meestal veroorzaakt door onvoldoende referentiespectra in de database. (Momenteel is de database bevat> 6.000 inzendingen.) Dit is met name nog steeds het geval is voor de identificatie van anaërobe bacteriën 17. Echter, eenanvullende spectra kunnen worden toegevoegd door de gebruiker. MALDI-TOF MS bibliotheek bevat bijvoorbeeld 98 extra referentie-spectra van de isolaten die niet voldoende door de oorspronkelijke database worden aangepakt, zoals Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. En Chryseobacterium sp. Bijgevolg worden extra referentiespectra tot een hogere nauwkeurigheid identificatie 59,69. In nog andere gevallen de spectra van verschillende soorten zijn zeer vergelijkbaar. Dit kan leiden tot verkeerde identificatie in gevallen zoals de discriminatie van Escherichia coli en Shigella spp. of Streptococcus pneumoniae en Streptococcus mitis 17,51.

Sequentiebepaling van 16S rDNA en aanvullende genen zoals rpoB hebben de moleculaire identificatie van zeldzame of onbekende bacteriën vereenvoudigd. Deze genen komen vaak in de meeste bacteriën en hun individuele functieidentiek. Aangezien ze voldoende genetische variabiliteit van de resultaten te differentiatie op geslacht en soort niveau mogelijk produceren bezitten, kunnen worden gebruikt voor bacteriële identificatie 34. Volgens Stackebrandt en Göbel, homologieën <97% vertegenwoordigen verschillende soorten 61. Echter, homologieën> 97% niet noodzakelijk leiden tot een veilige soortidentificatie 34,47. Deze onzekerheden hebben verschillende redenen.

De kwaliteit van de gegevensbestanden die worden gebruikt om de homologie te berekenen soms twijfelachtig 34. In gevallen waar een hoge homologieën op het 16S rDNA niveau bestaan, kunnen onzekerheden leiden tot soortidentificatie. Een combinatie van verschillende genetische gebieden kunnen daarom leiden tot veiligere resultaten. Bovendien is er geen algemene richtlijnen voor de interpretatie van 16S rDNA sequencing data 22,34,61. Het verhogen van de betrouwbaarheid van de bestaande databases leidt tot een hogere accuracy voor bacteriële identificatie met behulp van deze moleculaire benadering 34. Wat de sequentiebepalingsreactie moeten we vermelden dat de nauwkeurigheid van de sequencing resultaten vooral afhankelijk van de kwaliteit van de onderliggende PCR. Aangezien de resultaten worden verkregen door ze te vergelijken met de openbare databases opgenomen vermeldingen, kwaliteit van ingetikte codes en het onderhoud van de gegevens van cruciaal belang.

In het algemeen, hoewel beide benaderingen MALDI-TOF MS en 16S rRNA gensequentie, hebben voordelen ze hebben ook tekortkomingen. De combinatie van beide werkwijzen, leidt echter tot een hoge nauwkeurigheid voor bacteriële identificatie. Bijvoorbeeld, in een eerdere studie konden aantonen dat MALDI-TOF MS kan onderscheiden Myroides odoratimimus en Myroides odoratus 56. In enkele gevallen is de MALDI score stelde onbetrouwbare identificatie van soorten, terwijl de resultaten verkregen door het 16S rDNA sequencing de soort kon bevestigenidentiteit. Massa spectrale vingerafdrukken van deze isolaten werden vervolgens gemaakt en geïntroduceerd in onze MALDI referentie spectra database. Toekomstig onderzoek gericht op andere zeldzame bacteriën kan de toepasbaarheid van de voorgestelde strategie aan te tonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

Infectie bacteriën identificatie 16S rRNA gen sequencing MALDI-TOF-MS zeldzame pathogenen vergelijking van de diagnostische methoden de microbiologie
Identificatie van bijzondere bacteriële pathogenen door 16S rRNA Gene Sequencing en MALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter