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Immunology and Infection

16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

특히 면역 환자에서 심각한 감염을 일으킬 것으로보고되고 있으므로, 충분히 설명 된 희귀 세균성 병원체가 있습니다. 대부분의 경우 보고서로 게시 대부분의 경우 단지 몇 데이터,에서, 감염원과 같은 병원균의 역할을 조사 할 수 있습니다. 따라서, 병원성 미생물의 특성을 명확하게하기 위해, 이들 박테리아의 다수를 포함 역학 조사를 수행 할 필요가있다. 균주의 확인은, 그들이 루틴 진단 (견고성) 취급하기 쉽고 경제적이어야 유효 명명법에 따른 정확성을 가지며, 이들은 비교 생성 할 : 이러한 감시 연구에서 사용되는 방법은 다음 조건을 만족해야 다른 실험실 중 결과. 일반적으로, 일상적인 환경에서 박테리아 균주를 식별하기위한 세 가지 전략이있다 같습니다 biochemica의 특성 1) 표현형 식별박테리아 L 및 대사 특성 2) 신규 프로테옴 기반 접근법으로서 16S rRNA 유전자 서열 3) 질량 스펙트럼 분자 기법. 질량 분석 및 분자 접근법 박테리아 종의 많은 종류를 식별하기위한 가장 유망한 도구이기 때문에, 이러한 두 가지 방법이 설명된다. 이러한 기술을 사용하여 진행 제한 및 잠재적 인 문제가 논의된다.

Introduction

일상적인 진단에 드문 병원체의 안전 확인은 고전 문화와 생화학 적 방법이 복잡하고 때로는 의심 있다는 사실에 의해 방해된다. 또한, 진단 미생물학 연구소는 자동화 된 시스템의 사용을 필요로 매일 수천에 수백에 이르는 병원균 다수, 처리한다. 높은 일일 처리량의 관리뿐만 아니라, 박테리아 종의 정확한 식별은 필요하다. 그들은 자신의 항균제 감수성 패턴에 차이가 있으므로 올바른 식별 적절한 항생제를 선택하는 중요한 정보 (예를 들어, 엔테로 종., 된 Acinetobacter 종.) 12,43와 임상의를 제공하기 때문에이 보증합니다.

자동 미생물 식별 시스템 (AMIS)는 박테리아 균주의 대사 특성을 특성화하기 위해 효소 반응의 표준 세트를 적용 예를 들어, 52이 연구에 사용 된 AMI의 GN 카드 (47) 만 세균 제한된 전략이 허가 보안 ID를 이용하더라도. 또한, 데이터베이스, 고급 전문가 시스템은 명확 의학적 중요성 13,15,16,36의 관련성 관련성 세균의 검출에 초점을 맞추고있다. 널리 실험실에서 사용되는 두 개의 추가 시스템은 또한 박테리아 식별이 생화학 적 방법을 적용 할 수 있습니다. 종 (35) 수준에서 3 차 AMI를 단지 82.4 %의 식별 정확도를 갖는다 최근의 연구는 본 연구에서 사용 된 AMI와 경쟁 온 (93.7 %는 각각 93.0 %) 사이의 비교 식별의 정확도를 증명한다. 이러한 불일치는 기본 식별 데이터 참조, 키트 및 소프트웨어, 메타 보의 차이 버전의 품질에 의해 설명 될 수있다lism 및 기술 인력 35, 36의 능력.

두 자동화 된 MALDI-TOF MS 시스템 (MALDI-TOF 미생물 식별 시스템, MMIS)이 주로 사용된다. 이 시스템은 단백질 지문 질량 스펙트럼에 기초한 박테리아 종의 다수의 검출을 허용한다. 예를 들어, 사용 된 MMIS의 데이터베이스는 6000 참조 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 질량 분석을 기반으로 식별 시스템은 희귀 병원균 11,48,51를 포함하는 미생물의 큰 다양성의 빠르고 안정적인 검출을 제공합니다. 지금까지 몇 직접적인 비교는 본 연구에서 사용 된 MMIS와 경쟁 19,33 사이에 사용할 수 있습니다. Daek 따르면 외. 두 시스템 식별 정확도 유사한 높은 속도를 제공하지만, 본 연구에 사용 된 MMIS 종 식별 19보다 안정적인 것으로 보인다.

마찬가지로, 분자 기술은 또한 잘 보존하지만 주소 지정 고유 한 유전자 ( rpoB)는 명확한 종 식별 3,22,61을 허용합니다. 이들 중에서, 16S rDNA의 때문에 모든 세균 (34)의 존재에 가장 널리 사용되는 하우스 키핑 유전자이다. 그 기능은 생물 정보학 14, 34에 적합 할만큼 충분히 긴 대략 1,500 염기쌍으로 변경하고 마지막 유지된다. 많은 연구자들은 박테리아 식별 (21)에 대해 "금 표준"등의 16S rRNA 유전자 분석을 간주한다. 이것은 몇몇 실험실 희귀하거나 새로운 박테리아 14, 34 식별하기위한 날짜 DNA-DNA 혼성화 기술을 사용한다는 사실에 기인한다. 또한, 더 많은 데이터베이스는 16S rRNA 유전자 분석 (50)에 이용 될 수 있습니다. 그러나, 16S rDNA의 기반 탐지 시스템은 표준 PCR 프로토콜에 비해 제한된 감도를 가지고 있음을 고려해야한다. 또한, 분자 접근 방식은 많은 시간이 소요, 정교하고 고도로 훈련 된 직원뿐만 아니라 필요전용 실험실 시설이며, 따라서 쉽게 일상적인 진단 (55)에 구현되지. 또한, 세균의 식별 중 적어도 두 가지 방법들의 조합이 고정밀 스트레인 식별에 이르게하는 것이 밝혀졌다. MALDI-TOF MS 및 16S rDNA 염기 서열의 결합은 높은 정밀도로 다른 세균 종의 다수의 식별을 허용한다. 최근 MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 분석의 조합은 역학적 질문 희귀 병원균 세균성 56 공부 식별을 위해 제시되었다.

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Protocol

세균 DNA의 추출 (1)

  1. PBS 용액의 조제
    1. 1.65 g을 플라스크에 2 HPO 4 × 2H 2 O, 0.22 g의의 NaH 2 PO 4 × 2H 2 O 및 8.80 g의 NaCl 나 무게 1,000 ML의 최종 볼륨에 증류수로 채운다. 7.4 pH를 조정합니다. 최종 사용하기 위해 박테리아 방지 (0.22 μm의) 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다.
  2. DNA의 추출 그람 음성균
    1. 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것.
    2. 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고 순도를 확인하고 문화 (49)에 그람 염색을 수행합니다.
    3. 단일 세균성 식민지를 선택하고 1 ml의 PBS 용액을 포함하는 멸균 2.0 ml의 반응 관에 1 μl의 단일 사용 접종 루프로 전송합니다.
    4. thermomix이 현탁액을 품어10 분 동안 95 ° C에서 어. 부화 후, 실온으로 냉각 세균 추출물 (용해 된 DNA를 포함)을하자 하나 더 사용 (그림 1a)에 대한 -20 ° C에서 증폭 또는 저장소에 대해 직접 사용합니다.
  3. 의 DNA 추출 그람 양성 박테리아
    1. 킬 적절한 배양 배지 (예를 들어, 컬럼비아 혈액 한천)에 환자 소재, 식별하고 잠재적 인 병원균을 격리 할 것. 문화의 morphotype을 확인하기 위해 그람 염색을 수행합니다.
    2. 순수 배양을 준비하고 순서 morphotype를 결정하고, 문화의 순도를 확인하기에 그람 염색을 수행합니다.
    3. 멸균 1 μL를 접종 루프를 단일 박테리아 콜로니를 선택하고, 2.0 ml의 반응 튜브 내의 500 ㎕의 PBS 용액을 중지.
    4. 500 ㎕의 유리 구슬을 추가하고 5 분 동안, 최대 주파수 및 진폭 (50 Hz에서)에서 작동 진동 균질에 튜브를 전송합니다. 1.0 mm 직경의 유리 구슬을 사용하여박테리아의 세포벽을 파괴한다.
    5. 95 ° C에서 10 분 동안이 튜브를 부화 상온이. 더 사용하기 위해 -20 ° C에서 PCR 반응 또는 저장소 추출물 직접 사용합니다.

2. 16S rDNA의 PCR

  1. 증폭 프라이머의 제조
    1. 프라이머의 TPU1를 사용하여 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) 역방향 프라이머로 정방향 프라이머 및 RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3')와 같은 25. , DNase의 및 RNAse가없는 물과 프라이머 원액을 준비 100 pmol의 / μL (100 μM)의 농도가 10 pmol의 / μL에서 작업 솔루션에 추가로 희석. -20 ° C에서 프라이머 재고 및 작업 용액을 저장하거나 직접 사용합니다.
  2. PCR 반응 믹스의 제조
    1. 피펫 1 ㎕의 각 프라이머, 1 μL의의 dNTP 믹스 (100 mM)을 상기 DNA 추출물 2.5 ㎕의 25 mM의 ㎎을 함유하는 5 μL 배 PCR 완충액 (멸균 200 ㎕의 반응 튜브에 CL 2)의 Taq 중합 효소 μL 0.25 (5 개 / μL) 및 39.25 μL DNAse-과의 RNAse 무료 PCR 물.
  3. PCR 프로토콜
    1. 다음과 같이 내장 된 PCR 프로그램을 시작 : 첫째, DNA 형성 촉매 - 중합 효소를 활성화 할 필요가 5 분 동안 95 ° C에서 초기 배양 단계. 둘째, 증폭 35 사이클, 1 분을 함유. 95 ° C, 1 분에서 변성 단계. 50 ℃에서의 프라이머 어닐링 단계, 그리고 72 ℃에서 1.5 분의 프라이머 연장 단계를 포함한다. 셋째, 72 ° C에서 10 분 동안 최종 연장. 마지막으로, PCR 반응은 4 ℃로 냉각시켰다.
      참고 : 황색 포도상 구균 및 H 2 O는 긍정적이고 부정적인 제어를 제공 (그림 1b).
    2. 열 순환기에서 PCR 반응 혼합물이 포함 된 튜브를 배치하고 프로그램을 시작한다.
  4. PCR 산물의 정제
    주 : PCR 생성물을 정제하기 위해, 몇몇 프로토콜에서 어느효소 기반 또는 실리카 흡착 매트릭스가 사용될 수있다. 여기에 사용되는 단일 단계 PCR 정리는 두 가수 분해 효소 반응을 이용합니다. 엑소 뉴 클레아 제 I (출 I)가 단일 가닥 DNA를 제거하는 동안, 새우 알칼리 포스 파타 아제 (SAP)는 비법의 dNTPs를 가수 분해. 세탁 - - 낮은 소금 용출 사이클 두 번째 절차는 높은 염이 빠른 바인딩 실리카 막 흡착 기술을 기반으로합니다.
    1. 25 ㎕의 PCR 생성물에 엑소 I 및 SAP 모두를 포함하는 효소 혼합물을 1.5 μL를 추가 철저히 혼합하고 80 ° C에서 15 분,이어서 37 ℃에서 처음 15 분의 간단한 프로토콜을 적용하는 열 순환기로 옮긴다. -20 ° C에서 정제 된 PCR 제품 중 하나를 저장하거나 PCR을 라벨에 대한 대상으로 직접 사용합니다.

3. DNA 아가 로스 젤 전기 영동

  1. 영동 완충액 (TBE 버퍼)의 제조
    1. (10 54.0 g (445 mM)을 TRIS베이스, 27.5 g (445 밀리미터) 붕산과 0.5 M EDTA의 20 ㎖를 적정mM)을 플라스크에 수산화 나트륨으로 pH 8.0 용액을 1000 ml의 총 부피를 증류수로 채운다. 그런 다음 전기 증류수 (0.5 배 TBE)이 5 배 버퍼 1:10 희석.
  2. 적하 버퍼의 준비
    1. 250 블루 mg을 브로 모 페놀 250 mg의 크실렌 cyanol의 FF와 플라스크에 polysucrose (재료 표)의 15g을 섞는다. 그런 다음 100 ㎖의 전체 부피의 0.5 배 TBE 완충액으로 채운다. 추가 사용에 대한 -20 ° C에서로드 1 ml의 부분에 염료 및 저장을 나누어지는.
  3. 아가로 오스 겔 캐스팅
    1. (w / v) 아가로 오스 겔을 2 %를 제조 아가 플라스크 내의을 300ml의 0.5X TBE 완충액 (3.1.1 절 참조)에 6g 표준 전기 계량. 이어서 아가 로스를 완전히 용해 될 때까지 가열하는 전자 레인지에 가까운 비등점 아가 혼합물을 넣고 용액을 명확 나타난다.
    2. 용융 아가로 오스를 충분히 냉각하자 1 %의 10 μl를 추가 에티 디움 브로마이드 스톡 SOLU (/ V w)기. 캐스트에 솔루션을 붓고 캐스트에서 (30 우물을 허용) 겔 빗 놓습니다. 겔이 완전히 응고 될 때 빗살을 제거하고 0.5 배의 TBE 버퍼를 포함하는 전기 영동 챔버로 겔을 넣어.
      참고 : 에티 디움 브로마이드는 독성 및 돌연변이입니다. 따라서이주의를 처리해야합니다. 니트릴 장갑을 사용하는 것이 좋습니다. 무독성 대안으로 사용할 수있는 다른 인터 핵산 얼룩이있다.
  4. PCR 산물의 아가로 스겔 전기 영동
    주 : PCR 증폭 산물의 정확한 크기를 확인하고, 정제 된 PCR 생성물을 아가 로스 겔에서 분리 된 DNA의 농도를 추정하기 위해.
    1. 피펫 2 PCR 반응 관 내로 로딩 완충액 μL 및 PCR 생성물 8 μL를 추가한다. 겔의 우물에이 혼합물을 피펫. PCR 산물의 크기를 추정하기 위해 별도의 웰의 분자량 크기 마커 (DNA 사다리) 8 μL를 추가한다.
    2. 대다일정 10 V / cm에서의 전압은 브로 모 페놀 블루 마커 약 ¾ 겔의 전체 길이에 도달하자마자 전기 영동을 멈춘다. 자외선 - transilluminator가 (파장 302 나노 미터)를 사용하여 분리 된 PCR 단편을 가시화하고, 겔 문서 시스템을 사용하여 기록. DNA의 사다리와 시각적 인 비교에 의해 DNA의 양을 추정한다. 라벨 PCR을위한 대상으로 약 10 NG를 사용합니다.

4. 생거 시퀀싱

  1. 사이클 시퀀싱 PCR
    참고 : 시판 키트 (재료 표)를 사용하여 10 ㎕의 반응에서 PCR 레이블링을 수행한다.
    1. 5 배 반응 mastermix의 2 μL의 DNA 준비의 2 μL, TPU1 또는 RTU4 작업 용액 (10 pmol의 / μL) 및 DNase의 4.5 μL 및 RNAse가없는 물 1.5 μl를 추가합니다.
    2. 열 순환기이 시퀀싱 반응 혼합물을 넣고 다른 PCR을 실행합니다. 총 공정은 25 사이클 (96 ° C 변성 단계 이루어지는10 초), 열처리 공정 (45-60 ° C, 5 초) 및 확장 단계 (60 ℃, 2 분). 마지막으로, 4 ° C에서 반응을 냉각.
  2. 시퀀싱 반응의 정화
    1. PCR 정화 (자료 표)에 대한 상업 스핀 열을 사용하여 라벨 반응 혼합물을 정제.
    2. 예비 수화 겔 - 여과 매트릭스 상 시퀀싱 반응을 10 μl의 하중을 3 분 동안 750 XG에서 원심 분리 공정을 수행한다.
      주 : 비 통합 염료 종결이 겔 매트릭스에 유지되는 절차의 사용에 의해.
    3. 그런 다음 진공 농축기에서 수성 용출액을 건조. 40 ° C에서 20 분 30 2,500 XG에 원심 분리기 건조를 완료합니다.
    4. 높은 탈 포름 아미드 10 ㎕를 다음 2 분 동안 90 ℃에서 변성과 얼음의 혼합물을 냉각 추가합니다. 피펫 96 웰 μl를 접시에 변성 샘플 10 μL. 분석이 경우 -20 ℃에서 건조 및 세정 PCR 생성물을 보관나중에 수행 될 수있다.
  3. 16S rRNA의 유전자 시퀀싱 및 DNA 서열 분석
    참고 : 자동 시퀀서 (자료 표)에 서열 분석을 수행합니다. 여기서 사용 된 시퀀서는 액상 중합체 (67) (도 1C)와 (50cm 4 모세관 배열)을 동시에 4 샘플을 분석하는 자동 형광 계 모세관 전기 영동 시스템이다.
    1. 시퀀서의 미세 적정 플레이트를 놓습니다. 2 배치로 샘플 시트 (판 레코드)를 작성, 저장 1에 주어진 단계에 따라 시퀀싱 실행 / 분석을 시작합니다.
      참고 : 시퀀스 실행의 지속 시간이 2 시간이고, 800에서 1,000 bp의 데이터를 제공한다.
    2. 시퀀싱 분석 소프트웨어 (자료 표)를 엽니 다. 시퀀스 데이터는 텍스트 파일 (.SEQ) 및 품질 값 (QV)를 포함하는 electropherogram을 포함하는 파일로 주어진다 (.ab1).
      참고 : 기본 통화는 당 자동적으로시퀀싱 분석 소프트웨어에 의해 형성된 하부 electropherogram 육안으로 판정한다 (예를 들어, 피크 높이, 피크 분리) 시퀀스 전에 추가 애플리케이션에 사용된다.
    3. NCBI의 노이즈 감소 데이터베이스 이용한 BLAST 알고리즘 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide)에 저장된 DNA 서열 파일을 비교한다.

5. MALDI-TOF MS

참고 : 질량 분석기는 337 nm의 N 2 레이저를 사용하고 특정 제어 소프트웨어 (자료 표)에 의해 운영되고 있습니다. 스펙트럼은 선형 모드와 2,000 만에 다가 덮여 사이의 질량 범위에 기록됩니다. 샘플에 대한 점수의 데이터 해석 및 할당 분석 소프트웨어 (재료 표) (도 1D)에 의해 실시간으로 수행된다.

  1. MALDI-TOF MS 분석을위한 박테리아의 준비
    1. 골에 (예를 들어, Myroides odoratimimus) 관심있는 박테리아를 성장세균 균주 (도 2a)에 따라 18 ~ 24 시간 동안 37 ℃에서 5 % 말 혈액을 함유 umbia 혈액 한천. 문화의 조사에서 유기체의 morphotype뿐만 아니라 순도를 확인하는 그람 염색을 수행합니다.
    2. 96 웰 스틸 타겟 잘 단일 박테리아 콜로니를 전송하는 나무 이쑤시개를 사용하여 (도 2b 및도 2c). 스팟 1 철강 대상에 공기 건조 유기체의 상단에 70 % 포름산 ㎕의 약 2 ~ 3 분 동안 건조 둡니다.
    3. 이어서, 유기 용매 (50 % 아세토 니트릴, 2.5 % 트리 플루오로 아세트산, 47.5 % H 2 O) 50 ㎎ / ㎖의 CHCA (α - 시아 노 -4- 히드 록 시신 남산)를 포함하는, 1 ㎕의 매트릭스 용액 스폿을 오버레이.
      주 : (플레이트 제조 방법)에 산 오버레이 방법은 질량 스펙트럼의 품질을 개선하는데 사용될 수있다. 그것은 그람 양성 세균에 대한 것을 밝혀졌다 이러한 "산 공격은"점수 버지니아 증가측정 된 스펙트럼 (45)의 역병.
      주 : 또는 자동화 된 샘플 준비 시스템 (재료 표)하는 제 1 건조 사이클 후 1 ㎕의 70 % 포름산 용액과의 접촉 프리 스폿, 1 ㎕의 매트릭스 용액을 박테리아 스미어에 적용 사용될 수있다. 샘플은 60 % 상대 습도에서 표준 조건하에 건조하고, 분석에 사용할 준비가되어있다.
    4. 매트릭스 스미어는 후드에서 약 5 분 동안 다시 자연 건조 겹쳐 보자. 적용 행렬이 세균 도말 이제 많은 시간 동안 안정하다.
      참고 : 매트릭스없이 세균성 얼룩 때문에 단백질 분해에 안정되지 않을 수 있습니다.
  2. MALDI-TOF MS 분석을 수행
    1. 샘플 소개
      1. 우리 MMIS (재료 표)의 제어 소프트웨어를 엽니 다.
      2. 악기의 IN / OUT 버튼을 눌러 질량 분광계의 샘플 로딩 포트 통기.
      3. 클릭 후로드 포트를 열고 건조 된 세균 도말 플러스 매트릭스와 MALDI-TOF MS의 목표 판을 삽입합니다.
      4. 포트를 닫고 다시 대피. 진공을 관찰하고 도달 할 때 4.5 × 10 -6 mbar에서 측정을 시작합니다.
    2. 샘플 분석
      1. 우리 MMIS (재료 표)의 분석 소프트웨어를 열고 '파일'메뉴를 클릭합니다. "새 분류"새 창 "MALDI의 biotyper 실시간으로 분류 마법사"를 선택 열립니다. 프로젝트 이름 "필드에, Myroides 측정 project_1"예를 들어, 프로젝트 이름을 입력합니다 "하고 버튼을 눌러"새 프로젝트 "라는 이름의 새 대화 상자에서."새 "를 체크 프로젝트 이름과 버튼을 눌러 계속 진행"OK "를.
      2. 은 "MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사"에서 열린 "분석 배치"창을 관찰합니다. 선택 대상 위치 (예를 들어, A1, A2, A3 ...), 마우스 오른쪽 CLICK 선택된 (파란색 사각형으로 표시) 위치는 "샘플을 추가"를 선택합니다. 샘플 이름, 샘플 ID 및 선택적 주석에서 자동으로 열립니다 테이블 뷰 유형에. 계속 버튼 "다음"을 클릭합니다.
      3. 은 "MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사"에서 열린 "선택 MALDI의 biotyper 방법"창을 관찰합니다. 에서 "브루 커 분류", "분류 나무에서 MSP가"를 선택하고 계속 "다음"을 클릭합니다.
      4. 은 "MALDI biotyper 실시간으로 분류 마법사"에서 열린 "프로젝트 요약"창을 관찰합니다. 실제 분류 프로젝트 위에서 주어진 삽입 된 항목을 확인합니다. 버튼 "마침"을 눌러 실행 분류를 시작합니다 (그림 2D를 - F). 적절한 진공에 도달하면 측정이 자동으로 시작됩니다.
      5. 측정이 성공적으로 완료 될 때까지 분류 실행하십시오. t에서 결과 테이블을보기그는 "MALDI Biotyper 실시간 분류 프로젝트 Myroides 측정 project_1"메뉴 "보기"를 열고 "결과"를 클릭합니다.
      6. 기본 웹 브라우저에서 HTML 파일로 "브루 커 달 토닉 MALDI Biotyper 분류 결과"를 볼 수 있습니다. 인쇄하고 결과를 저장합니다.
    3. 계측기 교정 및 장비 검증 주간 (악기 자체 테스트)를 수행하기 위해 분석을 샘플링 매일 전에 테스트 표준을 측정합니다.
      주 : MALDI-TOF 측정 스펙트럼 중은 분석 소프트웨어 (재료 표)에 의해 실시간으로 분석한다. 각각의 점수와 함께 10 종의 목록이 주어진다 및보고를위한 실험실 정보 시스템 (LIS)로 공급된다.
    4. 비판적으로 MALDI-TOF MS 결과 (대표 결과를 참조)는, 적절한 경우, 그러한에 필요한, ​​그람 염색 경우 biochemical- 및 항생제 감수성 프로필 또는 16S rRNA 유전자 염기 서열과 같은 다른 테스트를 포함 평가미생물 학적 보고서 박테리아 종을 지정.

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Representative Results

MALDI-TOF MS는 소설, 미생물 일상적인 진단을위한 신속하고 저렴한 방법입니다. MALDI-TOF MS에 의해 세균 종 식별이 주로 리보솜 단백질뿐만 아니라 다른 "환경 조건에 의해 최소한의 정도에 영향을 집 유지 기능을 가진 매우 보존 된 단백질"로 구성 스펙트럼을 생산하는이 MMIS의 17 국지적 인 데이터베이스는 기준 스펙트럼의 큰 집합을 포함 거의 임상 분리에서 찾을 수없는 경우에도 박테리아가 안전하게 7,56,57를 식별 할 수 있습니다. 스코어 값은 식별 된 종의 신뢰성을 나타낸다. 2.300 위의 점수는 가능성이 매우 높은 종 식별을 나타내고, 2.000과 2.300 사이의 점수가 보안 종 식별을 표시하는 가능성 종 식별을위한 1.700과 2.000 스탠드 사이의 점수와 1.700 이하의 점수가 아닌 신뢰할 수있다. 둘 이상의 종의 경우 2.000 추가 TES 상기 점수로 식별되고TS는 적용 할 수 있고이 점수가 아래이고 우리는 이러한 경우 등 그람 염색, 운동성 등의 세균 모르 폴리 및 / 또는 표현형를 해결하는 다른 예 16S rDNA의 염기 서열, API 등의 방법과 기술을 통합 한 이유입니다 1.700 전술 한 테스트는 신뢰성 종 식별을 달성하기 위해 사용될 수있다. MALDI-TOF MS 및 16S rDNA의 염기 서열의 조합은 56-58 최근 입증되었다. 16S rDNA 염기 서열 상 동성을 기반으로 종 결정을위한 명확한 가이드 라인이 여전히 22,61 부족한 것을 지적해야한다. Stackebrandt 및 GOBEL (61)에 의해 제안 된 실제 해석, ≥97 %의 상 동성을, 56을 사용한다. DNA 시퀀싱의 발전은 게놈 서열에 기초한 박테리아의 식별 원리에 따라서, 상대적으로 낮은 비용으로 차세대 기술에 의해 박테리아 게놈 전체의 결정을 허용. 이 기술은 이미 사용되고기반 발생 관리 또는 역학 9, 29에서 게놈. 그러나, 오늘날 강력한 제한은 최종 사용자 (65)의 소프트웨어 패키지를 사용하기 쉬운의 부족이다.

일상적인 진단시 환자 샘플에서 고립 된 두 MALDI-TOF MS와 16S rRNA 유전자 염기 서열 분석 드물게 발생하는 박테리아의 세븐 예, 표에 나열되어 있습니다 (1). # 6 변형 # 1의 MALDI-TOF 스펙트럼은 그림 3과 같이하고, 스트레인 # 7, 스핑 고박의 spiritivorum의 스펙트럼은도 1E에 도시된다. 모든 균주는 높은 MALDI-TOF MS 분석에서 점수가 99 ~ 100 % 16S rDNA 염기 서열 상 동성을 보여줍니다. 따라서, 두 가지 기술은 속종 식별을 확보하기 위해 리드. Myroides (SP)의 식별 방법을 비교하는 최근의 간행물에서 지적하지만,., MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자의 염기 서열의 조합은 더 신뢰성 R 주도esults 56. 이들 데이터는 단일 사용 방법은 항상 신뢰할 식별 결과를 달성하기에 충분하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. 두 개의 독립적 인 방법의 조합은 더 높은 정확도로 연결 사내 항목은 명백한 종 식별 56의 결과와 상용 MALDI-TOF MS의 데이터베이스를 확장한다.

스트레인 # 1 Chryseobacterium의 gleum로 확인되었다 (MALDI-TOF MS는 2.490, 서열 상 동성 99 % 점수). Chryseobacteria는 그람 음성, 비 발효 막대와 Myroides 종. Chryseobacterium 종 관련이 있습니다. 패혈증, 폐렴과 요로 감염과 관련된 새로운 병원체로 간주된다. 속 Chryseobacterium 종의 다수를 포함하고, 가장 연구 종 Chryseobacterium의 indologenes이다. Myroides 특검팀에 의한 감염 유사합니다. 대부분 면역 환자는 영향을받는6,10,60. 스트레인 # 2 Myroides의 odoratimimus으로 확인하고 Myroides의 odoratus로 변형 # 3 (MALDI-TOF MS가 2.436, 서열 상 동성 99 % 점수) Myroides SP는 (MALDI-TOF MS는 2.237, 서열 상 동성 99 % 점수). 이러한 패혈증, 봉와직염이나 폐렴 등의 중증 질환과 관련된 그람 음성, nonfermenting 봉이다. 대부분 기본 혈액 또는 종양 학적 질환 면역 저하 환자는 8,18,42을 영향을받습니다. (2.092, 서열 상 동성 99 % 점수 MALDI-TOF MS) 스트레인 # 4 스핑 고박 테 multivorum 32,71로 확인되었다.

박테리아는 면역 환자 5,24,44,53에서 패혈증을 일으킬 수 그람 음성 비 발효 봉이다. 또한 치명적인 수막뇌염의 케이스 (70)에보고되었다. 얼룩은 # 5 (MALDI-TOF는 MS 2.282 점수, 서열 상 동성 100 %) 및 ​​# 6 (MALDI-TOF는 MS 2.289, 시퀀스 상 동체 점수y를 100 %) Wohlfahrtiimonas의 chitiniclastica로 확인되었다.이 박테리아가 처음으로 2008 년에 기생 파리 Wohlfahrtia의 그니의 유충으로부터 격리되고 설명 된 그람 음성 막대, 비 운동성, 짧은 (66). 이러한 인수 공통 박테리아가 새로운 병원균으로 간주되고, 균혈증, 패혈증 또는 연조직 감염 4,40,64에 대한 원인 에이전트. 흥미롭게도,보고 된 대부분의 환자는 노숙자 및 / 또는 알코올 중독으로 고통, 따라서, 이러한 희귀 병원균의 발생 노숙자 인구 4,54에서 체외 기생충의 높은 비율에 의해 설명 될 수 있습니다 중 하나였다. 스트레인 # 7, 스핑 고박 테의 spiritivorum (MALDI-TOF MS가 2.269 점을, 서열 상 동성 100 %), 희귀 병원균이다. 그것은 면역 환자와 첫 인간 균주에 감염 1982 31,71에 설명 된 원인이 될 수 있습니다. 최근의 보고서는 혈중 알코올 농도의 치명적인 사건에 대한 스핑 고박 테 spiritivorum 등의 원인이되는 에이전트를 식별급성 골수성 백혈병 (38)와 환자의 teremia 패혈증.

그림 1
그림 1. 핵산 및 / 또는 의학적 미생물학 연구소에서 임상 적으로 관련된 박테리아의 질량 분석 기반 검출을위한 흐름 (a) DNA를 대상으로 순수 배양부터 출발은 열 순환기에서 증폭된다 (b). PCR의 증폭은 생거 기술 (c)을 사용하여 네 개의 모세관 시퀀서 서열화된다. 시퀀싱 결과는 컴퓨터를 이용한 비교하여 데이터베이스 항목에 대한 질의 시퀀스 %의 상 동성으로 결정된다. 두번째, 프로테오믹스 기반의 방법은, 그 MALDI-TOF MS 점수 포함 스핑 고박의 spiritivorum가 주어진다 질량 분석 (d) 및 표 1의 변형 # 1 중앙 질량 분광 결과 (예를 들어 <사용/ STRONG>). 질량 분석 및 16S rRNA 유전자 염기 서열의 조합은 믿을 수 있고 정확한 종 식별을 달성하기 위해 필요할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 :. 임상 적으로 세균의 식별 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석 절차 운영자가 전체 세포 박테리아 물질 소요 (a)는 순수 배양에서 이쑤시개와 (b) 및 스틸 대상 (C)에 세균성 얼룩을 배치합니다. 스틸 타겟은 질량 분석 장치의로드 포트에 삽입된다. 5 × 10-6 밀리바의 적절한 진공에 도달하면, 목표는 이온화 챔버로 이동한다. 는 N 2 -lase 사용R, 이온은 다음 정전기 장 (d)에 가속 비행 튜브 (e)에 분리되어 부드러운 탈착에 의해 만들어집니다. 이온 필요한 항공권 (TOF)의 시간 직접 질량 관련된 비행 튜브 (F)의 검출기 도달 질량 피크의 후속 계산의 기초를 형성한다. 특정 식별 소프트웨어 (자료 표)을 이온화 된 세균 단백질의 질량 스펙트럼 지문에 점수 값을 할당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 희귀 병원균의 MALDI-TOF 스펙트럼과 할당 된 점수이 그림에서, 처음 여섯 드문 병원체의 문양의 대표 MALDI-TOF 스펙트럼.표 1의 테드가 표시됩니다. 종 (種)의 이름과 해당 MALDI-TOF MS 점수는 각 스펙트럼에 설명되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

#삼
변형 MALDI 식별 MALDI 점수 16S rDNA의 결과 BLAST 상 동성
#1 Chryseobacterium의 gleum 2.211 Chryseobacterium의 gleum 99 % 동일성
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99 % 동일성
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99 % 동일성
# 4 스핑 고박 테 multivorum 2.093 스핑 고박 테 multivorum 99 % 동일성
# 5 Wohlfahrtiimonas의 chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas의 chitiniclastica 100 % 동일성
# 6 Wohlfahrtiimonas의 chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas의 chitiniclastica 100 % 동일성
# 7 스핑 고박 테 spiritivorum 2.269 스핑 고박 테 spiritivorum

표 1 : 16S rRNA 유전자 서열 비교 드물게 발생하는 박테리아의 대표 MALDI-TOFs 결과.

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Discussion

MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 서열은 모두 다른 박테리아의 다수를 식별 할 수있는 가능성을 제공한다. MALDI-TOF MS는 처리하고 세균 질량 스펙트럼의 대형 데이터베이스를 사용할 수있는 용이 한 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 이유로, MALDI-TOF MS 희귀 세균성 병원균 17,20,39,51 집중 스크리닝 연구를 수행하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 방법이다. 다른 표현형 식별 방법, 셍 등. 입증 비용 효율성 및 MALDI-TOF MS 59 탄의 속도로 MALDI-TOF MS를 비교하는 전향 적 연구에서 등. 자신의 실험실 환경에서 박테리아 식별을위한 시약과 노동 비용의 감소를보고 매년 62 56.9 %로. 이러한 비용 절감은 Gaillot 등의 등의 메모에 의해 지원된다. (28)

한편, 16S rDNA의 염기 서열은 더 많은 시간을 소비하고 수고이다 영장 P 전문분석 (34)을 수행 할 수 ersonnel. 그럼에도 불구하고, 두 방법은 일상적인 진단에 적합하며 이들 두 방법의 조합이 의심스러운 결과 (56)의 경우에 특히 유용 높은 신뢰도와보다 안전한 식별 정확도에 이르게하는 것이 입증 될 수있다. 따라서 일상적인 진단 드물게 발생하는 세균의 식별을 확인하는 최선의 방법과 같은 두 가지 방법의 조합을 제안 하였다. 신뢰성 종 식별 들어, 혼합 배양 종 결정을 방지하기 때문에 순수한 박테리아 배양 물을 사용하는 것이 절대적으로 필수적이다. 타당성 검사로서, 종 식별 MALDI TOF MS 또는 16S rDNA의 염기 서열 중 하나를 얻을는 그람 염색, 생화학 적 특성 및 임상 프레 젠 테이션 (49)의 결과에 따라야한다.

박테리아 식별을위한 분석 도구로 질량 분석은 먼저 1975 년에 제안되었다(51). 그러나, 단백질 분석을위한 실용적인 방법을 확립하기 위해 1980 년대 말까지했다. 은 "부드러운 탈착 이온화"기술은 그대로 단백질의 분석을 허용, 2002 년 노벨 화학상을받은 1985 (63)에 코이치 다나카에 의해 소개되었다. 동시에 그들 생체 분자 (37)를 분석하기 위해, 유기산을 사용하는 제 보유하면서 비행 질량 분석의 매트릭스 지원 이온화 시간 힐렌 캠프 및 카라스 도입하고, 이는 오늘날 사용되는 방법이다. MALDI 기술이 산발적으로 23,30,41를 사용되었지만, 그것은 브루 커 달 토닉은 MALDI-TOF MS 기반 미생물 식별이 일상이되었다 그 microflex MALDI Biotyper 시스템 (PITTCON 컨퍼런스 & 엑스포 2004, 보도 자료)를 도입 2004까지했다 진단 기술 (46). MALDI-TOF MS 기술 최근 접근법 multiresistant 박테리아 검출 효모를 식별 할 수있는 기회를 준및 항균제 감수성 시험 17,51을 수행합니다. 또한, 특정 절차를 직접 소변 또는 혈액 배양 17,51 1 차 샘플에서 세균을 분석 할 수있는 가능성을 제공한다.

본 시스템의 사용은 주로 쉽지만 결과에 영향을 미칠 수있는 일부 함정있다. 예를 들면, 미생물의 나이는 박테리아 단백질 발현 따라서 결과의 재현성에 영향을 미친다. 우선, 성장 조건은 문제가 될 수있다. 예로서, 대장균 등의 장내 세균 비 발효 세균보다 빠르게 성장 (예를 들면, 슈도모나스 aeruginos a)와 이에 앞서 17 분석되어야한다. 둘째, MALDI-TOF MS에 사용되는 행렬은 사용되는 레이저의 파장에 대한 강한 레이저 광 흡수가 작은 유기산 분자로 구성된다. 분석 전에 매트릭스 샘플에 첨가하고, 두 성분은 crystallizatio를 받아야고용체를 형성하는 N 개의 방법.

행렬에서의 변화는 박테리아의 식별 (17)의 정밀도에 영향을 미칠 수있는 이유를 설명한다. 따라서, 갓 칠일보다 오래되지 매트릭스 솔루션을 제조, 사용되어야한다. 셋째, 박테리아 식별에 영향을 줄 수 촬상하는 매체는 17,68을 초래한다. 예를 들면, 맥 콘키 배지의 구성 요소 인 크리스탈 바이올렛, 질량 스펙트럼 (17)을 방해. 또한, 강판에 도포 대상 너무 많은 박테리아가 낮은 점수 초래할 것이며, 따라서 상기 식별의 정확도에 영향을 미친다. 따라서 분석을 행하는 방법에 대한 명확한 기준을 정의하는 것이 바람직하다. 그러나, MALDI-TOF MS에 의해 수행되는 잘못된 결과는 대부분 데이터베이스에 포함 불충분 기준 스펙트럼에 의해 야기된다. (현재 데이터베이스> 6,000 항목이 포함되어 있습니다.) 이것은 특히 여전히 혐기성 세균 (17)의 식별을위한 경우이다. 그러나,뉴 부가 스펙트럼은 사용자가 추가 할 수 있습니다. 예를 들어 MALDI-TOF MS 라이브러리는 마이코 플라즈마 특검팀로 적절 원본 데이터베이스에 의해 해결되지 않은 분리, 98 추가 참조 스펙트럼을 포함하고 있습니다., Myroides SP., 레지오넬라 SP., Roseomonas SP., Comamonas 특검팀. 그리고 Chryseobacterium 특검팀. 따라서, 추가 참조 스펙트럼은 더 높은 식별의 정확성 59,69으로 이어질 것입니다. 마지막으로, 일부 경우에 다른 종의 스펙트럼과 매우 유사하다. 여기에는 대장균과 이질균 종의 차별로 경우에 오인을 초래할 수 있습니다. 또는 폐렴 구균과 연쇄상 구균은 17,51을 mitis가 각각 1 주 씩으로.

16S rDNA의 및 rpoB 같은 추가 유전자 시퀀싱 드문 또는 알 수없는 세균의 분자 식별을 단순화했다. 이 유전자는 대부분의 박테리아에 공통 및 개별 기능입니다같은. 그들이 속과 종 레벨에서 분화를 허용하는 결과를 생성하는 데 충분한 유전 적 다양성을 갖고 있기 때문에, 이들은 박테리아 식별 (34)에 사용될 수있다. Stackebrandt 및 GOBEL에 따르면, 상 동성이 <97 %는 다른 종 (61)을 나타낸다. 그러나,> 97 % 상 동성이 반드시 보안 종 식별 34,47으로 이어질하지 않습니다. 이러한 불확실성은 몇 가지 이유가 있습니다.

동성을 계산하는 데 사용되는 데이터베이스의 품질은 때때로 34 의문이다. 16S rDNA의 수준 높은 상 동성이 존재하는 경우, 불확실성은 종 식별 될 수 있습니다. 다른 유전 지역의 조합은 따라서보다 안전한 결과가 발생할 수 있습니다. 또한, 16S rDNA의 염기 서열 데이터 22,34,61의 해석에 대한 일반적인 지침은 없다. 그러나, 기존의 데이터베이스의 신뢰성을 증가시키는 것은 더 이어질 것이다 ACCU이 분자 방법 (34)을 사용하여 박테리아 식별 정확성. 우리 시퀀싱 결과의 정확도가 주로 하부 PCR의 품질에 의존하는 것을 언급 할 필요가 시퀀싱 반응에. 그 결과는 공개 데이터베이스에 나열된 항목에 비교하여 얻게되는 때문에, 시퀀스 엔트리 데이터의 유지 품질이 매우 중요하다.

두 가지 접근 방식, MALDI-TOF MS와 16S rRNA 유전자 염기 서열이 장점을 가지고 있지만, 일반적으로, 그들은 또한 약점을 가지고 있습니다. 두 방법의 조합은, 그러나, 박테리아 식별 고정밀 리드. 예를 들어, 이전의 연구에서 우리는 MALDI-TOF MS는 Myroides의 odoratimimus 및 Myroides odoratus (56)를 구별 할 수 있음을 입증 할 수있다. 결과 종을 확인할 수 16S rDNA 염기 서열 분석에 의해 얻어진 동안 몇 가지 경우에서, MALDI 점수 신뢰할 종 식별 제안정체. 이러한 분리의 질량 스펙트럼 지문는 만들어 우리의 MALDI 참조 스펙트럼 데이터베이스에 소개되었다. 희귀 세균에 초점 향후 연구 제안 전략의 적용 성을 입증 할 수있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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