Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Есть целый ряд редких и, следовательно, недостаточно описаны бактериальных патогенов, которые, как сообщается, вызывают тяжелые инфекции, особенно у пациентов с иммунодефицитом. В большинстве случаев лишь немногие данные, в основном опубликованы в виде сообщений о случаях, доступны, которые исследовать роль таких патогенов, как инфекционного агента. Поэтому для того, чтобы прояснить патогенный характер таких микроорганизмов, необходимо проводить эпидемиологические исследования, которые включают в себя большое количество этих бактерий. Методы, используемые в таком исследовании наблюдения должны соответствовать следующим критериям: идентификация штаммов должно быть точным в соответствии с действующей номенклатуре, они должны быть просты в обращении (надежность), экономичны в рутинной диагностике, и они должны генерировать сопоставимы результаты среди разных лабораторий. Как правило, существует три стратегии для идентификации бактериальных штаммов, в обычной обстановке: 1) идентификация фенотипический характеризующий Biochemicaл и метаболические свойства бактерий, 2) молекулярные методы, такие как 16S рРНК секвенирование гена и 3) масс-спектрометрии в качестве подхода, основанного на романе протеома. Поскольку масс-спектрометрии и молекулярные подходы являются наиболее перспективными инструментами для выявления большое разнообразие видов бактерий, эти два метода описаны. Авансы, ограничения и потенциальные проблемы при использовании этих методов обсуждаются.

Introduction

Безопасная идентификация редких патогенов в рутинной диагностике мешает тот факт, что классические культурные и биохимические методы являются громоздкими и иногда сомнительна. Кроме того, диагностическая лаборатория микробиологии должен обрабатывать большое количество патогенных микроорганизмов, в пределах от нескольких сотен до нескольких тысяч, ежедневно, что требует использования автоматизированных систем. В дополнение к управлению большой суточной пропускной способности, точная идентификация видов бактерий необходим. Это оправдано , так как они отличаются по своей противомикробной шаблон восприимчивости и , следовательно , правильная идентификация обеспечивает клинициста с необходимой информацией , чтобы выбрать соответствующие антибиотики (например, Enterococcus SPP., Acinetobacter SPP.) 12,43.

Автоматизированные микробные системы идентификации (МАСС) применяются стандартные наборы ферментативных реакций охарактеризовать метаболические свойства бактериальных изолятов например, 47 в GN карты МАСС , используемой в данном исследовании 52, это позволяет стратегии безопасной идентификации только для ограниченного набора бактерий. Кроме того, база данных, передовая экспертная система, четко сосредоточена на выявлении соответствующих и высоко соответствующих бактерий медицинского значения 13,15,16,36. Две другие системы, широко используемые в лабораториях, а также применять этот биохимический подход для идентификации бактерий. Недавние исследования демонстрируют сопоставимую точность идентификации между МАСС , используемых в данном исследовании , и один из конкурентов (93,7% и 93,0% соответственно), в то время как 3 - й МАСС имеет точность определения только 82,4% на уровне видов 35. Такие расхождения можно объяснить качеством основных ссылок идентификации данных, варианты комплектов и программного обеспечения, различия в MetaboЛМЗС и квалификация технического персонала 35,36.

в основном используются две автоматизированные системы MALDI-TOF MS (MALDI-TOF микробной системы идентификации, mMIS). Эти системы позволяют для обнаружения большого количества видов бактерий на основе их спектров отпечатку пальца белковой массы. Например, база данных содержит mMIS используемых 6000 эталонных спектров. Системы идентификации , основанные на масс - спектрометрии обеспечивают быстрое и надежное обнаружение самых разнообразных микроорганизмов , в том числе редких возбудителей 11,48,51. На сегодняшний день лишь несколько прямых сравнений доступны между mMIS , используемых в данном исследовании , и его конкурент 19,33. Согласно Dæk и др. Обе системы обеспечивают подобный высокий уровень точности идентификации, но mMIS , используемые в данном исследовании , представляется более надежным в идентификации видов 19.

Кроме того, молекулярные методы адресации хорошо законсервированные, но и отдельные гены ( гроВ) позволяют четко идентифицировать видовой 3,22,61. Среди них 16S рДНК является наиболее широко используется ген домашнего хозяйства из - за его присутствия во всех бактерий 34. Его функция остается неизменной и , наконец, с примерно 1500 пар оснований , достаточно долго , чтобы быть пригодным для биоинформатики 14,34. Многие исследователи считают анализ гена 16S рРНК в качестве "золотого стандарта" для идентификации бактерий 21. Это связано с тем , что немногие лаборатории используют методы ДНК-ДНК гибридизации на сегодняшний день для выявления редких или новых бактерий 14,34. Кроме того, все больше и больше баз данных, доступных , которые могут быть использованы для анализа 50 гена 16S рРНК. Тем не менее, следует принимать во внимание, что системы обнаружения, основанные 16S рРНК имеют ограниченную чувствительность по сравнению со стандартными протоколами ПЦР. Кроме того, молекулярный подход сложный, отнимает много времени и требует высококвалифицированного персонала, а такжеспециализированные лабораторные помещения и, следовательно, не легко реализуется в рутинной диагностике 55. Кроме того, было показано, что комбинация по крайней мере, двух различных методов идентификации бактерий приводит к высоко точной идентификации штамма. Сочетание MALDI-TOF MS и 16S-рДНК секвенирования позволяет идентифицировать большое число различных видов бактерий с высокой точностью. Недавно было представлено сочетание анализа генов MALDI-TOF MS и 16S рРНК для идентификации бактерий изучения эпидемиологических вопросов и редких патогенных микроорганизмов 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Выделение ДНК микобактерий

  1. Приготовление раствора PBS
    1. Взвешивают 1,65 г Na 2 HPO 4 х 2H 2 O, 0,22 г NaH 2 PO 4 × 2H 2 O и 8,80 г NaCl в колбу и заполнить дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. Доводят рН до 7,4. Для конечного использования фильтрации раствора через бактерии-доказательства (0,22 мкм) фильтра.
  2. ДНК Выделение грамотрицательных бактерий
    1. Streak больной материал по соответствующей культуральной среде (например, Колумбийский кровяной агар), идентифицировать и изолировать потенциальных патогенов.
    2. Приготовьте чистую культуру и выполнять окрашивали по Граму, чтобы определить морфотип и подтвердить чистоту и культуры 49.
    3. Выбор одного бактериальной колонии и передать его с 1 мкл одиночного контура с посевом в стерильном 2,0 мл реакционную пробирку, которая содержит 1 мл раствора PBS.
    4. Выдержите эту суспензию в THERMOMIXэр при 95 ° С в течение 10 мин. После инкубации, пусть бактериальный экстракт (содержащий растворенный ДНК) , охлаждают до комнатной температуры и либо использовать его непосредственно для усиления или хранить при -20 ° C для дальнейшего использования (рисунок 1а).
  3. ДНК Выделение грамположительных бактерий
    1. Streak больной материал по соответствующей культуральной среде (например, Колумбийский кровяной агар), идентифицировать и изолировать потенциальных патогенов. Выполните окрашивали по Граму, чтобы подтвердить морфотип культуры.
    2. Приготовьте чистую культуру и выполнять окрашивали по Граму, чтобы определить морфотип и подтвердить чистоту культуры.
    3. Выберите одну колонию бактерий с помощью стерильного 1 мкл петли для инокуляции и приостановить его в 500 мкл раствора PBS в 2,0 мл реакционной трубки.
    4. Добавить 500 мкл стеклянные бусы и передать трубку в колебательный гомогенизатор, работающий при максимальной частоте и амплитуде (50 Гц), в течение 5 мин. Используйте стеклянные бусы диаметром 1,0 ммчтобы разрушить бактериальные клеточные стенки.
    5. Выдержите эту трубку в течение 10 мин при 95 ° С и охлаждают до комнатной температуры. Использование экстракта либо непосредственно для ПЦР-реакции или хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.

2. 16S рДНК ПЦР

  1. Получение праймеров для амплификации
    1. С помощью праймеров TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) в качестве прямого праймера и RTU4 (5'-TAC CAG ГГТ ATC ТАА ТСС TGT T-3') в качестве обратного праймера 25. Готовят грунтовку маточного раствора ДНКазой и РНКазы свободной воды, имеющий концентрацию 100 пмоль / мкл (100 мкМ) и разбавить его дальше к рабочему раствору при 10 пмоль / мкл. Хранить грунтовки запас и рабочего раствора при температуре -20 ° C или использовать непосредственно.
  2. Приготовление реакционной смеси для ПЦР
    1. Пипетка по 1 мкл каждого праймера, 1 мкл дНТФ-смеси (100 мМ), 2,5 мкл экстракта ДНК, 5 мкл 10х ПЦР-буфера (содержащего 25 мМ MgCl 2), 0,25 мкл Taq-полимеразы (5 единиц / мкл) и 39,25 мкл DNAse- и РНКазы ПЦР воды в стерильную 200 мкл реакционной трубки.
  3. ПЦР-протокол
    1. Запуск программы PCR построен следующим образом: Во-первых, начальный этап инкубации при 95 ° С в течение 5 мин, который необходим для активации Taq-полимеразы. Во-вторых, 35 циклов амплификации, содержащий 1 мин. денатурация при 95 ° С, 1 мин. Грунтовка стадию отжига при 50 ° С и 1,5 мин праймера стадия удлинения при 72 ° C. В-третьих, окончательное удлинение в течение 10 мин при 72 ° С. И, наконец, ПЦР-реакции охлаждают до 4 & deg; С.
      Примечание: золотистый стафилококк и H 2 O служат в качестве положительного и отрицательного контроля (рис 1b).
    2. Поместите пробирку, содержащую реакционную смесь ПЦР в амплификатор и запустить программу.
  4. После очистки продукта ПЦР
    Примечание: Для очистки ПЦР-продукта, несколько протоколов либоможет быть использован фермент на основе или с адсорбционной матрицы оксида кремния. Одностадийной ПЦР очистки, используемый здесь используются два гидролитических ферментативных реакций. В то время как экзонуклеаза I (Exo I) удаляет одноцепочечной ДНК, креветки щелочной фосфатазы (SAP) гидролизует некорпоративные дНТФ. Вторая процедура основана на кремнезем мембранной методом адсорбции с высокой солью быстро связывания - мыть - низким содержанием соли элюирование цикла.
    1. Добавить 1,5 мкл ферментной смеси, содержащей как Exo I и SAP в 25 мкл ПЦР-продукта, тщательно перемешать и передать в амплификаторе применения простого протокола первые 15 мин при 37 ° С, а затем 15 мин при 80 ° C. Хранить очищенный продукт ПЦР либо при -20 ° С или использовать его непосредственно в качестве мишени для маркировки ПЦР.

3. ДНК Электрофорез в агарозном геле

  1. Подготовка буфера (электрофорез КЭ-буфер)
    1. Титрование 54,0 г (445 мМ) Трис-основание, 27,5 г (445 мМ) борной кислоты и 20 мл 0,5 М ЭДТА (10мМ) раствор при рН 8,0 с помощью NaOH в колбу и заполнить его дистиллированной водой до общего объема 1000 мл. Затем разбавляют этот 5х буфер 1:10 дистиллированной водой (0.5x КЭ) для электрофореза.
  2. Подготовка буфера для загрузки
    1. Смешайте 250 мг бромфеноловый синий, 250 мг ксилолцианола FF и 15 г polysucrose (Материалы таблицы) в колбу. Затем залейте его 0.5x TBE буфере до общего объема 100 мл. Алиготе красителем до 1 мл порции и хранят при -20 ° C для дальнейшего использования.
  3. Литье изделий из агарозного геля
    1. Взвесить 6 г стандартного электрофореза в агарозном до 300 мл 0.5x TBE буфере (смотри раздел 3.1.1), в колбе, чтобы подготовить 2% (вес / объем) агарозном геле. Затем поместите агарозном смесь в микроволновой печи, нагреть его точку кипения почти до агарозном полностью не растворится и раствор становится ясно.
    2. Пусть расплавленный агарозы достаточно остыть и добавить 10 мкл 1% (вес / объем) этидий бромида акций Солуции. Налейте раствор в гипсе и поместите гель гребень (с учетом 30 скважин) в гипсе. Удалите гребенку, когда гель полностью затвердевший и поместить гель в электрофорез камеру, содержащую 0.5x TBE буфер.
      Примечание: этидий бромид является токсичным и мутагенными свойствами. Поэтому с ним следует обращаться с осторожностью. Целесообразно использовать нитриловые перчатки. Существуют альтернативные пятна интеркалирующий нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в качестве нетоксичного альтернативы.
  4. Электрофорез в агарозном геле продуктов ПЦР
    Примечание: Для проверки правильного размера ампликонов ПЦР и для оценки концентрации ДНК очищенный продукт ПЦР разделяют в агарозном геле.
    1. Пипетка 2 мкл загрузочного буфера в реакционную пробирку для ПЦР и добавить 8 мкл ПЦР-продукта. Пипетировать эту смесь в лунки геля. Добавить 8 мкл размера маркера молекулярной массы (ДНК трап) в отдельной скважине, чтобы оценить размер ПЦР-продукта.
    2. Подать заявлениепостоянное напряжение при 10 В / см и остановить электрофорез, как только бромфеноловый синий маркер достиг около ¾ от общей длины геля. Визуализируйте разделенных фрагментов ПЦР с использованием УФ-просвечивания (длина волны 302 нм) и документировать их с помощью системы гель-документации. Оценить количество ДНК путем визуального сравнения с лестницы ДНК. Используйте приблизительно 10 нг в качестве мишени для маркировки ПЦР.

4. Sanger секвенирования

  1. Цикл Секвенирование ПЦР
    Примечание: Выполнить маркировку ПЦР в 10 мкл реакционной смеси с использованием коммерческого набора (Материалы таблицу).
    1. Добавляют 2 мкл 5х реакционного Mastermix 2 мкл препарата ДНК, 1,5 мкл рабочего раствора TPU1 или RTU4 (10 пмоль / мкл) и 4,5 мкл ДНКазы и РНКазы свободной воды.
    2. Поместите эту секвенирования реакционной смеси в амплификатор и запустить другой ПЦР. В общей сложности, процесс 25 циклов, состоящих из стадии денатурации (96 ° С,10 сек), стадии отжига (45-60 ° С, 5 секунд) и стадию удлинения (60 ° С, 2 мин). И, наконец, охлаждают реакционную смесь до 4 ° С.
  2. Очистка Секвенирование реакции
    1. Очищают реакционной смеси маркировки с использованием коммерческих колонок отжима для очистки ПЦР (Материалы таблицу).
    2. Нагрузка 10 мкл реакции секвенирования на предварительно гидратированного матрицы для гель-фильтрации и выполнить стадии центрифугирования при 750 х г в течение 3 мин.
      Примечание: При использовании этой процедуры неинкорпорированные краситель терминаторы удерживаются в гелевой матрице.
    3. Затем высушите водный элюат в вакуумном концентраторе. Центрифуга при 2500 х г в течение 20 мин до 30 при 40 ° С до полной сухости.
    4. Добавьте 10 мкл деионизованной сильно формамида затем денатурация при 90 ° С в течение 2 мин и смесь охлаждают на льду. Пипетка 10 мкл денатурированного образцов на 96-луночный мкл пластины. Хранить высушенный и очищенный продукт ПЦР при -20 & deg; С, если анализкоторые будут проводиться в более позднее время.
  3. 16S рРНК секвенирование гена и анализ последовательности ДНК
    Примечание: Выполнить анализ последовательности на автоматическом секвенсор (Материалы таблицы). Секвенсор используется здесь представляет собой автоматизированную флуоресценция на основе системы капиллярного электрофореза , который анализирует 4 образца одновременно (50 см 4-капиллярный массив) с помощью жидкого полимера , 67 (рис 1в).
    1. Поместите планшет в секвенсор. Написать образец листа (пластины записи) , как это изложено в пункте 2, сохранить его и запустить секвенирования выполнения / анализ , следуя шагам , приведенным в 1.
      Примечание: Продолжительность прогона последовательности составляет 2 ч и обеспечивает данные от 800 до 1000 пар оснований.
    2. Откройте программное обеспечение для анализа последовательности (Материалы таблицу). Данные последовательности приведены в виде текстового файла (.seq) и файл, содержащий electropherogram в том числе значений качества (QV) (.ab1).
      Примечание: База вызова автоматически наформируется с помощью программного обеспечения для анализа последовательности и лежащая в основе electropherogram проверяется визуально (например, высота пика, пик разделения) до последовательности используется для дальнейшего применения.
    3. Сравните сохраненный файл последовательности ДНК в базе данных с использованием NCBI алгоритма BLAST Н.Р. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF МС

Примечание: Масс - спектрометр использует N 2 лазер 337 нм и управляется при помощи специального программного обеспечения управления (материалы таблицы). Спектры записываются в линейном режиме и массовом диапазоне от 2000 до 20000 Да покрыта. Интерпретация данных и распределение баллов по образцам осуществляется в режиме реального времени с помощью программного обеспечения для анализа (таблица материалов) (рис 1d).

  1. Приготовление бактерий для MALDI-TOF MS Analysis
    1. Вырастить бактерии , представляющие интерес (например, Myroides odoratimimus) на Columbia кровяной агар , содержащий 5% лошадиной крови , при 37 ° С в течение от 18 до 24 ч, в зависимости от бактериального штамма (рис 2а). Выполните окрашивали по Граму для проверки морфотипом организма исследуемого, а также чистоту культуры.
    2. Используйте деревянную зубочистку для передачи одного бактериальной колонии на лунку стальной мишени 96-луночного (рис 2b и 2c). Пятно 1 мкл 70% -ной муравьиной кислоты в верхней части сушили на воздухе организма на стальной мишени и оставьте сохнуть в течение приблизительно 2-3 мин.
    3. Затем перекрывают пятно с раствором матрицы 1 мкл, содержащий 50 мг / мл CHCA (α-циано-4-гидроксикоричной кислоты) в органическом растворителе (50% ацетонитрил, 2,5% трифторуксусной кислоты, 47,5% H 2 O).
      Примечание: Кислотный метод наложения (по способу приготовления пластины) может быть использован для повышения качества масс-спектров. Было показано, что для грамположительных бактерий такой «кислотной атаки» увеличивает оценка васифилисе измеренных спектров 45.
      Примечание: В качестве альтернативы автоматизированной системой подготовки проб (Материалы Таблица) могут быть использованы , в которых контакт свободные места 1 мкл 70% раствора муравьиной кислоты и после первого цикла сушки, 1 мкл раствора матрицы наносят на бактериальную мазка. Образцы затем сушат в стандартных условиях, при относительной влажности 60% и готовы к использованию для анализа.
    4. Пусть мазок с матрицей обложил воздушно-сухой снова в течение приблизительно 5 минут в капот. Этот бактериальный мазок с матрицей применяемой в настоящее время стабильна в течение многих часов.
      Примечание: Бактериальные мазки без матрицы не могут быть стабильными из-за деградации белка.
  2. Выполнение MALDI-TOF MS Analysis
    1. Введение образцов
      1. Откройте программное обеспечение управления наших mMIS (Материалы таблицу).
      2. Проветривайте загрузки образца порт масс-спектрометра, нажав на кнопку IN / OUT прибора.
      3. Откройте порт погрузки после щелчка и вставьте мишень MALDI-TOF MS с высушенной бактериальной мазок плюс матрицы.
      4. Закройте порт и эвакуировать снова. Заметим , вакуум и , когда он достигает 4,5 х 10 -6 мбар начала измерения.
    2. Анализ проб
      1. Откройте программное обеспечение для анализа наших mMIS (Материалы таблицы) и выберите в меню "Файл". Выберите "Новая классификация" и новое окно "MALDI Biotyper в реальном масштабе времени мастера классификации" открывает. Введите имя проекта, например "измерения Myroides project_1, в поле" Название проекта "и нажмите кнопку" Новый ". В соответствии с новым диалоговом окне под названием" Новый проект "название проверки проекта и продолжить, нажав на кнопку" OK ".
      2. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Аналит размещения" открытой. Выбор целевых позиций (например, A1, A2, A3 ...), правый клиск любое выбранное положение (обозначено синим квадратом) и выберите пункт "Добавить образцы". В автоматически открыт таблицы типа представления в образце, имя образца ID и необязательно комментарий. Нажмите на кнопку «Далее», чтобы продолжить.
      3. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Выбор MALDI методов Biotyper" открытой. Выберите "Bruker Таксономию" из "ПСМ из таксономических деревьев" и нажмите кнопку "Далее", чтобы продолжить.
      4. В "MALDI Biotyper реального времени мастера классификации" наблюдать окно "Резюме проекта" открытое. Проверьте введенные данные, приведенные выше, для реального проекта классификации. Начало классификации запуска, нажав на кнопку «Готово» (Рисунок 2d - е). Измерение начинается автоматически при достижении соответствующего вакуума.
      5. Следуйте классификации работать, пока измерение не будет успешно завершена. Посмотреть таблицу результатов в тон "MALDI Biotyper Realtime Классификация проекта Myroides измерения project_1" откройте меню "View" и нажмите кнопку "Results".
      6. Просмотр "Bruker Daltonics MALDI Biotyper результатов классификации", как HTML-файл в веб-браузере по умолчанию. Печать и сохранить результаты.
    3. Мера тестовый стандарт ежедневно до начала анализа проб для калибровки прибора и выполнения проверки прибора еженедельно (прибор самопроверки).
      Примечание: Во время измерения MALDI-TOF спектров анализируются в реальном времени с помощью программного обеспечения для анализа (материалы таблицы). Список десяти видов с их соответствующих баллов дается и подается в лабораторной информационной системы (ЛИС) для составления отчетов.
    4. Критически оценить результаты MALDI-TOF MS (см репрезентативные результаты) и, в случае необходимости, включать другие тесты, такие как biochemical- и антибиотических профилей чувствительности или 16S рРНК секвенирования генов и, при необходимости, окрашивали по Граму дляназначая бактериальная видов к микробиологической докладу.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS является новым, быстрый и недорогой метод для микробиологических рутинной диагностики. Бактериальный идентификация видов путем MALDI-TOF MS производит спектры в основном состоит из рибосомных белков , но и других "очень консервативных белков с функциями дом по поддержанию пострадавших в минимальной степени от условий окружающей среды" 17 .The База данных этого mMIS содержит большой набор эталонных спектров и даже бактерии , которые редко встречаются в клинических изолятов может быть надежно идентифицирован 7,56,57. Значения Score показывают надежность идентифицированных видов. Счета выше 2.300 представляют собой весьма вероятную идентификацию видов, оценка между 2.000 и 2.300 указывает на безопасное определение видов, оценка между 1.700 и 2.000 стендов для вероятной идентификации видов и оценка ниже 1,700 не является надежным. В случае более чем одного вида идентифицируется со счетом выше 2.000, дополнительные TESTS должны быть применены , и это является причиной того, почему мы объединили различные методы , такие как 16S - рДНК секвенирования, API и методы адресации бактериальной морфо- и / или фенотип , такие как окрашивание по Граму, моторики и т.п. В том случае , когда оценка ниже 1.700 вышеуказанные тесты должны быть использованы для достижения надежной идентификации видов. Комбинация MALDI-TOF MS и 16S - рДНК секвенирование было продемонстрировано в последнее время 56-58. Следует отметить, что четкие руководящие принципы для определения видов на основе гомологий последовательностей 16S рДНК до сих пор отсутствуют 22,61. Для практической интерпретации, гомологиях ≥97%, как это было предложено Stackebrandt и GÖBEL 61, используются 56. Достижения в области секвенирования ДНК позволяют определить целых бактериальных геномов путем следующих методов генерации при относительно низких затратах и, следовательно, в принципе идентификации бактерий на основе их последовательности генома. Этот метод уже использовался вгенома на основе управления вспышкой или в эпидемиологии 9,29. Тем не менее, самое сильное ограничение на сегодняшний день является отсутствие простых в использовании пакетов программного обеспечения для конечного пользователя 65.

Семь примеров редких встречающихся бактерий, выделенных из проб пациентов при проведении регламентных диагностики и анализируемые как MALDI-TOF MS и 16S рРНК генов последовательности приведены в таблице 1. MALDI-TOF - спектры штамма # 1 до # 6 показаны на рисунке 3 , и спектр штамма # 7, Sphingobacterium spiritivorum, показан на рисунке 1E. Все изоляты показать высокие баллы в MALDI-TOF MS анализа и от 99 до 100% гомологию последовательности 16S рДНК. Таким образом, оба метода приводят к безопасный род и вид идентификации. Однако, как было отмечено в недавней публикации на сравнении методов идентификации , Myroides зр., Сочетание MALDI-TOF MS и 16S рРНК секвенирование гена привело к более надежному г56 РЕЗУЛЬТАТЫ. Эти данные показывают, что один метод, используемый не всегда может быть достаточно для достижения надежного результата идентификации. Сочетание двух независимых методов приводит к более высокой точности и расширяет коммерческую базу данных MALDI-TOF MS с в доме записи привело к однозначному определению видов 56.

Штамм # 1 был идентифицирован как Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF МС счет 2,490, гомология последовательностей 99%). Chryseobacteria грам-отрицательных, не ферментирующие стержни и связанные с Myroides SPP. Chryseobacterium SPP. рассматриваются как появляющиеся патогенные организмы, связанные с септицемии, пневмонии и инфекции мочевых путей. Род Chryseobacterium содержит большое количество видов и наиболее изученными вид Chryseobacterium indologenes. Подобно инфекций , вызванных Myroides зр., В основном у пациентов с ослабленным иммунитетом страдают6,10,60. Штамм # 2 был идентифицирован как Myroides odoratimimus (MALDI-TOF МС счет 2.436, гомология последовательностей 99%) и напряжение # 3 в качестве Myroides odoratus (MALDI-TOF МС счет 2,237, гомология последовательностей 99%) Myroides Sp. являются грамотрицательные, неферментирующие стержни, которые связаны с серьезными заболеваниями, такими как сепсис, целлюлит или воспаление легких. В основном у пациентов с ослабленным иммунитетом лежащих в основе гематологических или онкологических заболеваний , страдают 8,18,42. Штамм # 4 был идентифицирован как Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS счет 2.092, гомология последовательностей 99%).

Бактерии являются грамотрицательные , не являющиеся сбраживающие стержни, которые могут вызвать сепсис у пациентов с иммунодефицитом 5,24,44,53. Кроме того, случай со смертельным исходом менингоэнцефалита сообщалось 70. Пятна # 5 (MALDI-TOF МС счет 2,282, гомологии последовательности 100%) и # 6 (MALDI-TOF МС счет 2.289, последовательность гомологау 100%) были идентифицированы как Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Эти бактерии короткие, не подвижны, грамотрицательные палочки , которые впервые были выделены из личинок паразитических мух вольфартова муха и описано в 2008 году 66. Эти зоонозных бактерии рассматриваются как новых патогенных микроорганизмов и возбудители для бактериемии, септицемии или инфекции мягких тканей 4,40,64. Интересно, что большинство пациентов сообщили были либо без крова и / или страдал от алкоголизма и, следовательно, возникновение этих редких патогенов может объясняться более высокой скоростью эктопаразитов в бездомного населения 4,54. Штамм # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS оценка 2.269, последовательность гомологии 100%), является редким патогеном. Это может привести к инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом и первых человеческих изолятов были описаны в 1982 году 31,71. В недавнем докладе идентифицирует Sphingobacterium spiritivorum , как возбудитель для смертельного случая BACteremia и сепсиса у пациентов с острой миелоидной лейкемией 38.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Рабочий процесс для нуклеиновой кислоты и / или масс - спектрометрии на основе обнаружения клинически значимых бактерий в лаборатории медицинской микробиологии Начиная с чистой культуры (а), ДНК - мишень амплифицировали в амплификатор (б). ПЦР ампликонов упорядочиваются в четырех капиллярного секвенсор с использованием технологии Sanger (с). Результаты секвенирования определяются в виде процента гомологий последовательностей запросов к базе данных записей с помощью компьютеризированного сравнения. Второй метод основан протеомика, использует масс - спектрометрии (d) и в центре масс - спектроскопического результат штамма # 1 в таблице 1, Sphingobacterium spiritivorum, включая MALDI-TOF MS баллов, дается (е </ Сильный>). Сочетание масс - спектрометрии и 16S рРНК секвенирование гена могут быть необходимы для того, чтобы добиться более надежной и точной идентификации видов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2:. Процедура анализа с использованием MALDI-TOF MS для идентификации клинически значимых бактерий Оператор принимает Цельноклеточные бактериального материала (а) с помощью зубочистки из чистой культуры (б) и помещает бактериальные мазки на стальную мишень (с). Мишень сталь вставляется в загрузочное отверстие масс-спектрометра. Когда собственно вакуум 5 × 10 -6 мбар достигается, то цель будет перемещен в ионизационной камере. Использование N 2 -laseг, ионы создаются мягкие десорбцией , которые затем ускоренными в электростатическом поле (D) и отделенной в полетной трубке (е). Время полета (ТОФ) , которые необходимы для ионов , чтобы достичь детектора полета трубки (F) непосредственно связана с их массой и формирует основу последующих расчетов массовых пиков. Специальное программное обеспечение идентификации (материалы Таблица) , а затем присваивает значения оценка в спектре масс отпечатка пальца ионизированных бактериальных белков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: MALDI-TOF спектры и присвоенные оценки редких патогенов На этом рисунке представитель MALDI-TOF спектры первых шести редких патогенных микроорганизмов LIS.Ted в таблице 1 показаны. Видовое название и соответствующая оценка MALDI-TOF MS отмечены в каждом спектре. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

# 3
Напряжение идентификация MALDI MALDI оценка 16s рДНК результат BLAST гомологии
# 1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% идентичности
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% идентичности
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% идентичности
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% идентичности
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% идентичность
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% идентичность
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Таблица 1: Результаты представитель MALDI-тофы редких встречающихся бактерий по сравнению с 16S рРНК секвенирование гена.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Оба MALDI-TOF MS и 16S рРНК секвенирование гена дают возможность идентифицировать большое количество различных бактерий. MALDI-TOF MS является быстрым и недорогим способом, который прост в обращении и большие базы данных бактериальных масс-спектров доступны. По этой причине, MALDI-TOF MS является быстрым, экономически эффективным и надежным методом для проведения исследований , направленных на скрининг редких бактериальных патогенов 17,20,39,51. В проспективном исследовании сравнивали MALDI-TOF MS с другими фенотипическими методами идентификации, Seng и др. Показали , экономичность и скорость MALDI-TOF MS 59 и Tan и др. Сообщили о снижении стоимости реагентов и труда для идентификации бактерий в их лабораторных условиях на 56,9% в год 62. Такие сокращения расходов поддерживаются отметкой Gaillot и др. 28

С другой стороны, 16S рРНК последовательности занимает больше времени, трудоемкими и гарантирует р специализированыersonnel для выполнения анализа 34. Тем не менее, оба подхода пригодны для рутинной диагностики и можно было бы показать , что комбинация этих двух методов приводит к более высокой надежностью и более безопасной точность идентификации, что особенно полезно в случае сомнительных результатов 56. Поэтому мы предлагаем сочетание обоих методов как наилучший подход для проверки идентификации редких бактерий, происходящих в рутинной диагностике. Для надежной идентификации видов, это абсолютно необходимо использовать чистые бактериальные культуры, поскольку смешанные культуры предотвратить определение видов. В качестве проверки достоверности, идентификация видов получены либо с использованием MALDI TOF MS или 16S рДНК последовательности должен быть в соответствии с результатами окрашивали по Граму, биохимических характеристик и клинические проявления 49.

Масс-спектрометрия в качестве аналитического инструмента для идентификации бактерий была впервые предложена в 1975 году51. Тем не менее, он принял до конца 1980 - х годов , чтобы установить это практически подход для анализа белков. Технология «мягкой десорбция ионизации» был введен Коичи Танака в 1985 году 63, который получил Нобелевскую премию по химии в 2002 году, что позволяет анализ интактных белков. В то же время матрица при содействии время ионизации полета масс - спектрометрии был введен Hillenkamp и Карася , как они были первыми , чтобы использовать органическую кислоту для анализа биомолекул 37 , и это тот метод , который до сих пор используется. Хотя MALDI технология была использована спорадически 23,30,41, он принял до 2004 года , когда Bruker Daltonics введен свою MICROFLEX систему MALDI Biotyper (Pittcon конференция & Expo, 2004, пресс - релиз), что на основе MALDI-TOF MS микробная идентификация стала рутинной диагностическая методика 46. Последние подходы в технике MALDI-TOF MS дала возможность идентифицировать дрожжи, бактерии обнаружить мультирезистентнымии выполнять антимикробной чувствительности 17,51. Кроме того, некоторые процедуры дают возможность непосредственно анализировать бактерии из первичных образцов, таких как моча или кровь культур 17,51.

Хотя использование этой системы в основном легко, есть некоторые подводные камни, которые могут повлиять на результаты. Возраст этих микроорганизмов например воздействует на бактериальную экспрессию белка и, следовательно, воспроизводимость результатов. Во-первых, условия роста может быть проблемой. В качестве примера, энтеробактерии , такие как кишечной палочки растут быстрее , чем не-ферментацию бактерий (например, Pseudomonas aeruginos а) и , следовательно , должны быть проанализированы ранее 17. Во-вторых, матрица используется для MALDI-TOF MS состоит из небольших молекул органических кислот, которые оказывают сильное лазерное оптическое поглощение при длине волны лазера, используемого. Перед анализом матрица добавляется к образцу, и оба компонента подвергаются crystallizatioп процесс формирования твердого раствора.

Это объясняет , почему изменения в матрице , могут влиять на точность идентификации бактерий 17. Поэтому свежеприготовленный матричные решения, не старше 7 дней, следует использовать. В- третьих, среда , из которой бактерии выбраны , могут влиять на идентификацию результатов 17,68. Например, кристаллический фиолетовый, который является компонентом МакКонки агар, препятствует масс - спектров 17. Кроме того, применяемые на стальной мишени слишком много бактерий приведет к снижению оценки и, следовательно, влияет на точность идентификации. Поэтому целесообразно определить четкие критерии относительно того, каким образом анализ осуществляется. Тем не менее, вводящие в заблуждение результаты, выполняемые MALDI-TOF MS в основном вызваны недостаточной эталонных спектров, содержащихся в базе данных. ( В настоящее время база данных содержит> 6000 записей.) Это особенно еще случай для идентификации анаэробных бактерий 17. Тем не менее,опо лни тельная спектры могут быть добавлены пользователем. MALDI-TOF MS библиотеки, например , содержит 98 дополнительный опорный спектры изолятов , которые неадекватно рассматриваются в исходной базе данных, таких как Mycoplasma зр., Myroides зр., Legionella зр., Roseomonas зр., Comamonas зр. И Chryseobacterium зр. Следовательно, дополнительная ссылка спектры приведет к более высокой точности идентификации 59,69. Наконец, в некоторых случаях спектры различных видов очень похожи. Это может привести к неправильной идентификации в таких случаях, как дискриминация кишечной палочки и Shigella SPP. или пневмококк и стрептококк тШз 17,51.

Секвенирование 16S рДНК и дополнительных генов , таких как гена rроВ упростили молекулярной идентификации редких или неизвестных бактерий. Эти гены являются общими в большинстве бактерий и их индивидуальная функцияидентичны. Тем не менее, так как они обладают достаточной генетической изменчивости для получения результатов , которые позволяют дифференцирование по роду и видовом уровне, они могут быть использованы для идентификации бактерий 34. Согласно Stackebrandt и GÖBEL, гомология <97% представляют собой различные виды 61. Тем не менее, гомология> 97% не обязательно приводят к защищенной идентификации видов 34,47. Эти неопределенности имеют несколько причин.

Качество баз данных , которые используются для расчета гомологи иногда под вопросом 34. В тех случаях, когда высокие гомология на уровне 16S рДНК существуют, неопределенность может привести к идентификации видов. Поэтому сочетание различных генетических регионов может привести к более безопасным результатам. Кроме того, нет никаких общих рекомендаций для интерпретации 16S рДНК 22,34,61 последовательности данных. Тем не менее, повышение надежности существующих баз данных приведет к более высокому Accuколоритный для идентификации бактерий с использованием этого молекулярного подхода 34. Что касается реакции секвенирования нам необходимо отметить, что точность результатов секвенирования, зависит главным образом от качества лежащей в основе ПЦР. Кроме того, поскольку результаты в настоящее время получили путем сравнения их с позиций, перечисленных в общедоступных базах данных, качество записи и поддержания последовательности данных имеет решающее значение.

В общем, хотя оба подхода, MALDI-TOF MS и 16S рРНК секвенирование гена имеют преимущества, которые они имеют также недостатки. Сочетание обоих методов, однако, приводит к высокой точности для идентификации бактерий. Например, в предыдущем исследовании мы смогли продемонстрировать , что MALDI-TOF MS способен различать Myroides odoratimimus и Myroides odoratus 56. В некоторых случаях MALDI оценка предложил недостоверную идентификации видов, в то время как результаты, полученные с помощью 16S рДНК секвенирования может подтвердить видыидентичность. Массовые спектральные отпечатки этих изолятов были затем созданы и внедрены в нашу базу данных эталонных спектров MALDI. Будущие исследования сосредотачиваясь на других редких бактерий может продемонстрировать применимость предлагаемой стратегии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

Инфекция выпуск 113 бактерии идентификация 16S рРНК секвенирование гена MALDI-TOF MS редкие возбудители сравнение методов диагностики микробиологии
Идентификация редких бактериальными патогенами с 16S рРНК секвенирование гена и MALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter