Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifiering av sällsynta mängden sjukdomsalstrande bakterier från 16S rRNA Gene sekvensering och MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Det finns ett antal sällsynta och följaktligen inte tillräckligt beskrivna bakteriella patogener som rapporteras orsaka allvarliga infektioner, särskilt i patienter med nedsatt immunförsvar. I de flesta fall bara några data, mestadels publicerade som fallrapporter, finns som undersöka vilken roll sådana patogener som ett smittämne. Därför, i syfte att klargöra den patogena karaktären av sådana mikroorganismer, är det nödvändigt att genomföra epidemiologiska studier som omfattar ett stort antal av dessa bakterier. De metoder som används i ett sådant uppföljningsstudie måste uppfylla följande kriterier: identifiering av stammarna måste vara korrekt enligt gällande nomenklatur, bör de vara lätta att hantera (robusthet), ekonomisk i rutindiagnostik och de måste generera jämförbara resultat mellan olika laboratorier. Generellt finns det tre strategier för att identifiera bakteriestammar i en rutin inställning: 1) fenotypisk identifiering karaktäriserar BioChemical och metaboliska egenskaper av bakterierna, 2) molekylära tekniker, såsom 16S rRNA-genen sekvensering och 3) masspektrometri som ett nytt proteom baserad metod. Eftersom masspektrometri och molekylära metoder är de mest lovande verktygen för att identifiera ett stort antal bakteriearter, är dessa två metoder som beskrivs. Förskott, begränsningar och potentiella problem när du använder dessa tekniker diskuteras.

Introduction

Säker identifiering av sällsynta patogener i rutindiagnostik hämmas av det faktum att klassiska kulturella och biokemiska metoder är besvärliga och ibland tvivelaktig. Vidare har en diagnostisk mikrobiologiska laboratoriet för att bearbeta ett stort antal patogener, som sträcker sig från några hundra till flera tusen, dagligen, vilket kräver användning av automatiserade system. Utöver hanteringen av en hög daglig genomströmning krävs exakt identifiering av bakteriearter. Detta är motiverat eftersom de skiljer sig i sina resistensmönster och därför korrekt identifiering ger läkaren viktig information för att välja lämpliga antibiotika (t.ex. Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Automatiserade mikrobiella identifieringssystem (AMIS) tillämpa standardiserade uppsättningar av enzymatiska reaktioner för att karakterisera de metaboliska egenskaperna hos bakterieisolat t.ex., 47 i GN kortet i AMIS användes i denna studie 52, denna strategi tillåter säker identifiering endast för ett begränsat antal bakterier. Vidare är databasen, ett avancerat expertsystem, klart inriktad på detektering av relevanta och högst relevanta bakterier av medicinsk betydelse 13,15,16,36. Ytterligare två system, ofta används i laboratorier, även tillämpa denna biokemiska tillvägagångssätt för bakteriell identifiering. Nyligen genomförda studier visar en jämförbar identifieringsnoggrannhet mellan AMIS användes i denna studie och en av konkurrenterna (93,7% och 93,0% respektive), medan den 3: e Amis har en identifieringsnoggrannhet på endast 82,4% på artnivå 35. Sådana skillnader kan förklaras av kvaliteten på de underliggande identifieringsdatareferenser, versionerna av byggsatser och programvara, skillnader i metabolism och skicklighet av teknisk personal 35,36.

Två automatiska MALDI-TOF MS-system (MALDI-TOF mikrobiell identifieringssystem, MMI) används främst. Dessa system medger detektering av ett stort antal bakteriearter baserat på deras proteinfingeravtrycks masspektra. Exempelvis databasen av de MMI används innehåller 6000 referensspektra. Identifieringssystem baserade på masspektrometri erbjuder snabb och tillförlitlig detektering av en stor mångfald mikroorganismer inklusive sällsynta patogener 11,48,51. Hittills har endast ett fåtal direkta jämförelser finns mellan MMI används i denna studie och dess konkurrent 19,33. Enligt Dæk et al. Båda systemen ger en liknande hög grad av identifiering noggrannhet, men de MMI användes i denna studie verkar vara mer tillförlitliga i artidentifiering 19.

På samma sätt, adresse molekylära tekniker väl bevarade men också distinkta gener ( rpoB) tillåta en tydlig artbestämning 3,22,61. Bland dessa är 16S rDNA den mest använda housekeeping-gen på grund av sin närvaro i alla bakterier 34. Dess funktion är oförändrad och slutligen, med ungefär 1500 bp, det är tillräckligt lång för att vara lämpliga för bioinformatik 14,34. Många forskare anser 16S rRNA genanalys som "guldstandard" för bakteriell identifiering 21. Detta beror på det faktum att få laboratorier använder DNA-DNA hybridiseringstekniker hittills för identifiering av sällsynta eller nya bakterier 14,34. Dessutom, fler och fler databaser finns tillgängliga som kan användas för 16S rRNA genanalys 50. Emellertid måste man ta hänsyn till att 16S rDNA baserade detektionssystem har en begränsad känslighet jämfört med standard-PCR-protokoll. Dessutom är den molekylära tillvägagångssätt sofistikerade, tidskrävande och kräver högt utbildad personal samtdedikerade laboratorier och är därför inte lätt implementeras i rutindiagnostik 55. Dessutom har det visat sig att kombinationen av åtminstone två olika metoder för bakteriell identifiering leder till mycket noggrann stamidentifiering. Kombinationen av MALDI-TOF MS och 16S rDNA-sekvensering möjliggör identifiering av ett stort antal olika bakteriearter med hög noggrannhet. Nyligen kombinationen av MALDI-TOF MS och 16S rRNA genanalys presenterades för bakteriell identifiering studera epidemiologiska frågor och sällsynta patogener 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Utvinning av bakterie-DNA

  1. Framställning av PBS-lösning
    1. Väg 1,65 g Na 2 HPO 4 x 2 H2O, 0,22 g NaH 2 PO 4 x 2 H2O och 8,80 g NaCl i en kolv och fyll med destillerat vatten till en slutvolym av 1000 ml. Justera pH till 7,4. För slutlig användning filtrera lösningen genom ett bakteriesäkert (0,22 | im) filter.
  2. DNA Extraktion av gramnegativa bakterier
    1. Streak patientmaterial på lämpligt odlingsmedier (t.ex. Columbia biodagar), identifiera och isolera potentiella patogener.
    2. Förbereda renkultur och utför Gram-färgning i syfte att fastställa morphotype och för att bekräfta renheten och av kulturen 49.
    3. Välj en enda bakteriekoloni och överför den med en 1 l engångsbruk ympning slinga i en steril 2,0 ml reaktionsrör som innehåller 1 ml PBS-lösning.
    4. Inkubera denna suspension i en Thermomixer vid 95 ° C under 10 min. Efter inkubation, låt bakterieextrakt (innehållande det upplösta DNA) kyl till rumstemperatur och antingen använda den direkt för amplifiering eller förvara vid -20 ° C för vidare användning (Figur 1a).
  3. DNA Extraktion av grampositiva bakterier
    1. Streak patientmaterial på lämpligt odlingsmedier (t.ex. Columbia biodagar), identifiera och isolera potentiella patogener. Utför Gram-färgning för att bekräfta morphotype av kulturen.
    2. Förbereda renkultur och utför Gram-färgning i syfte att fastställa morphotype och för att bekräfta renheten av kulturen.
    3. Välj en enda bakteriekoloni med en steril 1 l ympning slinga och suspendera det i 500 ul PBS-lösning i en 2,0 ml reaktionsrör.
    4. Tillsätt 500 | il glaspärlor och överföra röret till en oscillerande homogenisator, som drivs vid maximal frekvens och amplitud (50 Hz), under 5 min. Använd glaspärlor 1,0 mm diameteratt störa bakteriernas cellväggar.
    5. Inkubera detta rör under 10 minuter vid 95 ° C och kyl till rumstemperatur. Använda extraktet antingen direkt för PCR-reaktionen eller förvara vid -20 ° C för vidare användning.

2. 16S rDNA PCR

  1. Framställning av amplifieringsprimrar
    1. Använd primers TPU1 (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 '[M = A / C]) som framåtriktad primer och RTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') som omvänd primer 25. Förbereda en primer stamlösning med DNAs och RNAs fritt vatten, med en koncentration av 100 pmol / | il (100 | iM) och späd den vidare till en arbetslösning vid 10 pmol / | il. Lagra primern lager och arbetslösning vid -20 ° C eller användas direkt.
  2. Framställning av PCR-reaktionsblandningen
    1. Pipett 1 pl av varje primer, 1 l dNTP-mix (100 mM), 2,5 pl av DNA-extrakt, 5 pl 10x PCR-buffert (innehållande 25 mM MgCl 2), 0,25 ^ il Taq-polymeras (5 enheter / | j, l) och 39,25 ^ il DNAse- och RNAse fri PCR vatten i en steril 200 fil reaktionsröret.
  3. PCR Protocol
    1. Starta PCR-programmet byggdes på följande sätt: För det första, ett initialt inkubationssteg vid 95 ° C under 5 min, vilket är nödvändigt för att aktivera Taq-polymeras. För det andra, 35 amplifieringscykler, innehållande en 1 min. denatureringssteg vid 95 ° C, en 1 min. primerhybridisering steg vid 50 ° C och en 1,5 min primer förlängningssteg vid 72 ° C. För det tredje, en slutlig förlängning i 10 min vid 72 ° C. Slutligen är PCR-reaktionen kyldes till 4 ° C.
      OBS: Staphylococcus aureus och H2O tjäna som positiv och negativ kontroll (figur 1b).
    2. Placera röret innehållande den PCR-reaktionsblandningen i termocykler och starta programmet.
  4. Rening av PCR-produkten
    OBS: För att rena PCR-produkten, flera protokoll antingenenzymbaserade eller med en kiseldioxid adsorptionsmatrisen kan användas. Den enda steg PCR sanering används här utnyttjar två hydrolytiska enzymatiska reaktioner. Medan exonukleas I (Exo I) avlägsnar enkelsträngat DNA, alkaliskt fosfatas från räka (SAP) hydrolyserar unincorporated dNTPs. Det andra förfarandet är baserad på en kiselmembran adsorption teknik med en hög salt snabbt bindande - tvätta - låg salteluering cykel.
    1. Tillsätt 1,5 pl av en enzymatisk blandning innehållande både Exo I och SAP till 25 pl PCR-produkt, blanda noga och överför till en termo tillämpa ett enkelt protokoll för första 15 minuter vid 37 ° C följt av 15 minuter vid 80 ° C. Lagra den renade PCR-produkten antingen vid -20 ° C eller använda den direkt som mål för att märka PCR.

3. DNA agarosgelelektrofores

  1. Framställning av elektroforesbufferten (TBE-buffert)
    1. Titrera 54,0 g (445 mM) Tris-bas, 27,5 g (445 mM) borsyra och 20 ml av en 0,5 M EDTA (10mM) lösning vid pH 8,0 med NaOH i en kolv och fyll den med destillerat vatten till en totalvolym av 1000 ml. Späd sedan denna 5x buffert 01:10 med destillerat vatten (0,5x TBE) för elektrofores.
  2. Framställning av laddningsbuffert
    1. Blanda 250 mg bromfenolblått, 250 mg xylencyanol FF och 15 g polysackaros (Material tabell) i en kolv. Sedan fylla den med 0,5x TBE-buffert till en total volym av 100 ml. Alikvotera laddningsfärg till 1 ml portioner och förvara vid -20 ° C för vidare användning.
  3. Gjutning av agarosgelen
    1. Väg 6 g standard elektrofores agaros till 300 ml 0,5x TBE-buffert (se avsnitt 3.1.1) i en kolv, för att framställa en 2% (vikt / volym) agarosgel. Sedan lägga agaros blandningen i en mikrovågsugn, värm det nära kokpunkten tills agarosen är fullständigt upplöst och lösningen verkar klar.
    2. Låt de smälta agarosen svalna tillräckligt och tillsätt 10 | il av en 1% (vikt / volym) etidiumbromid lager solution. Häll lösningen i en gjuten och placera en gel kam (möjliggör 30 brunnar) i rösterna. Ta kammen när gelén är helt stelnad och sätta gelén i elektroforeskammare innehållande 0,5x TBE-buffert.
      OBS: Etidiumbromid är giftig och mutagen. Därför skall den hanteras med försiktighet. Det är tillrådligt att använda nitril. Det finns alternativa interkalerande nukleinsyra fläckar som kan användas som en giftfri alternativ.
  4. Agarosgelelektrofores av PCR-produkterna
    OBS: För att kontrollera att rätt storlek av PCR-amplikoner och uppskatta DNA-koncentrationen den renade PCR-produkten separeras i en agarosgel.
    1. Pipettera 2 ul av laddningsbufferten till en PCR-reaktionsröret och tillsätt 8 | il av PCR-produkten. Pipettera denna blandning i brunnarna hos gelén. Tillsätt 8 | il av en molekylvikt storleksmarkör (DNA-stege) i en separat väl för att uppskatta storleken av PCR-produkten.
    2. Tillämpaen konstant spänning på 10 V / cm och stoppa elektrofores så snart bromofenolblått markör har nått ungefär tre fjärdedelar av den totala längden av gelén. Visualisera separerade PCR-fragmenten med hjälp av en UV-transilluminator (våglängd 302 nm) och dokumentera dem med en gel-dokumentationssystem. Uppskatta hur stor mängd av DNA genom visuell jämförelse med DNA-stege. Använd cirka 10 ng som mål för märkning PCR.

4. Sånger Sequencing

  1. Cycle Sequencing PCR
    OBS: Utför PCR märkning i en 10 pl reaktion med användning av ett kommersiellt kit (Material tabell).
    1. Tillsätt 2 pl 5x reaktions mastermix, 2 pl av DNA-beredningen, 1,5 pl TPU1 eller RTU4 arbetslösning (10 pmol / l) och 4,5 pl DNAse och RNas fritt vatten.
    2. Sätt denna sekvensereaktionsblandning i en termo och köra en annan PCR. Totalt process 25 cykler bestående av ett denatureringssteg (96 ° C,10 sek), ett härdningssteg (45-60 ° C, 5 sek) och ett förlängningssteg (60 ° C, 2 min). Slutligen kyldes reaktions till 4 ° C.
  2. Rening av sekvenseringsreaktionen
    1. Rena märkningsreaktionsblandningen med hjälp av kommersiella spinnkolonner för PCR rening (Material tabell).
    2. Belastning 10 fil av sekvenseringsreaktionen på den pre-hydratiserat gelfiltrering matris och utföra ett centrifugeringssteg vid 750 xg under 3 min.
      OBS: Genom att använda detta förfarande icke inkorporerade färgämnestermine behålls i gelmatrisen.
    3. Torka sedan vatten eluatet i vakuum anrikningsverk. Centrifugera vid 2500 xg under 20 till 30 minuter vid 40 ° C till fullständig torrhet.
    4. Tillsätt 10 | il av mycket avjoniserat formamid denaturera sedan vid 90 ° C under 2 min och kyl blandningen på is. Pipett 10 ul av de denaturerade prov på en 96 väl il platta. Lagra den torkade och rengöras PCR-produkt vid -20 ° C om analysen ärsom skall utföras vid ett senare tillfälle.
  3. 16S rRNA Gene sekvensering och analys av DNA-sekvensen
    OBS: Genomför sekvensanalys på en automatiserad sequencer (Material tabell). Sekvenseraren som används här är en automatiserad fluorescensbaserad kapillärelektroforessystem som analyserar 4 prover samtidigt (50 cm 4-kapillär array) med en flytande polymer 67 (figur 1c).
    1. Placera mikrotiterplattan i sequencer. Skriv ett provblad (platta rekord) som anges i 2, spara den och starta sekvenseringskörning / analys att följa stegen som anges i ett.
      OBS: Duration av en sekvens körning är 2 timmar och tillhandahåller data från 800 till 1000 bp.
    2. Öppna sekvenseringsanalys programvara (Material tabell). Sekvensdata ges som en textfil (.seq) och en fil som innehåller elektrofores inklusive kvalitetsvärden (QV) (.ab1).
      OBS: Base ringer automatiskt perbildad genom sekvenseringsanalys programvara och den underliggande elektroferogram kontrolleras visuellt (t.ex., topphöjd, toppseparation) innan sekvensen användes för ytterligare tillämpningar.
    3. Jämför den lagrade DNA-sekvensen fil till NCBI nr databasen med BLAST-algoritmen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

OBS! Masspektrometer använder en 337 nm N2 laser och drivs av en specifik styrprogram (Material tabell). Spektra registreras i linjärt läge och ett massområde mellan 2000 till 20000 Da är täckt. Data tolkning och fördelning av poäng till proven genomförs i realtid av en analysmjukvara (Material tabell) (Figur 1d).

  1. Beredning av bakterier för MALDI-TOF MS-analys
    1. Odla bakterier av intresse (t.ex. Myroides odoratimimus) på ColUmbia blodagar innehållande 5% hästblod vid 37 ° C under 18 till 24 timmar, beroende på bakteriestammen (figur 2a). Utför Gram-färgning för att kontrollera morphotype av organismen som undersöks samt renhet av kulturen.
    2. Använda en tandpetare för att överföra en enda bakteriekoloni till en brunn i en 96-brunnars mål-stål (fig 2b och 2c). Spot 1 pl 70% myrsyra ovanpå den lufttorkade organismen på målet stål och låt torka i ca 2-3 minuter.
    3. Därefter överlagra fläcken med ett pl matrislösning, som innehöll 50 mg / ml CHCA (α-cyano-4-hydroxikanelsyra) i ett organiskt lösningsmedel (50% acetonitril, 2,5% trifluorättiksyra, 47,5% H2O).
      OBS: Syra overlay-metoden (på platta framställningsmetoden) kan användas för att förbättra kvaliteten på den masspektra. Det har visat sig att för grampositiva bakterier såsom en "syraangrepp" ökar poängen vaLues av den uppmätta spektra 45.
      OBS: Alternativt kan en automatiserad provberedning system (Material tabell) kan användas i vilken kontaktfria fläckar av 1 pl 70% myrsyra lösning och efter en första torkningen, är en il matrislösningen appliceras på bakteriefläck. Proverna torkades sedan under standardiserade förhållanden vid 60% relativ fuktighet och är redo att använda för analys.
    4. Låt utstryket med matrisen överdrog lufttorka igen i ca 5 minuter i en huva. Denna bakterie utstryket med matrisen anbringas är nu stabil under många timmar.
      OBS: Bakteriesmutsfläckar utan matris kan inte vara stabil på grund av proteinnedbrytning.
  2. Utförande av MALDI-TOF MS-analys
    1. Införing av prov
      1. Öppna styrprogram för våra MMI (Material tabell).
      2. Lufta provladdningssporten hos masspektrometern genom att trycka på IN / UT-knappen av instrumentet.
      3. Öppna laddningsporten efter ett klick och sätt i MALDI-TOF MS måltavla med den torkade bakterie smeta plus matris.
      4. Stäng porten och evakuera igen. Observera vakuum och när den når 4,5 x 10 -6 mbar starta mätningen.
    2. prov~~POS=TRUNC
      1. Öppna analysprogram våra MMI (Material tabell) och klicka på menyn "Arkiv". Välj "Ny klassificering" och en ny "realtid guiden MALDI biotyper klassificering" öppnas. Skriv in projektnamnet, till exempel "Myroides mätning project_1, i fältet" Projektnamn "och tryck på knappen" Ny ". Enligt den nya dialogrutan som heter" Nytt projekt "check projektnamn och fortsätt genom att trycka på knappen" OK ".
      2. I "MALDI biotyper realtid guiden klassificering" observera "analyt placering" fönstret öppet. Välj målpositioner (t.ex. A1, A2, A3 ...), höger click någon vald position (anges med en blå fyrkant) och välj "Lägg till prov". I automatiskt öppnade tabellen vytyp i prov namn, prov-ID och eventuellt en kommentar. Klicka på knappen "Next" för att fortsätta.
      3. I "MALDI biotyper realtid guiden klassificering" observera "Val av MALDI biotyper metoder" fönstret öppet. Välj "Bruker Taxonomy" från "MSPs från taxonomi träd" och klicka på "Nästa" för att fortsätta.
      4. I "MALDI biotyper realtid guiden klassificering" observera "Projektsammanfattning" fönstret öppet. Kontrollera de insatta poster som ges ovan för den faktiska klassificeringen projektet. Starta klassificering drivs genom att trycka på knappen "Finish" (Figur 2d - f). Mätning startar automatiskt när lämpligt vakuum uppnåtts.
      5. Följ klassificerings gå tills mätningen är klar. Se tabellen resulterar i than "MALDI Biotyper Realtime Klassificering Project Myroides mätning project_1" öppna menyn "Visa" och klicka på "Resultat".
      6. Visa "Bruker Daltonics MALDI Biotyper klassificeringsresultat" som HTML-filen i standardwebbläsaren. Skriv och spara resultaten.
    3. Mät en teststandard dagligen före provanalys för att kalibrera instrumentet och utföra instrument validerings vecka (instrument självtest).
      OBS: Vid mätning MALDI-TOF-spektra analyseras i realtid av analysprogrammet (Material tabell). En förteckning över tio arter med sina respektive poäng ges och matas in i laboratoriet informationssystem (LIS) för rapportering.
    4. Kritiskt utvärdera MALDI-TOF MS resultat (se representativa resultat) och, i förekommande fall, omfatta andra tester, såsom biochemical- och antibiotikakänslighet profiler eller 16S rRNA-genen sekvensering och vid behov, Gram-färgning förtilldela en bakterieart till mikrobiologiska rapport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS är en ny, snabb och billig metod för mikrobiologisk rutindiagnostik. Bakteriell artbestämning av MALDI-TOF MS producerar spektra huvudsakligen består av ribosomproteiner men även andra "mycket konserverade proteiner med hushållning funktioner påverkas i minimal grad av miljöförhållanden" 17 .Det databas denna MMI innehåller ett stort antal referensspektra och även bakterier som sällan förekommer i kliniska isolat kan säkert identifieras 7,56,57. Betyg värden visar tillförlitligheten av de identifierade arterna. Poäng över 2,300 representerar en mycket sannolik artbestämning, en poäng mellan 2,000 och 2,300 indikerar en säker artbestämning, är en poäng mellan 1.700 och 2.000 står för en sannolik artbestämning och en score under 1.700 icke-tillförlitlig. När det gäller mer än en art identifieras med en poäng över 2.000, ytterligare tests måste tillämpas och det är anledningen till att vi har kombinerat olika metoder såsom 16S rDNA-sekvensering, API och tekniker som behandlar bakteriell morfologiska och / eller fenotyp såsom gramfärgning, rörlighet etc. I fallet där poängen är lägre än 1.700 ovan nämnda testerna måste användas för att uppnå tillförlitlig artbestämning. En kombination av MALDI-TOF MS och 16S rDNA-sekvensering har visats nyligen 56-58. Det bör påpekas att klara riktlinjer för artbestämning baserat på 16S rDNA sekvenshomologier fortfarande saknas 22,61. För praktisk tolkning homologier av ≥97%, som föreslagits av Stackebrandt och Göbel 61, används 56. Framsteg inom DNA-sekvensering kan användas för bestämning av hela bakteriella genomen från nästa generations tekniker till relativt låg kostnad och är därför, i princip identifiering av bakterier baserat på deras genomsekvens. Denna teknik har redan använts igenomet baserade utbrott ledning eller i epidemiologi 9,29. Dock är den starkaste begränsningen idag bristen på lätt att använda programpaket för slutanvändaren 65.

Sju exempel av sällsynta förekommande bakterier, isolerad från patientprover under rutindiagnostik och analyserades genom både MALDI-TOF MS och 16s rRNA-genen sekvensering är listade i tabell 1. MALDI-TOF-spektra av stam # 1 till # 6 visas i figur 3 och ett spektrum av stam # 7, Sphingobacterium spiritivorum, visas i figur 1e. Alla isolat visar höga poäng i MALDI-TOF MS-analys och 99 till 100% 16S rDNA sekvenshomologier. Således, båda teknikerna leder till säkra släkte och art identifiering. Men som påpekats i en nyligen publicerad på att jämföra identifieringsmetoder Myroides sp., Kombinationen av MALDI-TOF MS och 16S rRNA gensekvenser ledde till mer tillförlitlig resultat 56. Dessa data visar att en enda metod som används inte alltid är tillräcklig för att uppnå en tillförlitlig identifieringsresultat. Kombinationen av två oberoende metoder leder till en högre noggrannhet och expanderar den kommersiella MALDI-TOF MS-databas med interna poster resulterat i en entydigt identifiera 56 arter.

Stam # 1 identifierades som Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS poäng 2,490, sekvenshomologi 99%). Chryseobacteria är gramnegativa, icke-fermenterande stavar och relaterade till Myroides spp. Chryseobacterium spp. betraktas som nya patogener, i samband med blodförgiftning, lunginflammation och urinvägsinfektioner. Släktet Chryseobacterium består av ett stort antal arter och de mest studerade arterna är Chryseobacterium indologenes. Liknande infektioner orsakade av Myroides sp., Är mestadels immunsupprimerade patienter drabbade6,10,60. Stam # 2 identifierades som Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS poäng 2,436, sekvenshomologi 99%) och stam # 3 som Myroides odoratus (MALDI-TOF MS poäng 2,237, sekvenshomologi 99%) Myroides sp. är gram-negativa, nonfermenting stavar som är förknippade med allvarliga sjukdomar, såsom sepsis, cellulit eller lunginflammation. Mestadels immunsupprimerade patienter med underliggande hematologiska eller onkologiska sjukdomar påverkas 8,18,42. Stam # 4 identifierades som Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS poäng 2,092, sekvenshomologi 99%).

Bakterierna är gramnegativa icke-fermenterande stavar, som kan orsaka blodförgiftning i patienter med nedsatt immunförsvar 5,24,44,53. Dessutom har ett fall av dödlig meningoencefalit rapporterats 70. Fläckarna # 5 (MALDI-TOF MS poäng 2,282, sekvenshomologi 100%) och # 6 (MALDI-TOF MS poäng 2,289, sekvenshomologeny 100%) identifierades som Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Dessa bakterier är korta, icke-rörliga, gramnegativa stavar som först isolerades från larver av parasitfluga Wohlfahrtia Magnifica och beskrivs i 2008 66. Är dessa zoonotiska bakterier anses nya patogener och orsakande medel för bakteriemi, blodförgiftning eller mjukdelsinfektioner 4,40,64. Intressant, de flesta patienter som rapporterades var antingen hemlösa och / eller led av alkoholism, och därför kan förekomsten av dessa sällsynta patogener förklaras av högre ektoparasiter i hemlösa befolkningen 4,54. Stam # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS poäng 2,269, sekvenshomologi 100%), är en sällsynt patogen. Det kan orsaka infektioner hos patienter med nedsatt immunförsvar och första mänskliga isolat beskrevs 1982 31,71. En färsk rapport identifierar Sphingobacterium spiritivorum som orsakande ämnet för ett dödsfall i bacteremia och sepsis hos en patient med akut myeloisk leukemi 38.

Figur 1
Figur 1:. Workflow för nukleinsyra och / eller masspektrometri baserad detektion av kliniskt relevanta bakterier i den medicinska mikrobiologiska laboratoriet Med utgångspunkt från en ren kultur (a), mål-DNA amplifieras i en termocykler (b). PCR-amplikoner sekvenseras i en fyra kapillär sekvenserare med användning av Sånger-tekniken (c). Sekvense resultat bestäms som procent homologier av fråge sekvenser till databasposter av datorstödd jämförelse. En andra, proteomik baserad metod, använder masspektrometri (d) och i centrum en mass spektroskopisk resultat av stam # 1 i tabell 1, Sphingobacterium spiritivorum, inklusive dess MALDI-TOF MS poäng, ges (e </ Strong>). En kombination av masspektrometri och 16S rRNA gensekvenser kan vara nödvändigt för att uppnå en mer tillförlitlig och korrekt artbestämning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2:. Analys proceduren med MALDI-TOF MS för identifiering av kliniskt relevanta bakterier En operatör tar helcells bakteriematerial (a) med en tandpetare från en ren kultur (b) och placerar bakteriefläckar på ett mål stål (c). Mål-stål är införd in i laddnings porten på masspektrometern. När rätt vakuum av 5 x 10 -6 mbar uppnås, kommer målet att flyttas till joniseringskammaren. Med användning av en N 2 -laser, joner skapas av mjuk desorption som sedan accelereras i ett elektrostatiskt fält (d) och separeras i flygröret (e). Flygtiden (TOF) som behövs för jonerna att nå detektorn flygningen röret (f) är direkt relaterad till deras massa och utgör grunden för efterföljande beräkningar av mass toppar. Specifika identifierings programvara (Material tabell) tilldelar sedan poängen masspektrumet fingeravtryck av joniserade bakterieproteiner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: MALDI-TOF-spektra och tilldelade mängder av sällsynta patogener I denna figur representativt MALDI-TOF-spektra av de första sex sällsynta patogener lis.Ted i tabell 1 visas. Artnamn och motsvarande MALDI-TOF MS poäng noteras i varje spektrum. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

# 3
Anstränga MALDI identifiering MALDI Poäng 16s rDNA resultat BLAST homologi
# 1 Chryseobacterium gleum 2,211 Chryseobacterium gleum 99% identitet
# 2 Myroides odoratimimus 2,397 Myroides odoratimimus 99% identitet
Myroides odoratus 2,237 Myroides odoratus 99% identitet
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% identitet
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2,289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% identitet
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2,269 Sphingobacterium spiritivorum

Representativa MALDI-tofs resultat av sällsynta förekommande bakterier i jämförelse med 16s rRNA gensekvenser: Tabell 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Både MALDI-TOF MS och 16S rRNA gensekvenser erbjuder möjligheten att identifiera ett stort antal olika bakterier. MALDI-TOF MS är en snabb och billig metod, vilken är enkel att hantera och stora databaser av bakteriellt masspektra är tillgängliga. Av denna anledning är MALDI-TOF MS en snabb, kostnadseffektiv och tillförlitlig metod för att genomföra screening studier inriktade på sällsynta bakteriella patogener 17,20,39,51. I en prospektiv studie som jämförde MALDI-TOF MS med andra fenotypiska metoder för identifiering, Seng et al. Visade kostnadseffektivitet och hastighet av MALDI-TOF MS 59 och Tan et al. Rapporterade en minskning av reagens och arbetskostnader för bakteriell identifiering i sin laboratoriemiljö med 56,9% per år 62. Sådana kostnadsminskningar stöds av en del av Gaillot et al. 28

Å andra sidan, är mer tidskrävande, arbetskrävande 16S rDNA-sekvensering och optioner specialiserade personnel att utföra analysen 34. Ändå båda metoder är lämpliga för rutindiagnostik och det kan påvisas att kombinationen av dessa två metoder leder till en högre tillförlitlighet och säkrare identifiering noggrannhet, vilket är särskilt fördelaktigt i fallet med osäkra resultat 56. Därför föreslår vi en kombination av båda metoderna som det bästa tillvägagångssättet för att kontrollera identifieringen av sällsynta förekommande bakterier i rutindiagnostik. För tillförlitlig artbestämning, är det absolut nödvändigt att använda rena bakteriekulturer eftersom blandade kulturer förhindra artbestämning. Som en rimlighetskontroll, artbestämning erhålls med antingen MALDI TOF MS eller 16S rDNA-sekvensering måste vara i enlighet med resultaten från Gram-färgning, biokemisk karakterisering och den kliniska presentationen 49.

Masspektrometri som ett analytiskt verktyg för bakteriell identifiering först föreslogs 197551. Men det tog fram till slutet av 1980-talet för att upprätta en praktiskt tillvägagångssätt för proteinanalys. Den "mjuka desorption jonisering" teknik introducerades av Koichi Tanaka 1985 63, som fick Nobelpriset i kemi 2002, vilket gör analys av intakta proteiner. Samtidigt matrisen assisterade jonisering flygtid masspektrometri infördes av Hillenkamp och Karas som de var först med att använda en organisk syra för att analysera biomolekyler 37 och detta är den metod som fortfarande används idag. Även MALDI tekniken har använts sporadiskt 23,30,41, tog det fram till 2004 då Bruker Daltonics introducerade sin Micro MALDI Biotyper systemet (Pittcon Conference & Expo 2004 pressmeddelande), att MALDI-TOF MS baserad mikrobiell identifiering blev en rutin diagnostisk teknik 46. Nya metoder i MALDI-TOF MS-tekniker gav möjlighet att identifiera jäst, upptäcka multiresistenta bakterieroch utför resistensbestämning 17,51. Dessutom vissa förfaranden ger möjlighet att direkt analysera bakterier från delprov, såsom urin eller blododlingar 17,51.

Även om användningen av detta system är i huvudsak enkel, det finns några fallgropar som kan påverka resultaten. En ålder av mikroorganismerna till exempel påverkar den bakteriella proteinexpression och därför reproducerbarheten av resultaten. För det första kan tillväxtbetingelser vara ett problem. Som ett exempel, enterobakterier såsom Escherichia coli växa snabbare än icke-fermenterande bakterier (t.ex., Pseudomonas aeruginos a) och följaktligen måste analyseras tidigare 17. För det andra, den matris som används för MALDI-TOF MS består av små organiska syramolekyler som har en stark laser optisk absorption för våglängden hos den använda lasern. Före analys matrisen tillsätts till provet och båda komponenterna genomgå en crystallization process som bildar en fast lösning.

Detta förklarar varför förändringar i matrisen kan påverka noggrannheten av den bakteriella identifiering 17. Därför nygjord matris lösningar, inte äldre än 7 dagar, bör användas. För det tredje, det medium som bakterier plockas kan påverka identifieringen resultat 17,68. Till exempel, kristallviolett, som är en del av MacConkey agar, stör masspektra 17. Dessutom kommer alltför många bakterier som tillämpas på målet stål leda till lägre poäng och därmed påverka identifieringsnoggrannhet. Därför är det lämpligt att fastställa tydliga kriterier för hur en analys utförs. Men missvisande resultat som utförs av MALDI-TOF MS oftast orsakas av otillräcklig referensspektra som finns i databasen. (För närvarande databasen innehåller> 6000 poster.) Detta är särskilt fortfarande fallet för identifiering av anaeroba bakterier 17. Emellertid ettY tterligare spektra kan läggas till av användaren. MALDI-TOF MS-bibliotek till exempel innehåller 98 ytterligare referensspektra av isolat som inte i tillräcklig grad av den ursprungliga databasen, såsom Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas Chryseobacterium sp. Och sp. Följaktligen kommer ytterligare referensspektra leda till en högre identifieringsnoggrannhet 59,69. Slutligen, i vissa fall spektra för olika arter är mycket lika. Detta kan leda till felidentifiering i sådana fall som diskriminering av Escherichia coli och Shigella spp. eller Streptococcus pneumoniae och Streptococcus mitis 17,51.

Sekvensering av 16S rDNA och ytterligare gener som rpoB har förenklat molekylär identifiering av sällsynta eller okända bakterier. Dessa gener är vanliga i de flesta bakterier och deras individuella funktion äridentisk. Men eftersom de har tillräckligt genetisk variation för att ge resultat som tillåter en differentiering på släkte och art nivå, de kan användas för bakteriell identifiering 34. Enligt Stackebrandt och Göbel, homologier <97% representerar olika arter 61. Däremot har homologier> 97% inte nödvändigtvis leda till en säker artbestämning 34,47. Dessa osäkerheter har flera orsaker.

Kvaliteten på databaser som används för att beräkna homologier är ibland tveksamt 34. I de fall där höga homologier på 16S rDNA nivå existerar, kan osäkerheter resultera i artbestämning. En kombination av olika genetiska regioner kan därför leda till säkrare resultat. Dessutom finns det inga allmänna riktlinjer för tolkningen av 16S rDNA sekvenseringsdata 22,34,61. Dock kommer att öka tillförlitligheten i befintliga databaser leda till en högre Accukrati för bakteriell identifiering med hjälp av denna molekylära tillvägagångssätt 34. Beträffande sekvenseringsreaktionen måste vi nämna att noggrannheten hos sekvenseringsresultaten bygger främst på kvaliteten på den underliggande PCR. Eftersom resultaten som uppnås genom att jämföra dem med de uppgifter som anges i offentliga databaser, är kvaliteten av sekvensposter och underhåll av uppgifter av avgörande betydelse.

I allmänhet, även om bägge metoderna, MALDI-TOF MS och 16S rRNA-genen sekvensering, har fördelar har de också svagheter. Kombinationen av båda metoderna leder emellertid till en hög noggrannhet för bakteriell identifiering. Till exempel, i en tidigare studie som vi kunde visa att MALDI-TOF MS kan skilja mellan Myroides odoratimimus och Myroides odoratus 56. I ett fåtal fall MALDI poäng föreslog otillförlitliga artbestämning, medan de resultat som uppnåtts genom 16S rDNA-sekvensering kunde bekräfta artenidentitet. Masspektrala fingeravtryck dessa isolat sedan skapades och infördes i vår MALDI referensspektra databas. Framtida forskning med fokus på andra sällsynta bakterier kan visa tillämpbarheten av den föreslagna strategin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

Infektion bakterier identifiering 16S rRNA gensekvenser MALDI-TOF MS sällsynta patogener jämförelse av diagnostiska metoder mikrobiologi
Identifiering av sällsynta mängden sjukdomsalstrande bakterier från 16S rRNA Gene sekvensering och MALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter