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Biology

माउस स्तन ग्रंथि के जमे हुए वर्गों पर अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस

Published: December 1, 2015 doi: 10.3791/53179
Automatic Translation
1, 1
1Jouy-en-Josas Centre, INRA

Summary

इस आलेख में वर्णित अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का पता लगाने और माउस स्तन ग्रंथि में प्रोटीन का स्थानीयकरण अनुमति देता है। एक पूर्ण विधि, स्तन ग्रंथि के नमूने तैयार करने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा छवि के लिए, ऊतक वर्गों इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री प्रदर्शन करने के लिए, और छवियों को फिर से संगठित करने के लिए दिया जाता है।

Abstract

अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने और एक ऊतक में ब्याज की प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रोटीन की प्रतिरक्षा का पता लगाने के लिए एक पूर्ण और सरल विधि, स्तन ग्रंथि स्तनपान कराने वाली माउस एक उदाहरण के रूप में लिया जा रहा है वर्णन करता है। विशेष रूप से माउस स्तन ग्रंथि, ऊतक निर्धारण और जमे हुए ऊतक सेक्शनिंग के विच्छेदन के विषय में ऊतकों के नमूनों की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल, विस्तृत रहे हैं। एक मानक प्रोटोकॉल एक वैकल्पिक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति कदम सहित अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए भी प्रस्तुत किया है। लेबल ऊतक वर्गों के अवलोकन के साथ ही छवि अधिग्रहण और बाद के उपचार भी कहा गया है। यह प्रक्रिया एक प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण करने के लिए पशुओं के ऊतकों के संग्रह से एक पूरी सिंहावलोकन देता है। इस सामान्य विधि अन्य ऊतकों के नमूनों को लागू किया जा सकता है, यह अध्ययन प्रत्येक ऊतक / प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

Introduction

स्तन ग्रंथि जिसका मुख्य समारोह नवजात शिशुओं को खिलाने के लिए दूध का उत्पादन होता है एक असामान्य स्तनधारी बहि अंग है। स्तन के ऊतकों के विकास मुख्य रूप से जन्म के बाद होता है और उपकला आसपास के स्ट्रोमा पर हमला, जिसमें एक अद्वितीय प्रक्रिया के द्वारा होती है। इस ऊतक समन्वित रूप से प्रजनन की स्थिति में बदलाव (चित्रा 1) के साथ, विशेष रूप से वयस्क जीवन के दौरान कई परिवर्तन (विकास, भेदभाव और प्रतिगमन) से होकर गुजरती है। ऊतक के समग्र आकृति विज्ञान के अलावा, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के साथ ही स्तन ग्रंथि के भीतर उनकी व्यवस्था के अनुपात में नाटकीय रूप से विकास 1-5 दौरान बदल जाते हैं।

भ्रूण जीवन के दौरान, स्तन उपकला भ्रूण दिन 10.5 (E10.5) (चित्रा 1 ए के आसपास midline के प्रत्येक पक्ष पर आगे और हिंद अंग के बीच, बाहरी झिल्ली के एक मामूली मोटा होना और स्तरीकरण द्वारा परिभाषित किया गया है, जो स्तन के दूध लाइनों, से निकला )।E11.5 पर, दूध लाइन संतुलित रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थानों पर स्तन दूध रेखा के साथ तैनात कर रहे हैं, जो अलग-अलग placodes, में टूट जाता है, और आसपास के mesenchyme गाढ़ा करने के लिए शुरू होता है। placodes डर्मिस में गहरी सिंक करने के लिए शुरू और स्तन mesenchyme स्तन कली (E12.5-E14.5) के चारों ओर गाढ़ा परतों में आयोजित करता है। E15.5 के रूप में, स्तन उपकला, पैदा करना और वसा पैड की ओर स्तन mesenchyme के माध्यम से धक्का है कि प्राथमिक अंकुर फार्म को बढ़ाना शुरू होता है। प्राथमिक अंकुर निप्पल म्यान के गठन के द्वारा चिह्नित त्वचा के लिए एक खोलने के साथ एक खोखला लुमेन विकसित करता है। E18.5 पर, elongating वाहिनी वसा पैड में हो गया है और वसा पैड में घेर एक छोटे arborized नलीपरक प्रणाली में branched है। विकास अनिवार्य रूप से गिरफ्तार कर लिया है और अल्पविकसित स्तन ग्रंथि यौवन जब तक morphogenetically मौन बनी हुई है। पुरुष भ्रूण में, एण्ड्रोजन रिसेप्टर्स की सक्रियता के गायब हो जो कलियों का अध: पतन की ओर जाता हैE15.5 द्वारा। E18 के रूप में, स्तन विकास यौवन 6-9 तक रहता है।

जन्म के समय, स्तन ग्रंथि elongates और शाखाओं धीरे धीरे (सममितीय विकास) कि एक अल्पविकसित नलीपरक सिस्टम बंदरगाहों। यौवन की शुरुआत में, नलिकाओं के सुझावों पर स्थित गोलाकार संरचना टर्मिनल अंत कलियों (TEBs), टोपी कोशिकाओं के एक बाहरी परत और कोशिकाओं के एक बहुस्तरीय भीतरी कोर (शरीर की कोशिकाओं) का गठन कर रहे हैं कहा जाता है। इन संरचनाओं अत्यधिक proliferative हैं और हार्मोनल संकेतों के जवाब में आसपास के स्ट्रोमल ऊतक घुसपैठ। नलीपरक बढ़ाव में TEBs परिणामों के भीतर प्रसार, morphogenesis शाखाओं में बंटी के साथ मिलकर। यह प्रक्रिया निपल (चित्रा 1 बी, यौवन) से निकलने वाली एक बुनियादी उपकला arborized नेटवर्क की स्थापना के लिए होता है। ~ 10-12 सप्ताह के जन्म के बाद, उपकला पूरे वसा पैड पर आक्रमण किया है, जब इसके विस्तार बंद हो जाता है और कम से TEBs गायब। नलीपरक विकास तो गतिशील परिवर्तन, यानी, successi से होकर गुजरती हैestrous चक्र 10 (चित्रा 1 बी, वयस्क) के अनुसार उपकला कोशिकाओं के प्रसार को और प्रतिगमन किया है।

हमल की शुरुआत से, स्तन के ऊतकों को स्तनपान के लिए तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण वृद्धि और रूपात्मक बदलाव आए। स्तन उपकला बड़े पैमाने पर एक उच्च branched tubulo वायुकोशीय नेटवर्क के प्रमुख के लिए पैदा करना और अलग। समन्वित रूप से, स्तन उपकला कोशिकाओं (MECS) ध्रुवीकृत और synthesize और दूध उत्पादों छिपाना करने में सक्षम हो जाते हैं। MECS सिकुड़ा myoepithelial कोशिकाओं से घिरा हुआ है और संयोजी और वसा ऊतकों, रक्त वाहिकाओं और तंत्रिका टर्मिनलों (चित्रा 1 बी, गर्भावस्था) से बना एक स्ट्रोमा में शामिल कर रहे हैं कि कई वायुकोशीय संरचनाओं (acini) में आयोजन। इसके अलावा, MECS के बेसल पक्ष तहखाने झिल्ली (बाह्य मैट्रिक्स) के साथ निकट संपर्क में है, और इन दो संस्थाओं के बीच बातचीत कसकर माँ के दोनों morphogenesis और स्रावी समारोह को विनियमितRY उपकला 11-13।

इन सभी प्रक्रियाओं को सबसे महत्वपूर्ण hormones14 हैं, जिनमें से विभिन्न पर्यावरण cues, पैराक्राइन कारकों और बाह्य मैट्रिक्स की कार्रवाई पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, प्रोजेस्टेरोन, व्यापक पक्ष शाखाओं में प्रोलैक्टिन (पीआरएल) के साथ संयोजन में, 15 और कि alveologenesis 16,17 लाती को बढ़ावा देता है और alveoli के भेदभाव को बनाए रखता है। स्टेरॉयड और PRL18, साइटोकिन्स और विकास से जुड़े संकेत दे रास्ते के अतिरिक्त (Wnt और रास्ते संकेतन पायदान) भी स्तन वंश प्रतिबद्धता और विकास 19-21 में शामिल कर रहे हैं। गर्भावस्था के अंत में, ल्यूमिनल MECS वायुकोष्ठिका के लुमेन में कोलोस्ट्रम के रूप में जाना जाता है एक प्रोटीन युक्त दूध का उत्पादन करने के लिए शुरू। इसके अलावा, प्रोजेस्टेरोन उपकला पारगम्यता पर कार्य करता है और तंग जंक्शनों अभी भी खुले हैं, के बाद से कोलोस्ट्रम भी मातृ रक्त प्रवाह में पाया जाता है।

प्रसव के बाद, mammarY उपकला (चित्रा 2, स्तन उपकला) लगभग सभी स्तन ग्रंथि की मात्रा के ऊपर लेता है और उच्च का आयोजन किया जाता है। दूध उत्पादक इकाइयों, अर्थात् वायुकोष्ठिका (चित्रा 2, दंतकोटर), उनके शिखर प्लाज्मा झिल्ली लुमेन परिसीमन के साथ, ध्रुवीकृत स्तन उपकला स्रावी कोशिकाओं (MESCs) की एक monolayer से बनते हैं। वायुकोष्ठिका बाहर परिवेश (चित्रा 2, पालि) को दूध नाली कि नलिकाओं से जुड़ा खण्डों में बांटा जाता है कि lobules में खुद की व्यवस्था। स्तनपान, तब होता है अर्थात्।, MESCs मुख्य रूप से अपरा हार्मोन में गिरावट (मुख्य रूप से प्रोजेस्टेरोन) (चित्रा 1 बी, स्तनपान) से शुरू हो रहा दूध का प्रचुर मात्रा में है, स्रावित करने के लिए शुरू करते हैं। दूध प्रोटीन जीन मुख्यत: दूध पिलाती के समय में जारी की पिट्यूटरी पीआरएल के जवाब में, गर्भावस्था से स्तनपान 9,22,23 को लेकर एक परिभाषित अस्थायी समय के पाठ्यक्रम में सक्रिय हैं। समन्वित रूप से, MESCs और दोनों बाह्य मैट्रिक्स के बीच संपर्कों को दूध प्रोटीन SYNT को प्रोत्साहितसेलुलर integrins और laminin 24,25 के बीच बातचीत के माध्यम से मध्यस्थता, और MESCs 26,27 में apoptosis को दबाने कर रहे हैं कि संकेतों के माध्यम से hesis। ये संकेत दे रास्ते विशिष्ट प्रतिलेखन की सक्रियता के 29 कारकों के माध्यम से दूध प्रोटीन जीन प्रमोटरों 28 के सक्रियण में परिणाम। सेल सेल संपर्क भी शिखर ध्रुवता की स्थापना और दूध उत्पादों की vectorial स्राव सहित भेदभाव के कुछ पहलुओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। स्तनपान और MESCs की शुरुआत के बाद तेजी से करीब तंग जंक्शनों पतले नवजात शिशुओं के पोषण आवश्यकताओं के जवाब में, खून के साथ-साथ दूध घटकों के संश्लेषण, परिवहन और स्राव से अणुओं की तेज आर्केस्ट्रा। दूध पिलाती के समय, वायुकोष्ठिका आसपास के myoepithelial कोशिकाओं का संकुचन ऑक्सीटोसिन के जवाब में होता है और नलिकाओं के माध्यम से और निप्पल में दूध इंजेक्शन की ओर जाता है। दूध प्रोटीन होता है कि एक जटिल तरल पदार्थ (ज्यादातर हैCASEINS), शर्करा (मुख्य रूप से लैक्टोज), इस तरह इम्युनोग्लोबुलिन ए (IgA), वृद्धि कारक है और हार्मोन के रूप में लिपिड और खनिज, साथ ही बायोएक्टिव अणुओं। CASEINS, अर्थात् स्रावी मार्ग के साथ जाया मिसेलस, कैसिइन, supramolecular संरचनाओं में इकट्ठे हुए, संश्लेषित, और फिर एक्सोसाइटोसिस द्वारा जारी किया जाता है, यानी mESC के शिखर प्लाज्मा झिल्ली के साथ कैसिइन युक्त स्रावी vesicles के संलयन (SVs) (चित्रा 2)।

इंट्रासेल्युलर यातायात झिल्लीदार डिब्बों के बीच सामग्री का आदान-प्रदान पर निर्भर करता है और शामिल घुलनशील एन ethylmaleimide-सेंसिटिव फ्यूजन (NSF) के अनुलग्नक प्रोटीन (स्नैप) रिसेप्टर (जाल) 30,31। जाल प्रोटीन परिवार लक्ष्य झिल्ली पर स्थानीय vesicular पुटिका झिल्ली में मौजूद फन्दे (वि फन्दे), और लक्ष्य फन्दे (टी फन्दे), में विभाजित है। उनकी कुंडलित-तार डोमेन के माध्यम से zipping करके, वी और टी फन्दे एक अत्यधिक स्थिर चार-हेलिक्स बंडल जटिल प्रपत्र को इकट्ठा करने के लिए भेजा वें के रूप मेंई जाल जटिल। इस परिसर में धीरे-धीरे करीब निकटता 30,32 में उन्हें लाकर दो परस्पर विरोधी लिपिड bilayers के विलय को बढ़ावा देता है। बाद में, जाल परिसरों NSF एडेनोसाइन triphosphatase से अलग कर रहे हैं और इसके एडाप्टर प्रोटीन स्नैप और जाल प्रोटीन मूल 33 के अपने डिब्बे में वापस साफ कर रहे हैं। दिलचस्प है, प्रत्येक जाल प्रोटीन मुख्य रूप से इंट्रासेल्युलर संलयन की घटनाओं में 34 की विशिष्टता के लिए योगदान कर सकते हैं अलग सेलुलर डिब्बों और जाल बाँधना में रहता है। पिछले अध्ययनों में कम से कम प्रोटीन 23 (SNAP23) और पुटिका-एसोसिएटेड झिल्ली प्रोटीन 8 (VAMP8), और syntaxins (STX) Synaptosomal जुड़े सुझाव है कि -7 और -12 कैसिइन एक्सोसाइटोसिस 35,36 में एक भूमिका निभाते हैं। ये प्रोटीन भी दूध के लिपिड अंश, यानी, दूध में वसा ग्लोबुलेस (Mfgs) 37 के साथ सहयोग में पाया गया है। वर्तमान प्रचलित मॉडल साइटोप्लास्मिक लिपिड बूंदों (CLDs) तटस्थ एल के संचय से बनते हैं तत्वों किipids (मुख्य रूप से triacylglycerols और स्टेरोल एस्टर) और जालिका (ईआर) झिल्ली 38-41 के दो पत्रक के बीच मातृ आहार से निकाली गई कोलेस्ट्रॉल। बड़े CLDs mESC शिखर प्लाज्मा झिल्ली द्वारा enwrapped जा रहा है, नवोदित द्वारा वे mfgs के रूप में जारी किया जाता है, जहां MESCs के शिखर की ओर (व्यास में 1-10 माइक्रोन) के लिए ले जाया जा रहा है, जबकि छोटे CLDs के विलय से, कम से कम हिस्से में गठन कर रहे हैं 40-42। पिल्ले दूध छुड़ाने और MESCs उत्तरोत्तर वापस एक युवावस्था राज्य (चित्रा 1 बी, पेचीदगी) को स्तन के ऊतकों के प्रतिगमन के लिए अग्रणी, एपोप्टोसिस से मर रहे हैं के बाद स्तनपान रहता है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) अनुसंधान के क्षेत्र में और नैदानिक ​​निदान में दोनों, जीव विज्ञान के लगभग सभी पहलुओं में इस्तेमाल एक आम विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला विधि है। तकनीक ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है, तो (इम्युनोहिस्टोकैमिस्ट्री, आईएचसी) या सेल (immunocytochemistry, आईसीसी) नमूने हैं। इस शक्तिशाली दृष्टिकोण fluorescent- के उपयोग पर निर्भर करता हैविशेष रूप से इस प्रकार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से अपने ऊतक वितरण के दृश्य की अनुमति, ब्याज की प्रतिजन के लिए (प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से) कि बाँध लेबल एंटीबॉडी। प्रतिदीप्ति संकेतों ज्यादातर नमूना की गुणवत्ता और एकाग्रता एंटीबॉडी की और समुचित से निपटने पर निर्भर करते हैं। एक साधारण अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईआईएफ) प्रोटोकॉल दूध उत्पादों (CASEINS और Mfgs) और दूध उत्पाद स्राव में शामिल प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रस्तुत किया है माउस स्तन के ऊतकों (चित्रा 3) के जमे हुए वर्गों पर (butyrophilin (BTN1), प्रोटीन फंदे)। इस प्रोटोकॉल ऊतक संग्रह से छवि के बाद इलाज, महत्वपूर्ण और वैकल्पिक कदम के रूप में अच्छी तरह के रूप में कुछ तकनीकी सिफारिशों को लेकर एक पूरी आईएचसी सिंहावलोकन प्रदान करता है, वहीं यह भी प्रस्तुत किया और चर्चा कर रहे हैं।

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Protocol

CD1 चूहों INRA (UE0907 IERP, जूई-en-Josas, फ्रांस) में पैदा किया गया। जानवरों की देखभाल के सभी नैतिक पहलुओं कृषि के फ्रेंच मंत्रालय द्वारा निर्धारित प्रासंगिक दिशा निर्देशों और लाइसेंस आवश्यकताओं के साथ पालन किया। इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं (Comethea जूई-en-Josas / AgroParisTech से समझौता 12/097) स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. स्तन ग्रंथि नमूना तैयार

  1. माउस स्तन ग्रंथि विच्छेदन
    1. ग्रीवा अव्यवस्था से स्तनपान के 10 दिन में चूहों euthanize और उसके पेट का सामना करना पड़ के साथ नीचे पशु पिन।
    2. इथेनॉल के साथ उदर क्षेत्र गीला और एक कागज तौलिया के साथ सूखी।
    3. संदंश का प्रयोग, दो पिछले पैरों के बीच पेट की त्वचा को खींच और तेज कैंची के साथ के बारे में 1 सेमी की (केवल त्वचा के माध्यम से) एक चीरा बनाते हैं। यह पहली चीरा से शुरू, तो माउस पर गर्दन को त्वचा में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें। पेरिटोनियम और गड़बड़ी से त्वचा दूर खींचn एक समय में त्वचा के नीचे एक तरफ, यह सिखाया खींच।
    4. पेट और एक झाड़ू के साथ त्वचा से उन्हें दूर धक्का और अंत में खींच या दूर पेरिटोनियम से उन्हें काटने से वंक्षण स्तन ग्रंथियों लीजिए।
      नोट: इस चरण में कारमाइन धुंधला पूरे ग्रंथि 43 के भीतर स्तन उपकला कल्पना करने के क्रम में किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण विभिन्न स्थितियों (शारीरिक विकास के चरणों, रोग, इन विवो उपचार) के तहत स्तन ग्रंथि के वैश्विक आकृति विज्ञान का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
    5. पेट के जंक्शन और वंक्षण ग्रंथियों 44 पर स्थित लिम्फ नोड निकालें।
  2. स्तन ऊतक निर्धारण
    1. जितना संभव हो उतना दूध हटाने के क्रम में (पीबीएस) समाधान, 7.4 पीएच, एक फॉस्फेट बफर खारा में इन टुकड़ों कुल्ला तुरंत एक छुरी के साथ 3 मिमी 3 टुकड़ों में स्तन ऊतक में कटौती और।
    2. जल्दी से एक कागज पर टुकड़े सूखीतौलिया और बर्फ पर 10 से 15 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए, HCHO, 32% formaldehyde समाधान, सावधानी) युक्त एक ठंड पीबीएस समाधान में डाल दिया।
      नोट: यह IIF36 द्वारा और / या स्वस्थानी संकरण 45 में स्तन के ऊतकों स्लाइस पर बाद के विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त समय है। एल्डिहाइड fixatives ऊतक टुकड़े में नहीं बल्कि धीरे-धीरे घुसना के रूप में हालांकि, (~ प्रति घंटे 1-3 मिमी), इस समय के ऊतकों के नमूने की एक इष्टतम निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, एक लगानेवाला समाधान (वर्तमान अध्ययन में विस्तृत नहीं) के साथ एक anesthetized पशु perfusing द्वारा विवो में ऊतकों को ठीक।
  3. सुक्रोज अर्क
    1. जल्दी ठंड पीबीएस में स्तन टुकड़े कुल्ला और कोमल झटकों के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटा से 48 के लिए 40% सुक्रोज (डी-शर्करा, C12H22O11, श्री 342.3 छ / मोल) युक्त एक ठंड पीबीएस समाधान में उन्हें विसर्जित कर दिया।
  4. ऊतक एम्बेडिंग
    नोट: इस चरण में, स्तन टुकड़े छोटे टुकड़ों (2-3 मिमी 3 बनाने के क्रम में फिर से कटौती की जा सकती है) या उनके आकार को समायोजित करने के लिए।
    1. ठीक ढंग से प्लास्टिक molds लेबल और आरटी पर बनाए रखा अक्टूबर यौगिक के साथ मिट्टी, की मात्रा का एक तिहाई भरें। ढालना प्रति स्तन के ऊतकों में से एक टुकड़ा (2-3 मिमी 3) प्लेस और अक्टूबर यौगिक के साथ कवर।
    2. (एल्यूमीनियम या एक धातु चलनी का उपयोग करने का एक पत्रक पर) तरल नाइट्रोजन की सतह पर नए साँचे रखें और उत्पाद फ्रीज करने के लिए अनुमति देते हैं।
      नोट: यह तरल नाइट्रोजन में ढालना डुबो से पहले ठोस और सफेद हो जाना चाहिए।
  5. ऊतक वर्गों प्रदर्शन कर रहे हैं जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए नमूनों की दुकान।

2. जमे हुए ऊतक सेक्शनिंग

नोट: अनिवार्य रूप से एक फ्रीजर के अंदर एक microtome है जो एक cryostat, जमे हुए ऊतक वर्गों बनाने के लिए आवश्यक है। एक कम तापमान अक्सर ऐसे कुंवारी स्तन ग्रंथि के रूप में वसा या लिपिड युक्त ऊतकों के लिए आवश्यक है।

  1. डिग्री सेल्सियस -26 को cryostat के तापमान को समायोजित करें और यह stabi है जब तक इंतजारlized। पूरे सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान -26 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए ऊतक ब्लॉक बनाए रखें। बिल्कुल प्रक्रिया के दौरान किसी भी समय ऊतक विगलन से बचें।
  2. कम से कम 10 मिनट के लिए cryostat में उन्हें रखने के द्वारा डिग्री सेल्सियस -26 को धार, काटने का समर्थन, विरोधी रोल डिवाइस और ब्रश कूल। वर्गों को भी बना रहे हैं के रूप में गिलास स्लाइड स्टोर करने में सक्षम होने के लिए आदेश में cryostat के अंदर एक स्लाइड बॉक्स जगह है।
  3. ठीक से आरटी पर उन्हें ऊतक वर्गों को इकट्ठा करने और बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि गिलास स्लाइड लेबल; अन्यथा ऊतक वर्गों उन्हें का पालन नहीं करेंगे। Cryostat अंदर मोल्ड से नमूना निकालें।
    नोट: का उपयोग सकारात्मक आरोप लगाया गिलास स्लाइड बहुत कारण उच्च electrostatic आकर्षण करने के लिए नए सिरे से जमे हुए ऊतक वर्गों के आसंजन के पक्ष में होगा।
  4. (आरटी पर बनाए रखा) अक्टूबर यौगिक के साथ एक धातु ऊतक डिस्क की सतह को कवर और इसे पर जमे हुए नमूना धक्का। गीला cryostat अंदर माउंट प्लेस और यह सह चलोकम से कम 15 मिनट के लिए राजभाषा।
  5. Cryostat की डिस्क धारक में गीला माउंट रखें। यदि संभव हो तो, एक नया तेज ब्लेड का उपयोग करें या कम से कम प्रत्येक नमूना के बाद से कुछ ऊतकों जल्दी से सुस्त यह कटौती करने के लिए इस्तेमाल ब्लेड पर क्षेत्र बदलने के लिए, 5-6 माइक्रोन तक कटौती मोटाई समायोजित करें और।
  6. स्लाइस समान रूप से और सही ढंग से बनते हैं जब तक बढ़ते मध्यम की कटौती करने से धार खत्म विरोधी रोल डिवाइस की स्थिति को समायोजित करें। आदर्श रूप में, विरोधी रोल डिवाइस के बारे में 1 मिमी से धार पर कदम होगा।
  7. सेटिंग्स सही हैं एक बार, एक निरंतर एक समान गति में पहिया बदल कर ऊतक वर्गों प्रदर्शन करते हैं। तापमान आदर्श है, जब तक कि एक ऊतक अनुभाग, स्वभाव से, कर्ल करने की कोशिश करेंगे।
    1. ले लो और कांच की स्लाइड पर वांछित के रूप में यह जगह करने के क्रम में मंच के पार अनुभाग पैंतरेबाज़ी करने के लिए एक ब्रश का उपयोग करें। जमे हुए ऊतक ब्लॉक और / या धार पर संभवतः मौजूद रहता है साफ करने के लिए ब्रश का उपयोग करें।
  8. खींचेंउपयोगकर्ता की ओर ऊतक अनुभाग और cryostat मंच पर यह दबाव से बचें। यह मंच पर ऊतक टुकड़ा है और इस तरह गिलास स्लाइड के साथ इसे ठीक होने में असमर्थता के आसंजन को जन्म दे सकता है के रूप cryostat मंच पर ऊतक अनुभाग दबाने से बचें।
  9. खंड के ऊपर पकड़ रहा है और ऊतक अनुभाग को छूने के लिए इसे नीचे angling से, एक गिलास स्लाइड की सतह पर उन्हें उठा द्वारा ऊतक वर्गों एक एक करके निकालते हैं।
    नोट: ऊतक वर्गों जल्दी की वजह से स्थिर आकर्षण करने के लिए गर्म कांच का पालन करें। कई ऊतक वर्गों एक ही स्लाइड पर रखा जाता है, तो उन्हें ओवरलैप करने के लिए और अंतरिक्ष के लिए उन्हें पर्याप्त व्यक्तिगत रूप से एक हाइड्रोफोबिक सर्कल में उन्हें बंद करने के लिए सक्षम होने के लिए नहीं सावधान रहना होगा (धारा 3.1.1 देखें।)।

3. अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. वर्गों का पता लगाने
    1. स्लाइड पर चढ़कर ऊतक के चारों ओर एक हाइड्रोफोबिक चक्र आकर्षित करने के लिए एक हाइड्रोफोबिक बाधा कलम का प्रयोग करें। आरटी पर लगभग 1 मिनट के लिए सर्कल शुष्क करते हैं। टी के चारों ओर एक लाइन ड्राइस मुद्दे को ठीक एक काला स्थायी मार्कर के साथ वर्गों के रूप में अच्छी तरह से है, लेकिन पर ऊतक वर्गों रहे हैं, जहां एक के विपरीत गिलास स्लाइड की ओर।
      नोट: इस चक्र पानी से बचाने वाली क्रीम है और acetone- और शराब अघुलनशील। इसलिए यह आईएचसी प्रक्रिया के दौरान इस्तेमाल किया जलीय समाधान के लिए एक बाधा प्रदान करता है और आवश्यक अभिकर्मकों की मात्रा कम कर देता है।
    2. आरटी पर कुछ मिनट के लिए ~ की एक बूंद के साथ पीबीएस के 250 μl उन्हें कवर द्वारा ऊतक वर्गों rehydrate। ~ के साथ 10 से 15 मिनट के लिए पीबीएस में एक नया तैयार 3% पीएफए ​​समाधान के 250 μl उन्हें कवर द्वारा ऊतक वर्गों को ठीक करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से इस मामले में, एक एल्डिहाइड शमन समाधान का उपयोग (50 मिमी अमोनियम क्लोराइड (एनएच 4 सीएल, श्री पीबीएस में 53.5 ग्राम / मोल) या 0.1M ग्लाइसिन (सी 2 एच 5 सं 2, श्री 75.07 ग्राम / मोल) पीबीएस में ) निर्धारण प्रतिक्रिया को रोकने के। सरल और प्रचुर मात्रा में पीबीएस धोने unreacted एल्डिहाइड दूर करने के लिए पर्याप्त है।
  2. प्रतिजन पुनर्प्राप्ति (वैकल्पिक)
  3. एक बीकर में एआर समाधान (100 मिमी Tris (सी 4 एच 11 No 3, श्री 121.14) 5% यूरिया (एनएच 2 CONH 2, श्री 60.06) पीएच 9.6) रखें। एआर समाधान की मात्रा पूरी तरह से एक गिलास धारक में रखा गिलास स्लाइड को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
  4. एक थर्मामीटर के साथ तापमान की निगरानी के द्वारा 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एआर समाधान पहले से गरम और फिर एक उपयुक्त रैक पर गिलास स्लाइड जगह है, गर्म बफर में रैक immerge, कवर वाष्पीकरण की सीमा और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. नहाने के पानी से बीकर निकालें और बफर में एक और 10 मिनट के लिए गिलास स्लाइड छोड़ दें।
  • Immunodetection
    1. पीबीएस (~ 250 μl / अनुभाग) के साथ ऊतक वर्गों कुल्ला और एक समाधान के साथ उन्हें तर3% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए, ~ 250 μl / अनुभाग) आरटी पर कम से कम 30 मिनट के लिए पीबीएस में की।
    2. पीबीएस प्रत्येक ऊतक खंड पर 2% BSA युक्त में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 30-50 μl रखो।
      नोट: यह मात्रा पूरी तरह से ऊतक खंड को शामिल किया गया है कि एक बूंद बनाने के लिए पर्याप्त है।
    3. प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण के प्रदर्शन करने के लिए एक ऊतक खंड पर अकेले मंदक (पीबीएस में 2% बीएसए) का एक ही मात्रा रखें।
      1. व्यवस्थित प्रत्येक आईएचसी प्रयोग में इस नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं और कारण (माध्यमिक एंटीबॉडी और / या ऊतक ऑटो प्रतिदीप्ति के लिए गैर विशिष्ट लेबलिंग) प्रयोग की पृष्ठभूमि का अनुमान किया प्रत्येक माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए प्रदर्शन करते हैं। सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण के अन्य प्रकार के भी (चर्चा देखें) लेबलिंग की विशिष्टता को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर / एक humidified बॉक्स हे में एन गिलास स्लाइड रखें।
      नोट: प्राथमिक इस्तेमाल एंटीबॉडी माउस मोनोक्लोनल विरोधी cytokeratin थे8 (CK8, 1:50 कमजोर पड़ने), माउस मोनोक्लोनल 14 (CK14, 1:50 कमजोर पड़ने) विरोधी cytokeratin, खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी माउस कैसिइन (# 7781, 1:50 कमजोर पड़ने, उदारता एम सी नेविल, कोलोराडो स्वास्थ्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की विज्ञान केंद्र, सीओ, संयुक्त राज्य अमरीका), खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी BTN1 (1: उदारता से आईएच माथर, पशु और पक्षी विज्ञान विभाग, मैरीलैंड विश्वविद्यालय, कॉलेज पार्क, एमडी, संयुक्त राज्य अमरीका), खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी Stx6 (द्वारा प्रदान की 300 कमजोर पड़ने, उदारता एस टूजे, कैंसर रिसर्च यूके, लंदन में अनुसंधान संस्थान, लंदन, ब्रिटेन) और खरगोश पॉलीक्लोनल विरोधी VAMP4 (1:50 कमजोर पड़ने) द्वारा उपलब्ध कराए 1:50 कमजोर पड़ने,।
    5. अच्छी तरह से आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कम से कम चार बार ऊतक वर्गों धो लें।
    6. पीबीएस 2% BSA युक्त में सभी ऊतक वर्गों पर इस समाधान का 30-50 μl जगह है, और 1.5 घंटे के लिए सेते: उचित माध्यमिक एंटीबॉडी (300 कमजोर पड़ने rhodamine संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी (एच + एल), 1) पतला आरटी पर।
      1. Fluorochromes के प्रकाश के प्रति संवेदनशील अणुओं हैं, इसलिए नहीं करतेउनके विश्लेषण जब तक प्रकाश में ऊतक वर्गों का पर्दाफाश। कोशिका झिल्ली कम लेबलिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं कि एक हरे रंग की ऑटो प्रतिदीप्ति उत्पन्न करने के लिए करते हैं के बाद से ऊतक वर्गों पर आईआईएफ के लिए, एक लाल फ्लोरोफोरे के युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के पक्ष में। इसके अलावा, एक लाल fluorophore युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी चुनने तटस्थ लिपिड (देखें नीचे) के सहवर्ती लेबलिंग की अनुमति देता है।
    7. अच्छी तरह से आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ कम से कम चार बार ऊतक वर्गों धो लें।
  • पोस्ट-निर्धारण (वैकल्पिक)
    1. कुछ प्रयोगों के लिए, प्रतिजन / एंटीबॉडी मचानों को स्थिर करने के क्रम में आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में पतला 2% पीएफए ​​के साथ नमूने incubating द्वारा पोस्ट-निर्धारण करते हैं। हालांकि, इस कदम से ज्यादातर मामलों में से तिरस्कृत किया जा सकता है।
  • तटस्थ लिपिड और डीएनए counterstaining
    1. Bodipy 493 के 3 माइक्रोग्राम / एमएल युक्त पीबीएस समाधान के 30-50 μl में ऊतक वर्गों incubating द्वारा CLDs और Mfgs, रंग तटस्थ लिपिड कल्पना करने के लिएआरटी पर 10 मिनट के लिए / 503। तेजी से पीबीएस के साथ दो बार ऊतक वर्गों कुल्ला।
    2. आरटी पर 10 मिनट के लिए DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, 5 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान) के 3 माइक्रोन से युक्त एक पीबीएस समाधान के 30-50 μl के साथ परमाणु डीएनए Counterstain। अवलोकन के लिए स्लाइड बढ़ते से पहले पीबीएस के साथ दो बार ऊतक वर्गों धो लें।
  • धारा बढ़ते
    1. पीबीएस निकालें और प्रत्येक ऊतक खंड पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद जगह है।
    2. हवा के बुलबुले से बचने के लिए, स्लाइड के खिलाफ एक कोण पर कवर पर्ची की एक तरफ की जगह तरल बूंद के बाहरी छोर के साथ संपर्क बनाने और फिर धीरे धीरे कवर कम है। तरल कुछ मिनट के लिए गिलास स्लाइड और कवर पर्ची के बीच फैला है और फिर एक कागज तौलिया के साथ बढ़ते मध्यम से अधिक दूर करने के लिए अनुमति दें।
    3. अवलोकन तक प्रकाश के लिए अपने जोखिम को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नेल पॉलिश और दुकान ऊतक वर्गों के साथ कांच स्लाइड को कवर पर्ची सील।

    • 4. प्रतिदीप्ति अवलोकन और छवि अधिग्रहण

    नोट: छवि अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के द्वारा नियंत्रित एक कैमरा आईएचसी परिणामों का पालन करने की आवश्यकता है के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी।

    1. छवियों को प्राप्त करने से पहले, लेबलिंग की तीव्रता की जांच और नकारात्मक नियंत्रण को देखकर प्रयोग की पृष्ठभूमि का मूल्यांकन। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल (रंग चैनल) की तस्वीरें मोल।
    2. प्रत्येक रंग चैनल के लिए एक ही परिस्थितियों (जोखिम और सामान्य सेटिंग्स) में इसी नियंत्रण के उन सहित सभी चित्रों मोल।
    3. पारंपरिक माइक्रोस्कोपी
      1. 63 (तेल विसर्जन, एनए 1.3) के उद्देश्यों और एक DP50 इमेजिंग कैमरा × करने के लिए 20 ×, मानक fluorescein आइसोथियोसाइनेट के लिए फिल्टर (FITC, हरा), rhodamine (लाल) और DAPI (नीला) के उत्सर्जन से लैस एक माइक्रोस्कोप के साथ epifluorescence माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन करते हैं।
    4. संनाभि माइक्रोस्कोपी
    5. एक माइक्रो साथ confocal माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन63 (तेल विसर्जन, 1.4 एनए) के उद्देश्यों और लेजर की 488- और 568 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य × करने × 20 का उपयोग कर, जेन सॉफ्टवेयर से लैस सामना।

    5. छवि उपचार

    नोट: सभी छवि पोस्ट उपचार ImageJ मुक्त सॉफ्टवेयर (http://imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग किया जाता है।

    1. छवि को मिलाना (विलय)
      1. (फ़ाइल / ओपन) संयुक्त हो जाएगा कि हर चैनल में अधिग्रहण कर लिया छवियों को खोलें। 8-बिट स्केल छवियों के साथ काम करते हैं, तो देखने की मेज (छवि / देखने सारणी) का उपयोग कर प्रत्येक चैनल के लिए कृत्रिम रंग विशेषता।
      2. हर चैनल के लिए एक रंग के हवाले तो (छवि / रंग / चैनल मर्ज) "चैनलों मर्ज" कमांड का उपयोग करके और स्केल या रंगीन छवियों से समग्र तस्वीर उत्पन्न।
      3. (फ़ाइल / ओपन) संयुक्त हो जाएगा कि हर चैनल में अधिग्रहण के ढेर खोलने और और चैनलों मर्ज "आदेश का उपयोग करके छवि एक ही रास्ते में superimposition ढेर प्रदर्शन करना# 8221; हर चैनल के लिए एक रंग विशेषता के लिए (छवि / रंग / चैनल मर्ज)। एक छवि अनुक्रम के रूप में समग्र ढेर बचाने के लिए या एक फिल्म के रूप में (खंड 5.4 देखें)।
    2. छवि ढेर जेड प्रक्षेपण
      1. छवि विमान (जेड अक्ष) के लिए सीधा अक्ष के साथ उन्हें पेश करके एक छवि ढेर के सभी चित्रों के एक दो आयामी दृष्टिकोण प्रदान करने के लिए जेड प्रक्षेपण समारोह (छवि / ढेर / Zproject, मैक्स तीव्रता) का प्रयोग करें। "अधिकतम तीव्रता" विकल्प प्रत्येक पिक्सेल ढेर में सभी चित्र पर अधिकतम मूल्य में शामिल है, जिसमें एक छवि बनाता है। यह एक विशेष चैनल के लिए या कई चैनलों के superimposition के बाद पूरे छवि ढेर के माध्यम से मनाया सब धुंधला के दृश्य की अनुमति एक ही छवि उत्पन्न करता है।
    3. छवि ढेर 3 डी प्रोजेक्शन
      1. एक हवाई जहाज़ पर एक घूर्णन मात्रा के अनुमानों के एक दृश्य उत्पन्न करने के लिए 3 डी प्रोजेक्शन कमान (छवि / ढेर / 3 डी परियोजना, प्रतिभाशाली प्वाइंट, वाई अक्ष) का प्रयोग करें। सु का दृश्य प्रतिपादनrfaces और आंतरिक संरचनाओं दोनों प्रक्षेपण विधि (निकटतम बिंदु, यहां इस्तेमाल किया प्रतिभाशाली बिंदु (), या मतलब मूल्य) पर निर्भर करता है और दृश्य के मापदंडों का चयन किया। एनिमेटेड अनुक्रम में से प्रत्येक फ्रेम एक अलग कोण को देखने से पेश करने का परिणाम है।
      2. तीन orthogonal कुल्हाड़ियों (वाई अक्ष यहां चयनित किया गया था) में से प्रत्येक के चारों ओर बनाया 3 डी छवि घुमाएँ। एक ही छवि या एक फिल्म के रूप में उत्पादित अनुक्रम को बचाओ।
    4. फिल्म रूपांतरण के लिए छवि ढेर
      1. एक छवि ढेर (फाइल / ओपन) खोलें और कमांड "AVI" (फ़ाइल / इस रूप में सहेजें / AVI) का उपयोग करके .AVI प्रारूप में एक फिल्म के रूप में इसे बचाने के लिए।

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    Representative Results

    स्तन ग्रंथि छाती और कृन्तकों में पेट दोनों के उदर संरचना के किनारे स्थित एक चमड़े के नीचे ग्रंथि है। गर्भ के दौरान माउस की ग्रंथियों के पांच जोड़े के स्थान 4 चित्र में दिखाया गया है। स्तन ग्रंथि की आकृति विज्ञान नाटकीय रूप से पूर्ण स्तनपान (चित्रा 1 बी) के लिए तैयार करने के लिए आवश्यक कार्यात्मक संशोधनों को दर्शाती है, अपने विकास के दौरान बदलता है। कुंवारी या बांझ पशुओं में, स्तन ग्रंथि देखने के लिए मुश्किल हो सकता है कि एक पतली फैटी स्ट्रोमा के भीतर एम्बेडेड एक कम branched नलीपरक उपकला के होते हैं। देखते हैं और चित्रा (4) को हटाने के लिए आसान हो गया है कि बड़े स्तन ग्रंथियों में जिसके परिणामस्वरूप गर्भावस्था की शुरुआत, स्तन उपकला proliferates और फैलता है, से। स्तनपान के दौरान, स्तन के ऊतकों गहरा हो जाता है और कारण दूध की उपस्थिति के लिए सफेद दिखाई देता है। केवल पेट और वंक्षण स्तन ग्रंथियों ग्रीवा और वक्ष स्तन Glan क्योंकि एकत्र कर रहे हैंडी एस कम आसानी से मांसपेशियों के साथ उनके निकट सहयोग की वजह से हटाया जाता है। कुछ प्रयोगों के लिए, पिल्ले MESCs 46,47 द्वारा दूध के स्राव को सीमित करने के बलिदान से पहले स्तनपान कराने वाली महिला को 4-6 घंटे से अलग किया जा सकता है।

    स्तन myoepithelial और उपकला कोशिकाओं की पहचान

    वायुकोष्ठिका आसपास के सिकुड़ा myoepithelial कोशिकाओं विशेष रूप से इन प्रकार की कोशिकाओं में से प्रत्येक के द्वारा व्यक्त मार्कर के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी के उपयोग के माध्यम से ल्यूमिनल MESCs से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। स्तन ग्रंथि में इस्तेमाल मौजूदा मार्कर cytokeratins (CKS) कर रहे हैं। CKS उपकला ऊतकों में पाया cytoskeletal मध्यवर्ती तंतु (औसत पर व्यास में 10 नैनोमीटर) बनाने के लिए भाजन कि साइटोप्लास्मिक प्रोटीन का एक बड़ा परिवार है। मध्यवर्ती तंतु अत्यंत स्थिर हैं और सेल वास्तुकला के लिए एक यांत्रिक समर्थन प्रदान करते हैं और सेल सेल आसंजन और बेसल सेल-संयोजी के लिए योगदान करके ऊतकों का आयोजनऊतक बातचीत। उपकला कोशिकाओं द्वारा व्यक्त CKS के सबसेट मुख्य रूप से उपकला के प्रकार, विकास के अपने मंच और उसके भेदभाव की स्थिति पर निर्भर करते हैं। इसके अलावा, यह भी epithelia की घातक समकक्षों के लिए लागू होता है। इस प्रकार, इन मार्करों शारीरिक शर्तों के तहत एक ऊतक में सेल आबादी को चिह्नित करने के लिए सरल और मूल्यवान उपकरण हैं और शल्य विकृति 48 में ट्यूमर निदान और लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

    सामान्य स्तन ग्रंथि में, myoepithelial और ल्यूमिनल MESCs कोशिकाओं CK14 और CK8, के अपने अंतर अभिव्यक्ति क्रमशः (चित्रा 5) के आधार पर प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ये साइटोप्लास्मिक मार्कर पीएफए ​​निर्धारण और एआर के बाद स्तनपान कराने वाली चूहों की स्तन वर्गों में पता चला रहे हैं। छवियाँ एक पारंपरिक epifluorescence खुर्दबीन के साथ हासिल किया गया। CK8 ल्यूमिनल MESCs (चित्रा 5, CK8) की कोशिका द्रव्य भर में वितरित किया गया लगता है। लाल रंग की पृष्ठभूमि का निरीक्षण कि नोटनाभिक की कई परतों (चित्रा 5, -Ig1, नाभिक) प्रदर्शित करता है जो नीले डीएनए लेबलिंग, ने सुझाव दिया है प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5, -Ig1) के लिए डी, ऊतक अनुभाग तह करने के लिए मुख्य कारण है। CK14 विशेष वायुकोष्ठिका (चित्रा 5, CK14) के आधार पर स्थित फ्लैट और लम्बी myoepithelial कोशिकाओं में मनाया जाता है। इन सिकुड़ा कोशिकाओं (49 में चित्रा 4 देखें) में वर्तमान - (एसएमए एक) myoepithelial कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एक अन्य आम तरीका अल्फा चिकनी पेशी actin का पता लगाने के लिए है।

    माउस दूध उत्पादों की जांच

    प्रसव के बाद पूरी तरह से विभेदित MESCs दूध का प्रचुर मात्रा में उत्पादन शुरू करते हैं। दूध घटक अलग रास्ते 40,50 द्वारा स्रावित होते हैं। लिपिड शिखर पी एल की नवोदित द्वारा mfgs के रूप में जारी किया जाता है, जबकि कैसिइन मिसेलस, गॉल्जी व्युत्पन्न SVs की एक्सोसाइटोसिस द्वारा स्रावित होते हैंMESCs की Asma झिल्ली (चित्रा 2, स्तन उपकला स्रावी सेल)। कुछ प्रयोगों के लिए, पिल्ले दूध स्राव 46,47 को धीमा करने के क्रम में, स्तन ग्रंथियों इकट्ठा करने से पहले महिला 4-6 घंटे से अलग हो रहे हैं। इन शर्तों के तहत, MESCs के शिखर प्लाज्मा झिल्ली और लुमेन की सामग्री को आसानी से वायुकोष्ठिका अनुबंधित कर रहे हैं और लुमेन बंद हो जाती हैं, क्योंकि दूध पिलाती दौरान जो मामला नहीं है, देखा जा सकता है। इस तरह के फन्दे के रूप में झिल्ली की तस्करी में शामिल प्रोटीन का अध्ययन कर इसके अलावा, जब स्राव नीचे धीमा भी आवश्यक है। दरअसल, दाता और स्वीकर्ता डिब्बों और उनके subcellular स्थानीयकरण के बीच चक्र झिल्ली कारोबार उच्च है जब लेबलिंग अक्सर दूर तक फैला हुआ है के बाद से यानी।, दूध पिलाती दौरान तय कर पाना मुश्किल है फन्दे। इसलिए, पिल्ले को हटाने के द्वारा दूध स्राव धीरे चल रही टी और वी के फन्दे अधिमान्यतया दाता में रहते हैं जब फन्दे के intracellular स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए उचित शर्तों प्रदान करता हैऔर स्वीकर्ता डिब्बे में क्रमश: (देखें नीचे)।

    चित्रा 6 पिल्ले की उपस्थिति में स्तनपान के 10 दिन में स्तनपान कराने वाली माउस स्तन ग्रंथि में CASEINS का स्थानीयकरण, (6 चित्रा, + P) या अनुपस्थिति में (6 चित्रा, पी) से पता चलता है। ऊतक वर्गों पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी (सही पर तीन स्तंभों) और confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6, बाएँ स्तंभ) द्वारा दोनों मनाया गया। दूध पिलाती के दौरान, CASEINS ज्यादातर शिखर क्षेत्र में (6 चित्रा, + P, तीर) संचित हो दिखाई देते हैं। Confocal माइक्रोस्कोपी, CASEINS पिल्ले की उपस्थिति में MESCs के बेसल पक्ष में है, हालांकि एक हद तक कम करने में भी (चित्रा 6, + P, तीर) मौजूद हैं, स्पष्ट रूप से पारंपरिक माइक्रोस्कोपी (चित्रा 6, CASEINS में देखा नहीं जा सकता है, जो पता चलता है कि तुलना) को छोड़ दिया और सही पैनल। दरअसल, व्यापक क्षेत्र epifluorescence में, प्रतिदीप्ति नमूना (पृष्ठभूमि fluorescen द्वारा उत्सर्जितसीई) उत्साहित मात्रा के माध्यम से गुजरता है और (बाहर का ध्यान केंद्रित प्रतिदीप्ति) उद्देश्य फोकल हवाई जहाज़ में मनाया वस्तुओं का संकल्प बदल। इस मोटी नमूनों (मोटा से कम 2 माइक्रोन) के लिए विशेष रूप से सच है। क्षेत्र की गहराई से नियंत्रित किया जा सकता है और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति फोकल हवाई जहाज़ से बाहर रखा के रूप में confocal माइक्रोस्कोपी, epifluorescence के लिए तैयार नमूनों से उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, पिल्ले (चित्रा 6, + P) की उपस्थिति में, वायुकोष्ठिका के लुमेन काफी बंद हो जाती हैं और MESCs के शिखर की ओर से जब लुमेन पिल्ले (चित्रा 6, पी) के अभाव में बेहतर मनाया जाता है वायुकोष्ठिका कारण दूध उत्पादों के संचय के लिए फैली हुई है। दूध स्राव धीमा है, जब CASEINS भी शिखर प्लाज्मा झिल्ली (चित्रा 6, पी, तीर) के नीचे जमा हुए दिखाई देते हैं, और स्पष्ट रूप से MESCs (चित्रा 6, पी, तीर) के बेसल पक्ष में मनाया जाता है। प्राथमिक antib बिना नकारात्मक नियंत्रणODY किसी लेबलिंग (चित्रा 6, -Ig1) नहीं दिखा था।

    दूध उत्पादों को आसानी से CASEINS और CLDs और Mfgs (चित्रा 7) के तटस्थ लिपिड counterstaining के लिए आईएचसी के संयोजन से पता चला सह जा सकता है। ऊतक वर्गों प्रत्येक के लिए जेड अनुमानों या 3 डी अनुमानों के उत्पादन के लिए ImageJ के साथ के बाद इलाज किया गया, जो confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा जेड के ढेर, (7 चित्रा, CASEINS, लिपिड) या सभी रंग चैनल (चित्रा 7, विलय) के रूप में imaged थे। उत्पादित छवि दृश्यों एकल छवियों (आंकड़े 7 और 8) या फिल्में (पूरक फिल्म देखने के लिए) के रूप में सहेजा गया है।

    कुछ लेबलिंग उनके बेसल पक्ष पर मनाया गया था, हालांकि महिलाओं में पहले पिल्ले (चित्रा 6, + P) से अलग नहीं कर रहे थे जब पहले से ही वर्णित है, CASEINS ज्यादातर MESCs के शिखर की ओर (चित्रा 7, + P) पर जमा हुए थे। CLDs भी मुख्य रूप से बड़ा रहस्य है, जबकि MESCs के शिखर क्षेत्र में स्थानीय कर रहे हैंएड Mfgs वायुकोष्ठिका के लुमेन में मौजूद हैं। (चित्रा 7 + P और -p तुलना) CASEINS और Mfgs आसानी से पिल्ले के अभाव में वायुकोष्ठिका के लुमेन में कल्पना कर रहे हैं कि ध्यान दें। CASEINS दो रंग चैनलों के superimposition (चित्रा 7 चित्रों विलय) पीले लेबलिंग का उत्पादन नहीं करता क्योंकि इन स्थितियों में से किसी में CLDs या Mfgs साथ-स्थानीय बनाना सह नहीं है। हालांकि, छवि ढेर के बाद उपचार CASEINS ये प्रोटीन (तस्वीरें विलय, चित्रा 7) Mfg के साथ बातचीत कर सकते हैं, सुझाव है कि वायुकोष्ठिका के लुमेन में स्रावित Mfgs है कि चारों ओर दिखा। (प्रत्येक रंग चैनल के लिए Zproj और 3 डी proj तुलना, चित्रा 7) का इस्तेमाल किया प्रत्येक के बाद इलाज के द्वारा उत्पादित छवियों के अंतर पर ध्यान दें।

    Butyrophilin की जांच, mfgs के एक प्रोटीन मार्कर।

    BTN1 दूध 51 में mfgs के साथ जुड़े प्रमुख प्रोटीन में से एक है। इस transmembrane प्रोटीन mainl हैY MESCs के शिखर प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीय और फलस्वरूप 52 नवोदित द्वारा अपनी रिहाई के बाद MFG की सतह पर पाया जाता है। एक के लिए, स्तनपान का 10 दिन में, BTN1 मुख्य रूप से शिखर प्लाज्मा झिल्ली में स्थानीय है पता चलता है कि 8 चित्रा और हद तक कम करने, MESCs के शिखर क्षेत्र में। BTN1 भी वायुकोष्ठिका के लुमेन के रूप में अच्छी तरह से शिखर CLDs से कुछ के रूप (8 चित्रा, 3 डी proj मर्ज, तीर) में मौजूद mfgs के चारों ओर। (8 चित्रा, 3 डी proj) ऊपर वर्णित के रूप में परिणाम, अधिग्रहीत छवि Z ढेर (8 चित्रा, छवि) से या ImageJ के 3 डी प्रोजेक्शन आदेश के साथ उत्पन्न एक 3 डी दृश्य के रूप में निकाले एक छवि के रूप में दिखाया जाता है। एक ही छवि प्रोटीन के शिखर वितरण, लेकिन स्रावित Mfgs या शिखर CLDs केवल Z ढेर के 3D पुनर्निर्माण के बाद मनाया जाता है साथ BTN1 के स्थानिक संघ का निरीक्षण करने के लिए पर्याप्त हो सकता है कि नोट (8 चित्रा BTN1 छवि की तुलना और 3 डी proj मर्ज pictures)। Z ढेर भी प्रोटीन के वितरण के लिए एक बेहतर स्थानिक दृश्य देने के लिए एक फिल्म के रूप में खंगाला जा सकता है। अकेले BTN1 के लिए अधिग्रहीत छवि Z ढेर (पूरक फिल्में 1 और 3) या दो अन्य रंग चैनलों के साथ आरोपित (विलय, अनुपूरक फिल्में 2 और 4) उदाहरण के रूप में दिखाया गया है। Z ढेर पूरी छवि ढेर के 3 डी प्रोजेक्शन के (पूरक फिल्में 1 और 2) या एक घूर्णन दृश्य के रूप में (वाई अक्ष) ऊपर से नीचे तक छवि से छवि पढ़ा जा सकता है (पूरक फिल्में 3 और 4 )।

    दो जाल प्रोटीन की जांच: Stx6 और VAMP4

    जैसा कि पहले उल्लेख, फन्दे झिल्ली बाध्य प्रोटीन होते हैं कि दाता और स्वीकर्ता झिल्ली के बीच चक्र। यह अध्ययन करते स्तन ग्रंथि इकट्ठा करने से पहले पिल्ले से महिलाओं को अलग करके MESCs के उच्च स्रावी गतिविधि के साथ जुड़े झिल्ली कारोबार धीमा करने के लिए इसलिए बेहतर हैइन प्रोटीनों। Stx6 और VAMP4 दोनों पार गॉल्जी नेटवर्क 53,54 के साथ जुड़े होने के रूप में वर्णित किया गया है। हालांकि, इन जाल प्रोटीन भी ऐसे स्रावी कणिकाओं (Stx6) 55,56 और गॉल्जी उपकरण (VAMP4) 57 के रूप में अन्य सेलुलर डिब्बों के स्तर पर एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। पिछले अध्ययनों जाल प्रोटीन केसीन स्राव 35,36 में एक भूमिका निभा कि सुझाव। स्तनपान के दौरान, Stx6 और VAMP4 MESCs की उप-शिखर क्षेत्र में स्थित हैं। Stx6 गॉल्जी और ट्रांस-गॉल्जी नेटवर्क (9 चित्रा, Stx6) के लिए इसी नाभिक और MECS के शिखर झिल्ली के बीच मनाया, और एक हद तक कम करने के लिए हालांकि, कैसिइन युक्त SVs 36 पर भी मौजूद है। VAMP4 भी MESCs की उप-शिखर क्षेत्र में ही सीमित नहीं है, लेकिन लेबलिंग अधिक कबरा प्रतीत होता है और शिखर प्लाज्मा झिल्ली के नीचे जमा है (9 चित्रा, VAMP4) की वजह से CLDs और कैसिइन-conta दोनों के साथ अपने सहयोग कोining SVs 36। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण किसी भी लेबलिंग को जन्म नहीं दिया।

    चित्र 1
    चित्रा 1. माउस भ्रूण और वयस्क जीवन के दौरान स्तन ग्रंथि विकास। (ए) माउस स्तन ग्रंथियों (गुलाबी) बहिर्जनस्तरीय (हल्का नीला) दूध लाइनों से भ्रूण दिन 10 (E10) के आसपास विकसित करने के लिए शुरू करते हैं। E11.5 में placodes स्तन दूध रेखा के साथ संतुलित रूप से फार्म और आसपास mesenchyme (गहरे नीले रंग) गाढ़ा करने के लिए शुरू होता है। placodes E15.5 पर कलियों (E12.5-E14.5) और फार्म का invaginate, स्तन उपकला (गुलाबी), पैदा करना और (वसा पैड की ओर स्तन mesenchyme के माध्यम से धक्का है कि प्राथमिक अंकुर फार्म के लिए हल्के हरे रंग बढ़ाना )। एक खोखले लुमेन रूपों और निपल (बैंगनी) को जन्म देने के लिए खुलता है। E18.5 पर, स्तन उपकला एक rudimenta रूपोंबाहर से जुड़ा RY शाखायुक्त संरचना। मैकमिलन पब्लिशर्स लिमिटेड से अनुमति के द्वारा 6 से अनुकूलित: प्रकृति यौवन के दौरान जेनेटिक्स, कॉपीराइट 2007. (बी) समीक्षा, स्तन उपकला (बैंगनी) एक महत्वपूर्ण वृद्धि चरण (व्यापक बढ़ाव, विभाजन और पार्श्व शाखाओं) में प्रवेश करती है। हमल, व्यापक और तेजी से प्रसार के शुरू होने के साथ ही पक्ष शाखाओं पर पूरी तरह से पूरे स्तन वसा पैड पर हमला है, जो स्तन उपकला, का काफी विस्तार करने के लिए अग्रणी होते हैं। ल्यूमिनल MESCs दूध की बड़ी मात्रा में स्रावित जब स्तन उपकला स्तनपान के दौरान एक अत्यधिक विभेदित कार्यात्मक राज्य पहुंचता है। स्तनपान, स्तन ग्रंथि involutes प्रातः बाद रहता है। MESCs वसा ऊतकों से बदल रहे हैं कि lobulo वायुकोशीय संरचनाओं के लापता होने के लिए अग्रणी, एपोप्टोसिस और phagocytosis से हटा रहे हैं। Http://brisken-lab.epfl.ch/research की योजना एक और अध्याय 2.2 से अनुकूलित। http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/सूचकांक। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 2
    स्तनपान के दौरान स्तन ग्रंथि की चित्रा 2. वास्तुकला। स्तनपान के दौरान पूरी तरह से विकसित की है और अत्यधिक branched उपकला (बैंगनी) स्तन के ऊतकों के विशाल बहुमत के लिए खातों। उपकला ऊतक विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं (फ़ाइब्रोब्लास्ट, adipocytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, रक्त और लसीका वाहिकाओं और तंत्रिका अंत) शामिल है कि एक स्ट्रोमा में एम्बेडेड tubulo वायुकोशीय संरचनाओं द्वारा बनाई है। MESCs पालियों कि फार्म lobules में इकट्ठे कोष्ठकी संरचनाओं या वायुकोष्ठिका, में आयोजित किया जाता है। प्रत्येक दंतकोटर इस प्रकार दूध घ करने की अनुमति, lobular और अंतर्खण्डात्मक चैनलों की एक अत्यधिक branched नेटवर्क से जुड़ा है कि एक कार्यात्मक दूध उत्पादक इकाई हैबाहर करने के लिए बारिश। प्रत्येक दंतकोटर ध्रुवीकृत MESCs की एक monolayer द्वारा सीमांकित है, जो के शिखर की ओर एक केंद्रीय लुमेन सीमाओं। MESCs के बेसल पक्ष एक बाह्य मैट्रिक्स और सिकुड़ा myoepithelial कोशिकाओं के साथ निकट संपर्क में है। दूध उत्पादों MESCs के शिखर की ओर से जारी किया जाता है। लिपिड MESCs के शिखर प्लाज्मा झिल्ली की नवोदित द्वारा दूध में वसा ग्लोबुलेस (Mfgs) के रूप में जारी किया जाता है, जबकि मेजर दूध (CASEINS), गॉल्जी व्युत्पन्न स्रावी पुटिकाओं (SVs) की एक्सोसाइटोसिस द्वारा कैसिइन मिसेलस (काला अंक) के रूप में स्रावित होते हैं। CLD: साइटोप्लास्मिक लिपिड छोटी बूंद; ईआर: जालिका; एमईसी: स्तन उपकला कोशिका। अध्याय 2.2 से अनुकूलित। http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/index.html।, अंजीर। 02 www.cellbiol.net/ste/alpHERCEPTIN1.php, अंजीर। 58 में 26-02, और 50 से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    चित्रा 3 बी
    चित्रा 3. प्रायोगिक प्रक्रिया माउस स्तन ग्रंथि के जमे हुए वर्गों पर अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रदर्शन करने के लिए। स्तन ग्रंथि स्तनपान के 10 दिन में एक CD1 महिला माउस से इकट्ठा किया जाता है। स्तन ऊतक अक्टूबर यौगिक में एम्बेडेड और तस्वीर जमी जा रहा से पहले paraformaldehyde के साथ तय की और सुक्रोज में संचार कर रहे हैं कि छोटे टुकड़ों में काट रहा है। स्तन ग्रंथि नमूने तो क्रमश: प्राथमिक और fluorochrome संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ लगातार ऊष्मायन से पतली जमे हुए वर्गों में कटौती और आईआईएफ के लिए कार्रवाई कर रहे हैं। बढ़ते के बाद, नमूने बाद में पद का इलाज किया जा सकता है कि छवियों के अधिग्रहण की अनुमति, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ विश्लेषण कर रहे हैं।/53179/53179fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 4
    । चित्रा माउस स्तन ग्रंथियों के 4. संरचनात्मक स्थान वाम: देर से गर्भ में मंच पर माउस स्तन सिस्टम के उदर देखें। अधिकार: स्थानीयकरण और माउस में देर से गर्भ अवस्था में स्तन ग्रंथि का पहलू। स्तनपान के दौरान, स्तन ग्रंथियों गहरा हो रहे हैं और कारण वायुकोष्ठिका में दूध की उपस्थिति के लिए सफेद दिखाई देते हैं कि ध्यान दें। Http://ctrgenpath.net/static/atlas/mousehistology/Windows/femaleu/mousemammgldiagram.html और http://www.pathbase.net/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html से अनुकूलित। के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

    -together.within-पेज = "हमेशा"> चित्रा 5
    माउस स्तन ग्रंथि में ल्यूमिनल उपकला कोशिकाओं और बेसल myoepithelial कोशिकाओं की चित्रा 5. पहचान। Luminal MESCs और myoepithelial कोशिकाओं सी.के.-8 और सीके -14 की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर, स्तनपान का 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पहचाने जाते हैं , क्रमशः। परमाणु डीएनए DAPI (नीला) के साथ सना हुआ था। छवियाँ एक पारंपरिक epifluorescence खुर्दबीन के साथ हासिल किया गया। समग्र चित्र (विलय) क्रमश: CASEINS (लाल) और नाभिक के लिए (नीला) इसी लेबलिंग के superimposition से पता चलता है। -Ig1, प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण। तारों में lumens संकेत मिलता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    ई 6 "src =" / फ़ाइलें / ftp_upload / 53179 / 53179fig6.jpg "/>
    चित्रा माउस स्तन ग्रंथि में CASEINS 6. सेलुलर स्थानीयकरण। CASEINS स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला रहे हैं। स्तन ग्रंथि उपस्थिति (+ P) में या पिल्ले की अनुपस्थिति (पी) में महिलाओं से एकत्र किया गया था। छवियाँ एक पारंपरिक के साथ अधिग्रहीत (सही पैनल, CASEINS, नाभिक और विलय) थे या एक confocal (CASEINS (लाल), बाएं पैनल) प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी। दोनों स्थितियों में, CASEINS (लाल) शिखर क्षेत्र (तीर) और MESCs (तीर) के बेसल में अधिक या कम में पता चला रहे हैं। प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण किसी भी लेबलिंग (-Ig1) नहीं दिखा है। परमाणु डीएनए DAPI (नीला) के साथ दाग है। समग्र चित्र (विलय) क्रमश: CASEINS (लाल) और नाभिक के लिए (नीला) इसी लेबलिंग के superimposition से पता चलता है। तारों में lumens संकेत मिलता है। स्केल बार epifluorescence छवियों के लिए = 100 माइक्रोन (सही पैनल, CASEINS, नाभिक, विलय) और = 10 &# 181;। Confocal छवियों (बाएं स्तंभ) के लिए मीटर यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्रा 7
    माउस स्तन ग्रंथि में दूध उत्पादों की 7 चित्रा सेलुलर स्थानीयकरण। CASEINS (लाल) उपस्थिति में स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला रहे हैं (+ P) या पिल्ले की अनुपस्थिति (पी) में। तटस्थ लिपिड (CLDs और Mfgs) bodipy 493/503 (हरा) के साथ counterstained कर रहे हैं। समग्र चित्र (मर्ज) दो labelings के superimposition दिखा। छवियाँ एक confocal खुर्दबीन के साथ जेड ढेर के रूप में हासिल किया गया। जेड के ढेर दोनों के लिए प्रत्येक चैनल (विलय) में Z अनुमानों (Zproj) या पूरे ढेर के 3 डी अनुमानों (वाई अक्ष) (3 डी proj) उत्पन्न करने के लिए ImageJ के साथ के बाद इलाज किया गया। तारों में lumens संकेत मिलता है। पैमाने पर पट्टी= 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    आंकड़ा 8
    माउस स्तन ग्रंथि में butyrophilin और लिपिड के 8 चित्रा सेलुलर स्थानीयकरण। BTN1 (लाल) पिल्ले के अभाव में स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला है। तटस्थ लिपिड (CLDs और Mfgs) और परमाणु डीएनए क्रमश: bodipy 493/503 (हरा) और DAPI (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं। छवियों छवि जेड के ढेर के रूप में एक confocal खुर्दबीन के साथ हासिल किया गया। परिणाम छवि ढेर से निकाले एक ही छवि के रूप में दिखाया (छवि, BTN1, लिपिड, नाभिक और विलय) पूरे छवि ढेर के एक 3 डी दृश्य (y अक्ष) उत्पन्न करने के लिए या ImageJ के साथ के बाद इलाज के बाद कर रहे हैं (3 डी proj, BTN1 , लिपिड, नाभिक,) विलय। समग्र चित्र (मर्ज) दिखानेतीन रंग चैनलों के superimposition। -Ig1, प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण। तारों में lumens संकेत मिलता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    9 चित्रा
    चित्रा माउस स्तन ग्रंथि। Syntaxin 6 (Stx6) और VAMP4 (v4) में दो जाल प्रोटीन का 9. सेलुलर स्थानीयकरण स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला रहे हैं। छवियाँ एक पारंपरिक (रूपा) epifluorescence या एक confocal (एल एस एम) माइक्रोस्कोप के साथ हासिल किया गया। समग्र चित्र (मर्ज) प्रत्येक जाल प्रोटीन (लाल) के लिए और क्रमशः DAPI साथ counterstained परमाणु डीएनए (झूठी हरे रंग), के लिए मनाया लेबलिंग के superimposition दिखा। -Ig1, प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना नकारात्मक नियंत्रण। तारांकनएस lumens संकेत मिलता है। स्केल बार कोंफोकल चित्रों के लिए = 10 माइक्रोन और epifluorescence चित्रों के लिए = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    टेबल 1 ए

    टेबल 1 बी

    तालिका 1 Immunohistochemistry समस्या निवारण गाइड।

    चित्र 1
    अनुपूरक फिल्म माउस स्तन ग्रंथि में butyrophilin 1. स्थानीयकरण। BTN1 (लाल) स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला है। छवियाँ एक सह के साथ हासिल किया गया एक Z ढेर के रूप में और nfocal माइक्रोस्कोप एक फिल्म उत्पन्न करने के लिए ImageJ के साथ के बाद इलाज किया। Z ढेर ऊपर से नीचे तक पढ़ा है। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 1
    अनुपूरक फिल्म माउस स्तन ग्रंथि में butyrophilin और तटस्थ लिपिड 2. स्थानीयकरण। BTN1 (लाल) स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला है। तटस्थ लिपिड (CLDs और Mfgs) और परमाणु डीएनए क्रमश: bodipy 493/503 (हरा) और DAPI (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं। छवियों प्रत्येक रंग चैनल के लिए एक Z ढेर के रूप में एक confocal खुर्दबीन के साथ हासिल कर लिया और तीन रंग चैनलों superimposes कि एक समग्र Z ढेर उत्पन्न करने के लिए ImageJ के साथ के बाद इलाज किया गया गया था। जिसके परिणामस्वरूप समग्र Z ढेर ऊपर से नीचे तक पढ़ा जाता है।https://www.jove.com/files/ftp_upload/53179/supvid2.mp4 "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 1
    अनुपूरक फिल्म माउस स्तन ग्रंथि में butyrophilin 3. स्थानीयकरण। BTN1 (लाल) स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला है। छवियाँ एक Z ढेर और बाद में इलाज ImageJ (3 डी प्रोजेक्शन) के साथ BTN1 लेबलिंग के स्थानिक दृश्य एक घूर्णन (वाई अक्ष) उत्पन्न करने के लिए के रूप में एक confocal खुर्दबीन के साथ हासिल किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    चित्र 1
    माउस मा में butyrophilin और तटस्थ लिपिड के पूरक फिल्म 4. स्थानीयकरणmmary ग्रंथि। BTN1 (लाल) स्तनपान के 10 दिन में माउस स्तन ग्रंथि में आईआईएफ से पता चला है। तटस्थ लिपिड (CLDs और Mfgs) और परमाणु डीएनए क्रमश: bodipy 493/503 (हरा) और DAPI (नीला) के साथ counterstained कर रहे हैं। छवियों प्रत्येक रंग चैनल के लिए एक Z ढेर के रूप में एक confocal खुर्दबीन के साथ हासिल कर लिया और तीन रंग चैनलों superimposes कि एक समग्र Z ढेर उत्पन्न करने के लिए ImageJ के साथ के बाद इलाज किया गया गया था। ImageJ (3 डी प्रोजेक्शन) आगे समग्र Z ढेर के स्थानिक दृश्य एक घूर्णन (वाई अक्ष) उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    Discussion

    आईएचसी मुख्य रूप से विशिष्ट मिलान प्रतिरक्षी बातचीत पर निर्भर करता है जो ऊतक वर्गों में प्रतिजन स्थानीयकरण करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और सीधा प्रयोगात्मक विधि है। प्रोटोकॉल की एक बड़ी संख्या आईआईएफ से एक प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए उपयोग किया जाता है, इन प्रक्रियाओं के कोर लगभग हमेशा एक ही है। हालांकि, दृढ़ता से परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं और इसलिए प्रत्येक व्यक्ति आईएचसी अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए कि कुछ महत्वपूर्ण पहलू हैं। इस दृष्टिकोण का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू यानी, सबसे अच्छा प्रयोगात्मक शर्तों का निर्धारण करने के लिए है।, ब्याज की प्रतिजन के लिए एक मजबूत और विशिष्ट संकेत पैदा होते हैं। प्रयोगात्मक डिजाइन और अनुकूलन के लिए विचार किया जाना चाहिए कि चर रहे हैं: प्रतिजन (1) के प्रकार (प्रजातियों, अभिव्यक्ति के स्तर, subcellular स्थान); (2) मिलान प्रकार (अनुक्रम, रचना, ख्यात बाद translational संशोधनों); (3) नमूना तैयार (आयल में या फ्रोजन वर्गों के लिए embedding); (4) निर्धारण मेथआयुध डिपो (छिड़काव या विसर्जन); (5) (formaldehyde, शराब या एसीटोन) का इस्तेमाल किया लगानेवाला; (6) का इस्तेमाल किया अवरुद्ध अभिकर्मक (सामान्य सीरम, बीएसए या गैर वसा वाले दूध); (7) एआर कदम; (8) का पता लगाने विधि (प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से); (8) (मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल) प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रकार; (9) माध्यमिक एंटीबॉडी (प्रजातियों और लेबल); (10) counterstains (परमाणु और / या अन्य सेलुलर डिब्बे लेबलिंग); और (11) बढ़ते मध्यम (विवरण के लिए 1 टेबल देखें)। निर्धारण और अवरुद्ध कदम है, कम से कम, इस तरह की एकाग्रता, पीएच, तापमान, ऊष्मायन समय और मंदक के रूप में अतिरिक्त कारकों के अनुकूलन की आवश्यकता है।

    पहला महत्वपूर्ण पहलू को बारीकी से बदले में परिणामों की गुणवत्ता को प्रभावित करती है जो निर्धारण पद्धति, से जुड़ा हुआ है जो ऊतकों के नमूनों की तैयारी का सवाल है। उदाहरण के लिए, ऊतक टुकड़े तय किया जा सकता है या एम्बेड करने के लिए पहले नहीं। यह कदम भी आयल एम्बेडिंग बनाम यानी चुना एम्बेडिंग विधि, अक्टूबर यौगिक पर निर्भर हो सकता है, जो अपने आप को कभी-कभी इस्तेमाल प्राथमिक एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। ऊतक निर्धारण एक लगानेवाला समाधान के साथ एक anesthetized पशु perfusing द्वारा विवो में प्रदर्शन किया जा सकता है। इस विधि को बरकरार ऊतकों का अध्ययन करते समय एंटीजन को संरक्षित करने के लिए उपयोगी है, लेकिन ब्याज के ऊतकों को ठीक करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। इस मामले में, छोटे ऊतक टुकड़े (कोई मोटा मिमी 10 से अधिक) लगानेवाला समाधान में डूब जा सकता है। जमे हुए ऊतक तरल नाइट्रोजन या isopentane में ऊतक डुबो कर तैयार है, और स्नैप-ठंड किया जा सकता अत्यधिक ऐसे फास्फोरिलीकरण के रूप में बाद translational संशोधनों के बाद पता लगाने के लिए सिफारिश की है। हालांकि, आयल एम्बेडेड ऊतक के विपरीत, ठंड की वजह से subcellular आकृति विज्ञान बदल सकता है कि कोशिकाओं के भीतर बर्फ के क्रिस्टल के गठन के लिए ऊतकों की लंबी अवधि के संरक्षण के लिए पर्याप्त नहीं है। कटौती करने के बाद, जमे हुए ऊतक वर्गों अप करने के लिए एक साल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। किसी भी मामले में, ऊतकों के नमूनों की तैयारी ऊतक के संरक्षण के बीच एक समझौता है/ सेलुलर वास्तुकला और मिलान अखंडता बनाए।

    यह ऊतकों की रासायनिक संरचना को बदल देता है के बाद से, यह (इंटरनेट xation) के तहत अधूरा है और अत्यधिक (overfixation) फाई xation दोनों से बचने के लिए निर्धारण शर्तों का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है।

    दरअसल, underfixation कुछ एंटीजन की प्रोटिओलिटिक गिरावट को बढ़ावा देकर विशिष्ट संकेत कम कर सकते हैं। दूसरी ओर, overfixation मिलान मास्किंग या एक मजबूत गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि उत्पन्न करके विशिष्ट लेबलिंग बदल सकते हैं। इस प्रकार, लगानेवाला समाधान के चुनाव के लिए इसके अलावा, इस तरह के ऊष्मायन समय के रूप में अन्य मानकों, तापमान और पीएच ऊतक निर्धारण को प्रभावित करेगा। पीएफए ​​आईएचसी के लिए सबसे आम उपयोग लगानेवाला है, यह एक "सार्वभौमिक" लगानेवाला के रूप में नहीं माना जा सकता। पीएफए ​​प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड पार लिंक लाती है और इस प्रकार artefactually इसकी सिफारिश रोकने तब मिलान (overfixation) को संशोधित कर सकते हैं औरप्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा gnition। हालांकि, मिलान आगे एआर तकनीक (देखें नीचे) से बेपर्दा हो सकते हैं। यह कोशिका द्रव्य को झिल्ली से कुछ फॉस्फोरिलेटेड प्रोटीन की translocation प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में पीएफए ​​भी, कुछ एंटीजन का पता लगाने के लिए अनुपयुक्त हो सकती है। ऐसे मामलों में, पीएफए ​​जैसे शराब के रूप में उपयुक्त विकल्प fixatives द्वारा प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। वे ऊतकों में पानी के अणुओं की जगह से ऊतक निर्धारण की अनुमति देने के बाद से पीएफए ​​के विपरीत, इस तरह के मेथनॉल या इथेनॉल के रूप में एल्कोहल एपिटोप्स मुखौटा नहीं है। इस प्रोटीन की वर्षा करने के लिए नेतृत्व और उसके बाद की वजह से गठनात्मक परिवर्तन करने के लिए एंटीबॉडी / मिलान बातचीत रोका जा सकता है। यह व्यापक रूप से एल्कोहल घुसना नहीं है और इस प्रकार पीएफए ​​के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऊतक आकारिकी की रक्षा नहीं है कि माना जाता है। एसीटोन unfixed, तस्वीर जमी ऊतक वर्गों के साथ काम करते समय आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है, जो एक और विकल्प लगानेवाला है। हालांकि, एसीटोन एक मजबूत dehydrating एजेंट है और ऊतक प्रोटीन का अपरिवर्तनीय वर्षा हो सकती है।

    कुछ एंटीजन के लिए, एआर के एक अतिरिक्त कदम लगानेवाला गठनात्मक परिवर्तन लाती है या (मिलान की मास्किंग) मिलान की electrostatic प्रभारी बदल, मुख्य रूप से हैं, तो एक अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एआर तरीकों मिलान की immunoreactivity और प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इसके बाद बातचीत बहाल करने के लिए इन प्रक्रियाओं को उल्टा करने के लिए लक्ष्य। एआर तरीकों मुख्य रूप से दो तरीकों पर भरोसा करते हैं: इस तरह के मिलान मुखौटा कि पेप्टाइड्स फोड़ना जो proteinase कश्मीर, trypsin या पेप्सिन, के रूप में एंजाइमों के साथ (1) प्रोटीज प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति, यानी,; और (2) गर्मी प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति, यानी, एक माइक्रोवेव ओवन, प्रेशर कुकर, सब्जी जहाजों, आटोक्लेव या पानी के स्नान का उपयोग कर। यह बाद दृष्टिकोण विशेष रूप से, समय- तापमान-, buffer-, और पीएच के प्रति संवेदनशील है, और इष्टतम स्थितियों अनुभव से (एक उदाहरण प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रदान की जाती है) निर्धारित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, अपने प्रतिजन के लिए एक एंटीबॉडी की आत्मीयता बढ़ाया जा सकता हैपीएच या एंटीबॉडी मंदक के केशन एकाग्रता बदलकर।

    एक permeabilization के कदम कभी कभी विशेष रूप से परमाणु प्रतिजन धुंधला के लिए, मोटी ऊतक वर्गों में एक intracellular मिलान के लिए एक अच्छा संकेत प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इस का उपयोग करके विभिन्न तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: (1) fixatives के रूप में एल्कोहल या एसीटोन; या (2) ऐसे ट्राइटन, एनपी 40 (पीबीएस में 0.1-0.2%, 10 मिनट), digitonin, सैपोनिन या बीच 20 के रूप में डिटर्जेंट पीएफए ​​निर्धारण के बाद (10 से 30 मिनट के लिए 0.2-0.5%)। हालांकि, डिटर्जेंट की पसंद का पता चला मिलान के सेलुलर स्थान पर निर्भर करता है। दरअसल, सेलुलर झिल्ली solubilize जो इस तरह के ट्राइटन X100 के रूप में कठोर डिटर्जेंट, परमाणु मिलान का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन कुछ झिल्लीदार प्रोटीन की निकासी पर परिवर्तन का संकेत हो सकता है। मामूली डिटर्जेंट (सैपोनिन और बीच 20) के उपयोग साइटोप्लास्मिक एपिटोप्स का पता लगाने के लिए अधिक उपयुक्त हैं।

    दूसरा महत्वपूर्ण कदम Blockin हैगैर विशिष्ट धुंधला की छ। अपने लक्ष्य मिलान करने के लिए एक एंटीबॉडी के बंधन intermolecular बलों (जैसे, हाइड्रोफोबिक और आयनिक बातचीत, हाइड्रोजन संबंध) द्वारा संचालित है। इस प्रकार, अपने लक्ष्य एंटीजन के अलावा अन्य प्रोटीन के साथ प्राथमिक और / या माध्यमिक एंटीबॉडी की बातचीत गैर विशिष्ट धुंधला में परिणाम हो सकता है। यह ब्याज की प्रोटीन के दृश्य (कम संकेत / शोर अनुपात) को रोकता है जो उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि, उत्पन्न करता है। अभिकर्मकों अवरूध्द विशिष्ट एंटीबॉडी / मिलान बातचीत आई बिना गैर विशिष्ट बातचीत कम कर देता है। एक सामान्य प्रक्रिया गर्मी निष्क्रिय सामान्य सीरम या बीएसए के साथ ऊतक वर्गों incubating के होते हैं। एक सामान्य सीरम का उपयोग करते समय, यह माध्यमिक एंटीबॉडी के मेजबान जानवर के रूप में एक या एक असंबंधित प्रजातियों से एक ही प्रजाति से होना चाहिए। सभी मामलों में, चयनित अवरुद्ध अभिकर्मक भी प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए मंदक को जोड़ा जाना चाहिए। इसके अलावा, इस तरह के ट्राइटन X-100, टी के रूप में गैर ईओण डिटर्जेंट का उपयोगसमझना 20 या सैपोनिन गैर विशिष्ट बातचीत को कम करने में मदद करता है।

    तीसरे और शायद सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर प्राथमिक एंटीबॉडी चयन और अनुकूलन है। जाहिर है, सबसे अच्छा विकल्प न्यूनतम पार जेट के साथ एक उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आमतौर पर एक ही मिलान के लिए उच्च आत्मीयता और विशिष्टता प्रदर्शन के रूप में, वे उच्च अनुक्रम पहचान के साथ एक प्रोटीन परिवार का एक खास सदस्य भेदभाव करने के लिए सबसे अच्छा साधन है। लक्ष्य मिलान अपने मूल गठनात्मक राज्य खो दिया है, तो या मिलान के लिए उपयोग अन्य प्रोटीन, बाद translational संशोधनों, तापमान, पीएच, निर्धारण और नमक एकाग्रता के साथ बातचीत करने से रोका जाता है, हालांकि, जब एंटीबॉडी / मिलान बातचीत समझौता किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी वे एक ही प्रोटीन की कई एपिटोप्स पहचान के रूप में अधिक उपयुक्त हैं। इसके अलावा, वे अक्सर पीएच और नमक एकाग्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में अधिक स्थिर हैं।के लिए अनुभव से निर्धारित करना है, जो ऊष्मायन समय, मंदक और तापमान, प्रारंभिक अध्ययन उचित ऊष्मायन शर्तों, यानी, काम कमजोर पड़ने (1.7-15 मिलीग्राम / एमएल: 5-25 मिलीग्राम / एमएल, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी) को परिभाषित किया है प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी। इन मानकों कम पृष्ठभूमि शोर के साथ इष्टतम संकेत है कि उत्पादन की स्थिति निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जाना है। लेबलिंग की विशिष्टता (यानी। आर टी बनाम, 4 डिग्री सेल्सियस) कम तापमान पर लंबे समय तक ऊष्मायन बार के पक्ष में है।

    प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से पता लगाने के प्रदर्शन करने के लिए विकल्प अक्सर प्रतिजन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है। उदाहरण के लिए, एक अत्यधिक व्यक्त मिलान बस की वजह से एक माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए संभव गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि से परहेज करते हुए इस प्रकार एक तेज और आसान बहुरंगा धुंधला अनुमति, एक fluorochrome संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ पता लगाया जा सकता है। हालांकि, S MAY एक उच्च कीमत पर एक कम संकेत उत्पन्न करता है प्रत्यक्ष, और कर सकते हैंometimes मुश्किल हो सकता है, जब लेबल एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। उत्पन्न संकेत प्राथमिक एंटीबॉडी (प्रवर्धन) के साथ की वजह से (प्राथमिक एंटीबॉडी मेजबान प्रजातियों के खिलाफ उठाया) में कम से कम दो लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी की बातचीत करने के लिए और अधिक तीव्र है के रूप में इसके विपरीत, आईआईएफ निचले व्यक्त एपिटोप्स का पता लगाने के लिए और अधिक संवेदनशील है। इसके अलावा, विभिन्न fluorophores संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी की एक विस्तृत श्रृंखला अपेक्षाकृत सस्ती, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और गुणवत्ता को नियंत्रित किया। हालांकि, इस दृष्टिकोण पार जेट पैदा कर सकते हैं और इस प्रकार ध्यान से बहु-लेबलिंग प्रयोगों प्रदर्शन जब एक ही प्रजाति में या अलग आइसोटाइप का उत्पादन नहीं कर रहे हैं कि प्राथमिक एंटीबॉडी का चयन करने की आवश्यकता है। आईआईएफ भी कभी कभी अतिरिक्त अवरुद्ध कदम की आवश्यकता है और व्यवस्थित नकारात्मक नियंत्रण (देखें नीचे) को शामिल करना चाहिए। प्रवर्धन आगे मो प्रति बाध्य एक बायोटिन संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करके प्राप्त और fluorescently avidin या streptavidin (चार biotins लेबल किया जा सकताlecule)। फिर भी, इस प्रवर्धन विधि गैर विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए अतिरिक्त कदम की आवश्यकता है और कारण अंतर्जात बायोटिन के उच्च स्तर की उपस्थिति के कुछ ऊतकों (जिगर, गुर्दे, हृदय, मस्तिष्क, फेफड़े और स्तन ग्रंथि स्तनपान कराने वाली) का धुंधला के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता । हालांकि, अंतर्जात बायोटिन avidin के साथ नमूना पूर्व incubating द्वारा और बाद में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन से पहले बायोटिन के साथ अवरुद्ध किया जा सकता है। एक छोटी तरंग दैर्ध्य के प्रकाश से उत्साहित जब प्रकाश का उत्सर्जन के लिए संपत्ति के साथ छोटे रासायनिक अणु होते हैं जो संयुग्मित fluorochromes, की पसंद है, मुख्य रूप से उपलब्ध माइक्रोस्कोप उपकरण के प्रकार पर निर्भर करता है।

    ठीक से इस्तेमाल किया fluorochromes के वर्णक्रम गुणों के बीच एंटीबॉडी और विदेशी के बीच दोनों पार जेट को सीमित करने के लिए बनाया गया है, जब इम्यूनोफ्लोरेसेंस आधारित आईएचसी कई सेलुलर लक्ष्यों का एक साथ दृश्य की अनुमति देता।

    पिछले महत्वपूर्णआईएचसी प्रयोगों के बारे में बिंदु, धुंधला की वैधता का समर्थन करने के लिए प्रयोगात्मक कलाकृतियों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया और परिणाम की सटीक व्याख्या के लिए किया जाना चाहिए कि सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का सवाल है। कुछ ऊतकों परिणामों के एक अशुद्ध अर्थ हो सकता है कि (autofluorescence के रूप में करने के लिए कहा गया है) उच्च फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि दिखा रहे हैं। इस प्रकार, ऊतक वर्गों आईएचसी प्रयोग शुरू करने से पहले दोनों प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी के तहत मनाया जाना है। प्राथमिक एंटीबॉडी को छोड़ देता है कि एक नकारात्मक नियंत्रण व्यवस्थित माध्यमिक एंटीबॉडी के बंधन एक संभावित गैर विशिष्ट अस्पष्ट नहीं नगण्य है और करता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए या विशिष्ट धुंधला पैटर्न के समान करने के लिए प्रत्येक आईएचसी प्रयोग में शामिल किया जाना चाहिए। एक ही निर्धारण के एक गैर प्रतिरक्षा एंटीबॉडी के साथ जगह से एक मोनोक्लोनल प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कार्य करते समय एक निर्धारण नियंत्रण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, IgG1, IgG2a, IgG2B, आईजीएम) ही एकाग्रता में। यह नियंत्रण तों में मदद करता हैनमूने के साथ एंटीबॉडी के संबंधों के कारण हो सकता है जो गैर विशिष्ट धुंधला, timate। 4 डिग्री सेल्सियस पर: (1 दाढ़ अनुपात 10) हे / एन (1) अपनी घुलनशील रोगक्षमजनररोरारतत साथ: अपने प्रतिजन के लिए एक एंटीबॉडी के बंधन विशिष्ट प्रदर्शित करने के लिए, एक अवशोषण नियंत्रण प्राथमिक एंटीबॉडी पूर्व incubating द्वारा दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है ; और (2) कोशिकाओं या ब्याज के मिलान का इजहार लेकिन लगता है कि अध्ययन किया ऊतक से अलग है कि ऊतक वर्गों के साथ (उदाहरण के लिए, 59 में 4B चित्रा देखें)। दोनों ही मामलों में, प्राथमिक एंटीबॉडी के फलस्वरूप कमी कम या कोई धुंधला करने का नेतृत्व करना चाहिए। नियंत्रण का एक अन्य प्रकार, एक अप्रासंगिक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है अर्थात्।, ब्याज की मिलान से अलग है कि एक सेलुलर स्थानीयकरण (साइटोप्लास्मिक बनाम परमाणु) दर्शाती है कि एक मिलान के खिलाफ निर्देशित। अप्रासंगिक एंटीबॉडी ब्याज की प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में ही निर्धारण और प्रजातियों का होना चाहिए। आईएचसी प्रयोगों के लिए अतिरिक्त नियंत्रण Tiss से नमूने के उपयोग में शामिल कर सकते हैंब्याज की मिलान (ट्रांसजेनिक जानवरों) व्यक्त या नहीं (नाक आउट जानवरों) के लिए जाना जाता ues। यह एक उपयोगी संदर्भ उपलब्ध कराने और आईएचसी प्रक्रिया अनुकूलन करने में मदद कर सकते हैं।

    यदि तकनीकों का एक मुख्य सीमा वे केवल दोनों प्रक्रिया संभावित कलाकृतियों उत्प्रेरण, निश्चित (मृत) के लिए आवेदन किया है और / या कोशिकाओं permeabilized किया जा सकता है। इस दृष्टिकोण की अन्य सीमाओं के नमूनों की निगरानी के लिए एक खुर्दबीन के उपयोग के कारण हैं। Epifluorescence और confocal सूक्ष्मदर्शी की ऑप्टिकल संकल्प सीमित है के रूप में सबसे पहले, पता लगाया प्रोटीन का स्थान या सह-स्थान में व्याख्या की ओवर-नहीं होना चाहिए। दूसरे, यानी, photobleaching। प्रकाश के संपर्क में जब समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की लुप्त होती, बारी में, की fluorophore प्रकाश रासायनिक विनाश की ओर ले जाता है, जो प्रतिदीप्ति उत्तेजना पर नमूने में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की पीढ़ी के लिए अनिवार्य रूप से की वजह से है। Photobleaching तक कम किया जा सकता है: एक) से संरक्षित नमूनों में रखते हुएअपने प्रेक्षण तक अगर प्रयोग और भंडारण के दौरान प्रकाश; ख) बढ़ते मध्यम में एक antifade एजेंट (प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों मैला ढोने वालों) का उपयोग; ग) तीव्रता और / या उत्तेजना प्रकाश की अवधि को कम करने; घ) fluorophores की एकाग्रता बढ़ती है या उच्च मात्रा दक्षता के साथ एक fluorochrome के एक कम एकाग्रता का उपयोग; और ई) (यानी। एलेक्सा Fluors, सूअर का बाल Fluors, या DyLightFluors) photobleaching कम होने का खतरा हैं कि मजबूत fluorophores के प्रयोग से। और कम पिरिडीन न्यूक्लियोटाइड (NADH: अवशोषण, 340 एनएम, उत्सर्जन, 460 एनएम) स्तनधारी कोशिकाओं में;: तीसरे, autofluorescence कारण पीला रंग Coenzymes (उत्सर्जन, 515 एनएम अवशोषण, 450 एनएम धुनी और FMN) की उपस्थिति के लिए अक्सर है। इसके अलावा, नमूने ठीक करने के लिए एल्डीहाइड, विशेष रूप से glutaraldehyde, का उपयोग करते हैं, autofluorescence के उच्च स्तर में परिणाम कर सकते हैं। यह और / या जांच और हूँ कि ऑप्टिकल फिल्टर का चयन करके प्रायर एंटीबॉडी ऊष्मायन के लिए पीबीएस में 0.1% सोडियम borohydride के साथ नमूने धोने से कम किया जा सकताautofluorescence के लिए प्रतिदीप्ति संकेत रिश्तेदार aximize। चौथे, प्रतिदीप्ति ओवरलैप वे अक्सर बहुत व्यापक बैंडविड्थ, अलग, विषम वर्णक्रम प्रोफाइल, साथ ही विभिन्न चोटी उत्सर्जन और तरंग दैर्ध्य की संख्या प्रदर्शनी के रूप में होने के कारण fluorophores के उत्सर्जन वर्णक्रम संपत्तियों के लिए मुख्य रूप से है (यह भी खून के माध्यम से, विदेशी या crosstalk कहा जाता है) Maxima। एक और fluorophore के कई fluorophores (बहुरंगा लेबलिंग) के साथ काम कर रहे हैं और चैनल (फिल्टर) में एक fluorophore के उत्सर्जन के द्वारा होती है जब प्रतिदीप्ति ओवरलैप होता है। वे अक्सर विशेष रूप से सह स्थानीयकरण या मात्रात्मक अध्ययन के मामले में, परिणाम है की व्याख्या जटिल रूप में खून के माध्यम से कलाकृतियों को कम से कम किया जाना चाहिए। Fluorophores के उत्सर्जन का संतुलन थोड़ा यदि प्रक्रिया द्वारा ही सुधार किया जा सकता है, खून के माध्यम से मुख्य रूप से ठीक से separ करने के क्रम में एक अनुकूलित प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट और / या फोटोमल्टीप्लायर डिटेक्टर का उपयोग करके छवि अधिग्रहण के समय में कम किया जा सकताfluorophores के वर्णक्रम प्रोफाइल खा लिया। यह एक विशेष पहचान चैनल के लिए प्रत्येक संकेत निर्देशन द्वारा व्यक्तिगत fluorophores के भेदभाव प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रा की अनुमति देता है के रूप में इस संबंध में confocal माइक्रोस्कोपी बहुरंगा इमेजिंग के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। इसके अलावा, confocal माइक्रोस्कोपी लेबलिंग के अनुक्रमिक अधिग्रहण (एक समय में केवल एक fluorophore) के लिए अलग-अलग पता लगाने चैनलों के लिए लाभ, photomultiplier वोल्टेज, या लेजर शक्ति को समायोजित करने की अनुमति देता है। आदर्श रूप में, एकल लेबल नियंत्रण खून के माध्यम से यों और अंततः computationally इसे हटाने के लिए किया जाना चाहिए। माध्यमिक एंटीबॉडी के बिना एक नियंत्रण (पृष्ठभूमि नियंत्रण) संकेत लाभ की सीमा तय करने के लिए तैयार है और इष्टतम छवि अधिग्रहण के लिए प्रत्येक चैनल की भरपाई की जा सकती है। यह भी सही छवि पृष्ठभूमि (autofluorescence) के अधिग्रहण के बाद के प्रसंस्करण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

    अंत में, वर्णित विधि आसान realizati के लिए एक सरल मानक प्रोटोकॉल प्रदान करता हैस्तन ग्रंथि वर्गों पर immunostaining की पर। फिर भी, एक आईएचसी प्रयोग के प्रिंसिपल कदम विशिष्ट धुंधला कल्पना करने के लिए और गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के क्रम में प्रत्येक प्रतिजन / एंटीबॉडी जोड़ी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। वर्णित विधि भी प्राप्त छवियों के अधिकांश के बाद इलाज के लिए कई बुनियादी तरीके शामिल हैं। प्रतिदीप्ति आधारित immunodetection निदान के लिए एक प्रतिजन के सेलुलर स्थानीयकरण से आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ एक शक्तिशाली तरीका है। इन तरीकों में नई प्रगति की छवि के लिए, नई fluorophores, अधिग्रहण उपकरणों और तकनीक माइक्रोस्कोपी के भविष्य के विकास के साथ जैविक ढांचे और प्रक्रियाओं की पहले से अप्रत्यक्ष विवरण हासिल किया जाएगा।

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    Disclosures

    लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।

    Acknowledgments

    लेखकों जानवरों की देखभाल और सुविधाओं के लिए (INRA, UMR1198, जूई-en-Josas) और IERP इकाई के कर्मचारियों के लिए (UE 0907, INRA, जूई-en-Josas) INRA MIMA2 इमेजिंग कोर की सुविधा के लिए आभारी हैं। हम भी बहुत उपयोगी antibodie के साथ हमें प्रदान करने के लिए आईएच माथर, एम सी नेविल और एस टूजे को धन्यवाद देना चाहूंगा।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dissection
    Pins
    Ethanol
    Scissors
    Scalpel and adapted blades
    Ice
    Towel paper
    Tissue sample preparation Company Catalog Number Comments/Description
    Phosphate Buffered Saline (pH7.4) Sigma P-3813
    Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml) Electron Microscopy Sciences 15714-S personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
    OCT compound/Tissue Tek Sakura 4583
    Sucrose (D-saccharose) VWR 27480.294
    Plastic molds Dominique Dutscher 39910
    Liquid nitrogen
    Cryostat/sample support Leica  CM3050S
    Razor blades (SEC35) Thermo Scientific 152200
    Slide box
    Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus Thermo Scientific 10143560W90/1014356190
    Brushes
    IHC Company Catalog Number Comments/Description
    Super Pap Pen Sigma Z377821-1EA
    Permanent marker (black)
    50 mM NH4Cl in PBS Sigma A-0171
    0.1 M glycine in PBS VWR 24403.367
    Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
    Heater (up to 100°C)
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906-100G
    Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI Vector Laboratories H-1000/H-1200
    Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade) VWR CORN2980-225
    Nail polish
    Primary antibodies Company Catalog Number Comments/Description
    Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution) generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences
    Center, USA)
    Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution) Biolegend (Covance) MMS-162P
    Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution) Thermo Scientific MS-115-P0/P1
    Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution) generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
    Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution) generously gifted S. Tooze
    (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
    Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution) Abcam ab3348
    Secondary antibodies Company Catalog Number Comments/Description
    Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-025-003
    Counterstains Company Catalog Number Comments/Description
    Bodipy 493/503 Life Technologies (Molecular Probes) D-3922
    DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) Life Technologies (Molecular Probes) D-1306
    Observation/Image capture Company Catalog Number Comments/Description
    conventional fluorescence microscope Leica Leitz DMRB
    microscope    		 Standard filters for FITC, Rhodamine
    and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
    Laser Scanning Microscope (confocal microscopy) Zeiss LSM
    510 microscope    		 Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
    Image treatment Company Catalog Number Comments/Description
    ImageJ 1.49k software Free software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Honvo-Houéto, E., Truchet, S.… More

    Honvo-Houéto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. J. Vis. Exp. (106), e53179, doi:10.3791/53179 (2015).

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