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Biology

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

doi: 10.3791/53179 Published: December 1, 2015

Summary

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Abstract

A imunofluorescência indirecta é utilizado para detectar e localizar as proteínas de interesse num tecido. O protocolo aqui apresentado descreve um método completo e simples para a detecção imunológica de proteínas, o rato lactantes glândula mamária ser tomado como um exemplo. Um protocolo para a preparação das amostras de tecidos, especialmente em relação a dissecção da glândula mamária do mouse, fixação do tecido e corte de tecido congelado, são detalhados. Um protocolo padrão para executar imunofluorescência indireta, incluindo uma etapa de recuperação antigênica opcional, também é apresentada. A observação de as secções de tecido etiquetados, bem como a aquisição de imagem e os pós-tratamentos também são apresentados. Este procedimento dá uma visão geral completa, desde a coleta de tecido animal para a localização celular de uma proteína. Embora este método geral pode ser aplicada a outras amostras de tecido, deve ser adaptada a cada tecido / anticorpo primário par estudado.

Introduction

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A glândula mamária é um órgão de mamíferos exócrina atípica cuja principal função é produzir leite para alimentar recém-nascidos. O desenvolvimento do tecido mamário ocorre principalmente após o nascimento e é caracterizada por um processo único, em que o epitélio invade o estroma circundante. Este tecido sofre muitas mudanças (crescimento, diferenciação e regressão), especialmente durante a vida adulta, concomitantemente com variações no estado reprodutivo (Figura 1). Além da morfologia geral do tecido, as proporções de tipos de células diferentes, bem como a sua disposição no interior da glândula mamaria mudar dramaticamente durante o desenvolvimento 1-5.

Durante a vida embrionária, o epitélio mamário deriva de linhas de leite mamarias, que é definido por um ligeiro espessamento e estratificação da ectoderme, entre as partes dianteiras e traseiras dos membros de cada lado da linha média por volta do dia embrionário 10,5 (E10.5) (Figura 1A ).Em E11.5, a linha do leite se divide em placodes individuais, que são posicionados simetricamente ao longo da linha de leite mamário em locais reprodutíveis, eo mesênquima circundante começa a condensar. Os placodes começar a afundar-se mais profundamente na derme e no mesênquima mamária organiza em camadas concêntricas ao redor do broto mamário (E12.5-E14.5). Em E15.5, o epitélio mamário, começa a proliferar e alongada para formar o rebento principal que empurra através do mesênquima mamária para a almofada de gordura. O rebento principal desenvolve um lúmen oco com uma abertura para a pele, caracterizado por a formação da bainha de mamilo. Em E18.5, o ducto alongando tem crescido na almofada de gordura e tem ramificações em um pequeno sistema ductal arborized englobadas na almofada de gordura. O desenvolvimento é essencialmente preso e da glândula mamária rudimentar permanece morphogenetically de repouso até a puberdade. No embrião do sexo masculino, a activação de receptores de androgénio conduz à degeneração dos gomos, que desaparecempor E15.5. Em E18, desenvolvimento mamário cessa puberdade até 6-9.

Ao nascer, a glândula mamária abriga um sistema ductal rudimentar que alonga e ramos lentamente (crescimento isométrico). No início da puberdade, as estruturas esféricas localizadas nas pontas dos ductos chamado as papilas extremidade terminal (TEBS), são formadas por uma camada externa de células do tampão e um núcleo interior de várias camadas de células (células do corpo). Estas estruturas são altamente proliferativo e infiltrar o tecido do estroma circundante, em resposta a estímulos hormonais. Proliferação dentro dos resultados TEBS em alongamento ductal, juntamente com ramificação morfogênese. Este processo leva ao estabelecimento de uma rede de base epitelial arborized que emana do bocal (Figura 1B, a puberdade). A ~ 10-12 semanas após o nascimento, quando o epitélio invadiu toda a almofada de gordura, a sua expansão pára e a TEBS desaparecer. Desenvolvimento ductal, em seguida, passa por mudanças dinâmicas, ou seja, successive proliferação e regressão de células epiteliais de acordo com ciclos estrais 10 (Figura 1B, adulto).

Desde o início da gestação, o tecido mamário de crescimento sofre alterações morfológicas e importante para se preparar para a lactação. O epitélio mamário extensivamente proliferam e se diferenciam, levando a uma rede túbulo-alveolar altamente ramificada. Concomitantemente, as células epiteliais mamárias (SAMU) tornam-se polarizado e capaz de sintetizar e secretar produtos lácteos. MECs organizar-se em numerosas estruturas alveolares (acini) que são cercados por células mioepiteliais contráteis e incorporadas em um estroma composto por tecidos conectivos e adiposos, vasos sanguíneos e terminações nervosas (Figura 1B, a gravidez). Além disso, o lado basal de MECs está em estreito contato com a membrana basal (matriz extracelular), e as interações entre estas duas entidades com força regular tanto a função morfogênese e secretora do mammary epitélio 11-13.

Todos estes processos dependem da acção de várias sugestões ambientais, das quais as mais importantes são hormones14, factores parácrinos e a matriz extracelular. Por exemplo, a progesterona induz extensa alveologenesis 15 e que, em combinação com a prolactina (PRL) lateral ramificando-16,17, promove a diferenciação e mantém dos alvéolos. Em adição aos esteróides e PRL18, citoquinas e as vias de sinalização associadas ao desenvolvimento (Wnt e Notch vias de sinalização) também estão envolvidos em compromisso e desenvolvimento mamário linhagem 19-21. No final da gravidez, as MECs luminais começar a produzir um leite rico em proteína conhecida como colostro no lúmen dos alvéolos. Além disso, a progesterona actua sobre a permeabilidade epitelial e uma vez que as junções apertadas são ainda aberta, colostro também é encontrado na corrente sanguínea da mãe.

Após o parto, a Mammary epitélio ocupa quase todo o volume da glândula mamaria e é altamente organizada (Figura 2, epitélio mamário). Unidades de produção de leite, nomeadamente alvéolos (Figura 2, alvéolo), são formadas por uma monocamada de células epiteliais mamarias secretórias polarizados (MESCs), com a sua membrana plasmática apical que delimita o lúmen. Alvéolos organizar-se em lóbulos que são agrupados em lobos ligados a condutas que drenam o leite para o meio exterior (Figura 2, lobo). Lactação ocorre, isto é., MESCs começar a secretar grandes quantidades de leite, provocados principalmente pela queda de hormonas da placenta (principalmente progesterona) (Figura 1B, lactação). Genes de proteínas do leite são activados de um curso de tempo variando temporais definido desde a gravidez até lactação 9,22,23, principalmente em resposta a pituitária PRL libertado no momento da sucção. Concomitantemente, os contactos entre MESCs e da matriz extracelular tanto estimular a proteína do leite synthesis através de sinais que são mediadas através das interacções entre integrinas celulares e laminina 24,25, e suprimir a apoptose em MESCs 26,27. Estas vias de sinalização como resultado a activação de promotores de genes de proteínas do leite 28 através da activação da transcrição de factores específicos 29. Contatos célula-célula também são importantes para alguns aspectos de diferenciação, incluindo o estabelecimento de polaridade apical ea secreção vectorial de produtos lácteos. Tight junctions fechar rapidamente após o início da lactação e MESCs finamente orquestrar a absorção de moléculas a partir do sangue, bem como a síntese, o transporte e a secreção de componentes de leite, em resposta aos requisitos nutricionais dos recém-nascidos. No momento da sucção, a contracção das células mioepiteliais que rodeiam os alvéolos ocorre em resposta à oxitocina e leva a ejecção de leite através das condutas e para dentro do mamilo. O leite é um fluido que contém complexo de proteínas (principalmentecaseínas), açúcares (principalmente lactose), lípidos e minerais, assim como moléculas bioactivas, tais como imunoglobulinas A (IgA), factores de crescimento e hormonas. As caseínas são sintetizados, montados em estruturas supramoleculares, ou seja micelas de caseína, transportados ao longo da via secretora, e, em seguida, libertada por exocitose, isto é, a fusão de vesículas secretoras contendo caseína (SVS) com a membrana plasmática apical de MESC (Figura 2).

Tráfego intracelular depende de trocas materiais entre os compartimentos membranosos e envolve Solúvel N-etilmaleimida Sensitive Fusion (NSF) Protein Anexo (SNAP) Receptor (SNARE) 30,31. A família de proteínas SNARE é subdividida em SNAREs vesiculares (v-SNAREs), presentes na membrana da vesícula, e laços alvo (t-armadilhas), localizadas nas membranas alvo. Ao fechar através dos seus domínios em espiral espiralada, V- e t-SNARE montar para formar um complexo de feixe de quatro hélices altamente estável, referido como thcomplexo e SNARE. Este complexo promove a fusão de duas camadas duplas lipídicas opostos gradualmente trazê-los em estreita proximidade 30,32. Em seguida, os complexos SNARE são dissociados pelo triphosphatase adenosina NSF e suas proteínas SNAP e SNARE proteína adaptador são reciclados de volta ao seu compartimento de origem 33. Interessantemente, cada proteína SNARE reside predominantemente em compartimentos celulares distintas e SNARE emparelhamento pode contribuir para a especificidade de eventos intracelulares de fusão 34. Estudos anteriores sugerem que, pelo menos, Protein 23 (SNAP23) e vesículas com Associated proteína de membrana 8 (VAMP8), e syntaxins (STX) sinaptosomal Associada -7 e -12 desempenhar um papel na caseína exocitose 35,36. Estas proteínas também foram encontrados em associação com a fracção lipídica de leite, isto é, gordura de leite (MFG glóbulos) 37. O modelo predominante atual postula que gotículas lipídicas citoplasmáticas (CLDS) são formados pela acumulação de neutro lIPIDs (principalmente triacilgliceróis e ésteres de esteróis) e colesterol derivado da dieta materna entre os dois folhetos do retículo endoplasmático (ER) da membrana 38-41. Grandes CLD são formados, pelo menos em parte, pela fusão de CLD menor enquanto está a ser transportado para o lado apical de MESCs onde eles são libertados como MFG (1-10 um de diâmetro) por germinação, sendo envolta pela membrana plasmática apical MESC 40-42. Aleitamento cessa após os filhotes são desmamados e os MESCs morrem progressivamente por apoptose, levando à regressão do tecido mamário volta a um estado puberal (Figura 1B, involução).

Imunofluorescência (IF) é um método de laboratório analítico comum usado em quase todos os aspectos da biologia, tanto em pesquisas como em diagnósticos clínicos. SE técnicas podem ser realizadas em secções de tecido (imuno-histoquímica, IHC) ou imunocitoquímica (ICC), amostras de células. Esta poderosa abordagem baseia-se na utilização de fluorescent-anticorpos marcados que se ligam especificamente (directa ou indirectamente) para o antigénio de interesse, permitindo assim a visualização da sua distribuição nos tecidos através de microscopia de fluorescência. Principalmente sinais de fluorescência dependem da qualidade e concentração dos anticorpos e tratamento adequado da amostra. Um protocolo simples de imunofluorescência indirecta (IIF) é apresentada para detectar produtos de leite (caseínas e MFG) e proteínas envolvidas na secreção do produto de leite (butyrophilin (btn1), proteínas SNARE) em secções congeladas de tecido mamário de ratinho (Figura 3). Embora este protocolo fornece uma visão completa IHC, que vão desde coleta de tecido para a imagem de pós-tratamento, crítica e passos opcionais, bem como algumas recomendações técnicas também são apresentados e discutidos.

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Protocol

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Ratinhos CD1 foram criados pelo INRA (UE0907 IERP, Jouy-en-Josas, França). Todos os aspectos éticos de cuidados com animais cumprido com as orientações pertinentes e requisitos de licenciamento estabelecidos pelo Ministério da Agricultura francês. Os procedimentos utilizados foram aprovados pelo comitê de ética local (12/097 acordo do Comethea Jouy-en-Josas / AgroParisTech).

1. glândula mamária Preparação de Amostras

  1. Glândula mamaria do rato dissecção
    1. Euthanize ratos no dia 10 da lactação por deslocamento cervical e prender o animal para baixo com o seu abdômen virado para cima.
    2. Umedecer a área ventral com etanol e seque com uma toalha de papel.
    3. Utilizando uma pinça, puxe a pele abdominal entre as duas patas traseiras e fazer uma incisão (somente através da pele) de cerca de 1 cm com uma tesoura afiada. A partir desta primeira incisão, em seguida, usar uma tesoura para cortar a pele até o pescoço no mouse. Puxe a pele longe do peritônio e pin abaixo de um lado da pele de cada vez, estendendo-se ensinou.
    4. Recolher o abdominal e as glândulas mamárias inguinais, empurrando-os para longe da pele com um cotonete e, finalmente, puxar ou cortar-los longe do peritônio.
      Nota: Neste passo Carmine coloração pode ser realizada a fim de visualizar o epitélio mamário dentro de toda a glândula 43. Esta abordagem pode ser útil para analisar a morfologia global da glândula mamária sob várias condições fisiológicas (estádios de desenvolvimento, doenças, in vivo tratamentos).
    5. Remover o nódulo linfático localizado na junção da abdominal e os gânglios inguinais 44.
  2. Fixação do tecido mamário
    1. Cortar o tecido mamário em 3 mm 3 fragmentos com um bisturi e enxaguar imediatamente estes fragmentos em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4, de modo a remover tanto quanto possível o leite.
    2. Secar rapidamente os fragmentos em um papeltoalha e colocá-los em uma solução fria PBS contendo paraformaldeído 4% (PFA, HCHO, 32% solução de formaldeído, CUIDADO) por 10 a 15 min em gelo.
      Nota: Este é o tempo suficiente para permitir análise posterior em fatias de tecido mamário por IIF36 e / ou hibridização in situ 45. No entanto, como fixadores de aldeído penetrar muito lentamente em pedaços de tecido (~ 1-3 mm por hora), este período pode ser prolongado para assegurar uma fixação óptima da amostra de tecido. Em alternativa, fixar tecidos in vivo irrigando um animal anestesiado com uma solução fixadora (não detalhados no presente estudo).
  3. Infusão de sacarose
    1. Enxaguar rapidamente os fragmentos mamárias em PBS frio e mergulhe-os em uma solução de PBS frio contendo 40% de sacarose (D-sacarose, C12H22O11, Sr. 342,3 g / mol) durante 16 a 48 h a 4 ° C sob agitação suave.
  4. Incorporação de tecidos
    Nota: Neste passo, os fragmentos mamarias podem ser re-cortado, a fim de fazer fragmentos mais pequenos (2-3 mm 3) Ou para ajustar sua forma.
    1. Adequadamente rotular os moldes de plástico e encher um terço do volume do molde com o composto OCT, mantida à temperatura ambiente. Coloque um fragmento (2-3 mm 3) do tecido mamário por mofo e cobri-lo com composto outubro
    2. Colocar os moldes na superfície do azoto líquido (numa folha de alumínio ou usando um peneiro metálico) e permitir que o produto a congelar.
      Nota: Deve tornar-se sólido branco e antes imergindo o molde em azoto líquido.
  5. Armazenar as amostras congeladas a -80 ° C, até secções de tecido são realizados.

2. Seccionamento tecido congelado

Nota: um criostato, que é essencialmente um micrótomo no interior de um congelador, é necessário para fazer secções de tecido congelado. A temperatura mais baixa é muitas vezes necessária para tecidos de gordura ou ricos em lipídios, como glândula mamária virgem.

  1. Ajuste a temperatura do criostato a -26 ° C e esperar até que ele tem Stabicivilizada. Manter o bloco de tecido congelado a -26 ° C durante todo o processo de corte inteira. Absolutamente evitar o descongelamento do tecido em qualquer momento durante o procedimento.
  2. Arrefece-se a lâmina de barbear, o suporte de corte, o dispositivo de barras estabilizadoras e a escova para -26 ° C, colocando-os no criostato durante pelo menos 10 min. Também colocar uma caixa de deslizar no interior do criostato, de modo a ser capaz de armazenar as lâminas de vidro como as secções são feitas.
  3. Adequadamente rotular as lâminas de vidro que vai ser utilizado para recolher as secções de tecido e mantê-las na RT; de outro modo as secções de tecido não irá aderir a elas. Retirar a amostra do molde no interior do criostato.
    Nota: Usando lâminas de vidro carregados positivamente irá favorecer grandemente a adesão de secções frescas de tecido congelado devido à maior atração eletrostática.
  4. Cobrir a superfície de um disco de tecido de metal com composto OCT (mantida a RT) e empurrar a amostra congelada para ele. Coloque o molhado montar no interior do criostato e deixá-lo cool durante pelo menos 15 min.
  5. Coloque a montagem líquida no suporte do disco do criostato. Ajustar a espessura do corte de 5-6 ^ m e, se possível, usar uma nova lâmina afiada ou pelo menos modificar a área sobre a lâmina usada para cortar cada amostra uma vez que alguns tecidos que irá rapidamente aborrecido.
  6. Ajustar a posição do dispositivo de barras estabilizadoras sobre a lâmina de barbear fazendo cortes de o meio de montagem até que as fatias são formadas uniformemente e correctamente. Idealmente, o dispositivo de barras estabilizadoras vai passar por cima da lâmina de corte em cerca de 1 mm.
  7. Uma vez que as configurações estão corretas, execute cortes de tecido, girando a roda em um movimento uniforme contínua. A menos que a temperatura é ideal, uma secção de tecido vai, por natureza, tente enrolar.
    1. Utilize uma escova para agarrar e manobrar a secção através do estágio de modo a colocá-lo como desejado na lâmina de vidro. Utilizar a escova para limpar os restos possivelmente presentes no bloco de tecido congelado e / ou a lâmina de barbear.
  8. Puxea secção de tecido para o usuário e evitar pressioná-la para o palco criostato. Evitar pressionar a secção de tecido na fase de criostato, pois pode levar à adesão da fatia de tecido na fase e, portanto, a incapacidade de recuperar-o com a lâmina de vidro.
  9. Recuperar secções de tecido, um por um por ir buscá-los na superfície de uma lâmina de vidro, segurando-o acima da seção e dobrando-o para baixo para tocar a secção de tecido.
    Nota: As secções de tecido rapidamente aderir ao vidro quente devido à atração estática. Se várias secções de tecido são colocados no mesmo slide, tenha cuidado para não sobrepor-los e espaço-los o suficiente para ser capaz de colocá-los individualmente em um círculo hidrofóbico (ver secção 3.1.1.).

3. Imunofluorescência Indireta

  1. Localizando seções
    1. Use uma caneta barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em torno de tecido hidrofóbico montado no slide. Deixe o círculo seco durante cerca de 1 min a RT. Desenhar uma linha em torno do tsecções problema com um marcador permanente preto fino, bem como, mas no lado da placa de vidro oposta àquela em que as secções de tecido são.
      Nota: Este círculo é repelente de água e acetona e álcool insolúvel. É, por conseguinte, proporciona uma barreira para soluções aquosas utilizadas durante o processo de IHC e reduz o volume de reagentes necessários.
    2. Rehidratar secções de tecido, cobrindo-os com uma queda de ~ 250 ul de PBS durante alguns minutos à temperatura ambiente. Fix secções de tecido, cobrindo-os com ~ 250 mL de uma solução recentemente preparada de PFA a 3% em PBS durante 10 a 15 min.
      Nota: Opcionalmente, neste caso, usar uma solução de aldeído de têmpera (50 mM de cloreto de amónio (NH4CI, Sr. 53,5 g / mol) em PBS ou glicina 0,1 M (C 2 H 5 NO 2, Mr 75,07 g / mol) em PBS ) para parar a reacção de fixação. Lavagem PBS simples e abundante é geralmente suficiente para remover aldeído que não reagiu.
  2. Recuperação antigênica (opcional)
  3. Coloque a solução AR (100 mM de Tris (C 4 H 11 NO 3, Mr 121,14) 5% de ureia (NH2 CONH2, Sr. 60,06), pH 9,6) num copo. O volume de solução de AR deve ser suficiente para cobrir completamente as lâminas de vidro colocadas num suporte de vidro.
  4. Pré-aqueça o AR solução a 95 ° C por monitorização da temperatura com um termómetro e, em seguida, colocar as lâminas de vidro sobre um suporte adequado, imergir a cremalheira no tampão quente, tampa para limitar a evaporação e incubar durante 10 min a 95 ° C.
  5. Retirar o recipiente do banho de água e deixar as lâminas de vidro durante mais 10 min no buffer.
  • Imunodetecção
    1. Lavar as secções de tecido com PBS (~ 250? L / secção) e saturar os com uma solução dede 3% de albumina de soro bovino (BSA, ~ 250? l / secção) em PBS durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente.
    2. Coloque 30-50 ul do anticorpo primário diluído em PBS contendo BSA a 2% em cada secção de tecido.
      Nota: Este volume é suficiente para formar uma gota, que cobre completamente a secção de tecido.
    3. Coloque o mesmo volume de diluente (2% de BSA em PBS) sozinho em uma secção de tecido para realizar um controlo negativo sem anticorpo primário.
      1. Sistematicamente incluem este controlo negativo em cada experiência IHC e executar para cada anticorpo secundário utilizado para estimar o fundo da experiência (marcação não-específica devido ao anticorpo secundário e / ou o tecido auto-fluorescência). Outros tipos de controlos positivos ou negativos também podem ser realizados para assegurar a especificidade da marcação (ver discussão).
    4. Coloque as lâminas de vidro em uma caixa O umidificado / N a 4 ° C.
      Nota: Os anticorpos primários utilizados foram monoclonal de ratinho anti-citoqueratina8 (CK8, diluição 1:50), anticorpo monoclonal anti-citoqueratina 14 (CK14, diluição 1:50), anticorpo policlonal de coelho anti-ratinho de caseína (# 7781, diluição 1:50, generosamente fornecida por MC Neville, Universidade do Colorado Saúde Centro de Ciências, CO, EUA), policlonal de coelho anti-btn1 (1: 300 diluição, generosamente fornecida pelo IH Mather, do Departamento de Animais e Avian Ciências da Universidade de Maryland, College Park, MD, EUA), policlonal de coelho anti-Stx6 ( diluição 1:50, generosamente fornecido por S. Tooze, Cancer Research UK, Instituto de Pesquisa de Londres, Londres, Reino Unido) e policlonal de coelho anti-VAMP4 (diluição 1:50).
    5. Lavar exaustivamente secções de tecido com PBS, pelo menos, quatro vezes durante 10 min à TA.
    6. Dilui-se o anticorpo secundário apropriado (de cabra conjugada com rodamina IgG anti-coelho (H + L), 1: 300 de diluição) em PBS contendo 2% de BSA, colocar 30-50 uL desta solução em todas as secções de tecido, e incuba-se durante 1,5 h à TA.
      1. Desde fluorocromos são moléculas sensíveis à luz, nãoexpor secções de tecido à luz até sua análise. Para IIF em secções de tecido, favorecer anticorpos secundários acoplados a um fluoróforo vermelho desde membranas celulares tendem a gerar um auto-fluorescência verde que pode interferir com baixo rotulagem. Além disso, a escolha de um anticorpo secundário acoplado a fluoróforo vermelho permite a rotulagem concomitante de lípidos neutros (ver abaixo).
    7. Lavar exaustivamente as secções de tecido com PBS, pelo menos, quatro vezes durante 10 min à TA.
  • Pós-fixação (opcional)
    1. Para algumas experiências, realizar pós-fixação por incubação das amostras com 2% de PFA em PBS diluídos durante 10 min à temperatura ambiente, a fim de estabilizar os andaimes antigénio / anticorpo. No entanto, este passo pode ser dispensado na maioria dos casos.
  • Lipídios neutros e counterstaining DNA
    1. Para visualizar CLD e MFG, cor lípidos neutros por incubação secções de tecido em 30-50 ul de uma solução de PBS contendo 3 ng / ml de BODIPY 493/ 503 durante 10 min à TA. Enxaguar rapidamente secções de tecido duas vezes com PBS.
    2. Contracoloração ADN nuclear, com 30-50 ul de uma solução de PBS contendo 3 uM de DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindole, / solução stock 5 mg mL) durante 10 min à TA. Lavar as secções de tecido duas vezes com PBS antes de montar as lâminas para observação.
  • Montagem secção
    1. Remover PBS e colocar uma gota de meio de montagem na secção de cada tecido.
    2. Coloque um lado da lâmina de cobertura em ângulo contra a corrediça, fazendo contacto com a aresta exterior da gota de líquido e, em seguida, baixar a tampa lentamente, evitar bolhas de ar. Deixe o líquido se espalhou entre a lâmina de vidro e lamínula por alguns minutos e depois remover o excesso de meio de montagem com uma toalha de papel.
    3. Selar a lamínula para a lâmina de vidro com seções de esmaltes e tecidos armazenar a 4 ° C para evitar a sua exposição à luz até observação.
  • 4. Fluorescência Observação e Aquisição de Imagem

    Nota: Um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera controlada por um software de aquisição de imagem é necessário para observar os resultados IHC.

    1. Antes de adquirir imagens, verificar a intensidade da rotulagem e avaliar o plano de fundo do experimento, olhando para os controlos negativos. Adquirir imagens de cada marcador fluorescente (canal de cor) individualmente.
    2. Adquirir todas as imagens, incluindo as dos controles correspondentes, nas mesmas condições (exposição e configurações gerais) para cada canal de cor.
    3. Microscopia convencional
      1. Execute microscopia de epifluorescência, com um microscópio equipado com filtros padrão para isotiocianato de fluoresceína (FITC, verde), rodamina (vermelho) e DAPI (azul) emissões, × 20 a × 63 (de imersão em óleo, NA 1.3) objectivos e uma câmera de imagens DP50.
    4. A microscopia confocal
    5. Execute microscopia confocal com microspluvial equipado com o software ZEN, utilizando × 20 × 63 a (óleo-imersão, NA 1.4) objectivos e os comprimentos de onda de excitação e de 488- 568 nm do laser.

    5. Tratamento de Imagem

    Nota: Todas as imagens pós-tratamentos são realizados usando o software livre ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/).

    1. Sobrepor imagem (fusão)
      1. Abra as imagens adquiridas em cada canal que será combinado (File / Open). Se trabalhar com imagens em tons de cinza de 8 bits, atribuem cor artificial para cada canal usando a tabela de referência (quadros Imagem / Pesquisa).
      2. Gere a imagem composta a partir de imagens em tons de cinza ou coloridas usando o comando "Unir canais" (Imagem / Cor / Mesclar Canais) e, em seguida, atribuir uma cor para cada canal.
      3. Execute imagem empilha sobreposição da mesma forma por pilhas adquiridas em cada canal que será combinado (File / Open) abrindo e usando o comando "Unir canais &# 8221; (Imagem / Cor / Mesclar Canais) atribuir uma cor para cada canal. Salve a pilha de composto como uma seqüência de imagens ou como um filme (ver secção 5.4).
    2. Projeção pilha Z imagem
      1. Use a função de projeção Z (Imagem / Stack / Zproject, Max Intensity) para fornecer uma visão bidimensional de todas as fotos de uma pilha de imagens, projetando-os ao longo do eixo perpendicular ao plano de imagem (eixo z). A opção "intensidade máxima" cria uma imagem na qual cada pixel contém o valor máximo sobre todas as imagens da pilha. Isto gera uma imagem única que permite a visualização de todo o coloração observada através de toda a pilha de imagens para um canal em particular ou após a sobreposição de vários canais.
    3. Imagem projeção pilha 3D
      1. Use o comando de projeção em 3D (projeto Imagem / Stack / 3D, Brightest Point, eixo-y) para gerar uma seqüência de projeções de um volume girando em um avião. O processamento visual de surfaces e estruturas internas depende tanto do método de projeção (ponto mais próximo, ponto mais brilhante (usado aqui), ou dizer-valor) e os parâmetros de visualização selecionado. Cada quadro da seqüência de animação é o resultado de se projetar a partir de um ângulo de visão diferente.
      2. Girar a imagem 3D criado em redor de cada um dos três eixos ortogonais (o eixo y foi escolhida aqui). Salve a seqüência produzida como uma única imagem ou um filme.
    4. Pilha de imagens para conversão de filme
      1. Abra uma pilha de imagens (File / Open) e salve-o como um filme em formato .AVI usando o comando "AVI" (Arquivo / Salvar como / AVI).

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    Representative Results

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    A glândula mamária é uma glândula subcutânea localizada ao longo da estrutura de ambos ventral do tórax e do abdômen em roedores. A localização dos cinco pares de glândulas do rato durante a gestação é mostrado na Figura 4. A morfologia da glândula mamária muda dramaticamente durante o seu desenvolvimento, reflectindo modificações funcionais necessárias para preparar a plena lactação (Figura 1B). Em animais virgens ou nulíparas, a glândula mamária consiste de um epitélio ductal pouco ramificada incorporado dentro de um estroma fatty fino que pode ser difícil de ver. Desde o início da gestação, as prolifera epitélio mamário e se expande, resultando em glândulas mamárias maiores que se tornam mais fácil de ver e remover (Figura 4). Durante a lactação, o tecido mamário é mais espessa e mais branca aparecer, devido à presença de leite. Somente glândulas mamárias e abdominais inguinais são recolhidos porque glan mamária cervical e torácicads são menos facilmente removido devido à sua estreita associação com os músculos. Para algumas experiências, os filhotes pode ser separada da lactação fêmea de 4-6 horas antes do sacrifício, a fim de limitar a secreção de leite por MESCs 46,47.

    Identificação de mamárias mioepiteliais e epiteliais

    Células mioepiteliais contrácteis que rodeiam os alvéolos podem ser distinguidos dos MESCs luminais através da utilização de anticorpos dirigidos contra marcadores especificamente expressos por cada um destes tipos de células. Na glândula mamaria, os marcadores actuais utilizados são citoqueratinas (CKs). CKs são uma grande família de proteínas citoplasmáticas que polimerizam para formar filamentos intermediários do citoesqueleto (10 nanómetros de diâmetro em média) encontrados em tecidos epiteliais. Os filamentos intermediários são extremamente estável e proporcionar um suporte mecânico para a arquitectura da célula, e organizar os tecidos, contribuindo para a adesão célula-célula e célula-basal conjuntivointerações de tecido. Os subconjuntos de CKs expressas por células epiteliais dependerá principalmente do tipo de epitélio, a sua fase de desenvolvimento e do seu estado de diferenciação. Além disso, isto também se aplica às contrapartes malignas do epitélio. Assim, estes marcadores são ferramentas simples e valiosos para caracterizar as populações de células num tecido sob condições fisiológicas, e são utilizados para o diagnóstico de tumor e caracterização de patologia cirúrgica 48.

    Na glândula mamaria normal, as células mioepiteliais e MESCs luminais podem ser distinguidos com base na sua expressão diferencial de CK14 e CK8, respectivamente (Figura 5). Estes marcadores são detectados citoplasmáticos nas secções mamárias de ratinho em lactação após PFA fixação e AR. As imagens foram adquiridas com um microscópio de epifluorescência convencional. CK8 parece ser distribuída por todo o citoplasma das MESCs luminal (Figura 5), CK8. Note-se que o fundo vermelho observard para o controlo negativo sem anticorpo primário (Figura 5, -Ig1) é principalmente devido à dobragem secção de tecido, tal como sugerido pela marcação de ADN azul, que exibe várias camadas de núcleos (Figura 5, -Ig1, núcleos). CK14 é especificamente observado em células mioepiteliais planas e alongadas localizadas na base dos alvéolos (Figura 5, CK14). Outra forma comum para identificar células mioepiteliais é detectar actina de músculo liso (a - SMA) presente nessas células contráteis (veja a Figura 4 em 49).

    A detecção de produtos de leite de ratinho

    Após o parto, os MESCs totalmente diferenciadas começam a produzir grandes quantidades de leite. Componentes do leite são secretadas por vias distintas 40,50. Micelas de caseína são secretadas por exocitose de SVs Golgi derivados, enquanto os lipídios são liberados como MFG pelo brotamento da pl apicalAsma membrana de MESCs (Figura 2, células secretoras epiteliais mamarias). Para algumas experiências, os filhotes são separados da fêmea de 4-6 horas antes de se recolher as glândulas mamarias, a fim de retardar a secreção de leite 46,47. Sob estas condições, a membrana plasmática apical de MESCs e o conteúdo do lúmen pode ser facilmente observado, o que não é o caso, uma vez que durante a amamentação e alvéolos são contratados do lúmen estão fechados. Além disso, diminuindo a secreção também é essencial quando se estuda proteínas envolvidas no transporte de membrana, tais como SNARE. Na verdade, ciladas ciclo entre doador e aceitador compartimentos e sua localização subcelular é difícil determinar uma vez que a rotulagem é muitas vezes difundida quando o volume de negócios membrana é elevada, ie., Durante a amamentação. Por isso, diminuindo a secreção de leite, removendo os filhotes fornece condições adequadas para estudar a localização intracelular da SNARE quando o t- e v-SNARE preferencialmente residir no doadore o compartimento aceitador, respectivamente (ver a seguir).

    A Figura 6 mostra a localização das caseínas na glândula mamária lactante rato no dia 10 da lactação, na presença (Figura 6, p +) ou na ausência (Figura 6, -p) das crias. As secções de tecido foram observadas tanto por microscopia de epifluorescência convencional (as três colunas à direita) e microscopia confocal (Figura 6, coluna da esquerda). Durante a sucção, caseínas parecem ser principalmente acumulada na região apical (Figura 6, + p, pontas de seta). A microscopia confocal revelam que caseínas também estão presentes, embora numa menor extensão, na parte lateral da base de MESCs na presença de crias (Figura 6, + p, setas), que não podem ser claramente observadas em microscopia convencional (Figura 6, caseínas, comparar painéis esquerdo e direito). Com efeito, em toda a área de epifluorescência, a fluorescência emitida pela amostra (fundo fluoresce) passa através do volume animado e modifica a resolução dos objectos observados no plano focal objectivo (fora de foco de fluorescência). Isto é especialmente verdadeiro para os espécimes de espessura (mais espesso do que 2 ^ m). A microscopia confocal permite a obtenção de imagens de alta qualidade a partir de amostras preparadas por epifluorescência, como a profundidade de campo podem ser controladas e a fluorescência de fundo excluídos do plano focal. Além disso, na presença de crias (Figura 6, p +), o lúmen dos alvéolos são completamente fechado e o lado apical de MESCs é melhor observada na ausência de filhotes (Figura 6, -P), quando o lúmen do alvéolos é dilatada, devido à acumulação de produtos lácteos. Quando a secreção de leite pode ser abrandada, caseínas também apareça acumulada por baixo da membrana plasmática apical (Figura 6, -p, pontas de seta), e são claramente observados na parte lateral da base de MESCs (Figura 6, -p, setas). Os controlos negativos sem ANTIB primárioOdy não mostraram qualquer rotulagem (Figura 6, -Ig1).

    Produtos lácteos pode ser facilmente co-detectados por combinação de IHQ para caseínas e neutro contracoloração lípido de CLD e MFG (Figura 7). As secções de tecido foram fotografadas como Z-pilhas por microscopia confocal, que foram pós-tratadas com ImageJ para produzir projecções Z ou projecções em 3D de cada (Figura 7, caseínas, lípidos) ou todos os canais de cor (Figura 7, Junção). As sequências de imagens produzidas tenham sido salvos como imagens individuais (Figuras 7 e 8) ou filmes (ver Filmes Suplementares).

    Embora alguns marcação foi observada do seu lado basal, caseínas foram maioritariamente acumulado no lado apical de MESCs (Figura 7, p +), como já foi descrito, quando as fêmeas não tenham sido anteriormente separados dos filhotes (Figura 6, + P). CLD também estão localizadas principalmente na região apical de MESCs, enquanto maior segredoMFG ed estão presentes no lúmen dos alvéolos. Note-se que as caseínas e os MFG são facilmente visualizados no lúmen dos alvéolos, na ausência de filhotes (Figura 7, comparar + p e -p). Caseínas não co-localizar com CLD ou MFG em qualquer uma dessas condições desde a sobreposição dos dois canais de cores não produzem rotulagem amarelo (Figura 7, mesclar fotos). No entanto, a pilha de pós-tratamentos mostram que caseínas cercam os MFG secretados no lúmen dos alvéolos, o que sugere que estas proteínas podem interagir com o MFG (Figura 7, mesclar fotos). Note-se a diferença das imagens produzidas por cada um dos pós-tratamento utilizado (Figura 7, e comparar Zproj 3D proj para cada canal de cor).

    Detecção de butyrophilin, um marcador de proteína de MFG.

    Btn1 é uma das principais proteínas associadas a MFG em leite 51. Esta proteína transmembranar é mainlY localizada na membrana plasmática apical das MESCs e é, por conseguinte, encontrados na superfície do MFG após a sua libertação por gemulação 52. A Figura 8 mostra que no dia 10 de lactação, btn1 está localizada principalmente na membrana plasmática apical e, para uma menor grau, na região apical de MESCs. Btn1 também envolve os MFG presentes no lúmen dos alvéolos, bem como alguns dos CLD apicais (Figura 8, Junção proj 3D, pontas de seta). Os resultados são mostrados como uma imagem única extraído a partir da imagem-Z pilha adquirida (Figura 8, imagem) ou como uma vista 3D gerado com o comando de projecção 3D ImageJ, como descrito acima (Figura 8, proj 3D). Note-se que uma única imagem pode ser suficiente para observar a distribuição apical da proteína, mas a associação espacial de btn1 com MFG segregados ou apical CLD somente é observada após reconstrução 3D da pilha Z (Figura 8 compara imagem btn1 e 3D proj intercalação pictUres). A pilha-Z também pode ser reconstruído como um filme para dar uma melhor visão da distribuição espacial da proteína. A imagem Z-stack adquiridos para btn1 sozinho (filmes suplementares 1 e 3) ou sobreposta com os outros dois canais de cores (mesclar, filmes complementares 2 e 4) são mostrados como exemplos. A pilha Z podem ser lidos imagem-a-imagem da parte superior para a parte inferior (filmes complementares 1 e 2) ou como uma vista rotativo (eixo y) da projeção em 3D de toda a pilha de imagens (vídeos complementares 3 e 4 ).

    Detecção de duas proteínas SNARE: Stx6 e VAMP4

    Como mencionado anteriormente, armadilhas são proteínas ligadas à membrana, que o ciclo de membranas entre dadores e aceitadores. Por conseguinte, é preferível diminuir o volume de negócios membrana associada com a elevada actividade secretora de MESCs separando as fêmeas a partir de crias, antes de recolher a glândula mamaria ao estudarestas proteínas. Stx6 e VAMP4 ambos foram descritos como sendo associado com a rede trans-Golgi 53,54. No entanto, estas proteínas SNARE também podem desempenhar um papel importante ao nível dos outros compartimentos celulares, tais como os grânulos de secreção (Stx6 55,56) e do aparelho de Golgi (VAMP4) 57. Estudos anteriores sugerem que as proteínas SNARE desempenhar um papel na secreção de caseína 35,36. Durante a lactação, Stx6 VAMP4 e estão localizados na região sub-apicais de MESCs. Stx6 é observada entre o núcleo e a membrana apical de MECs, correspondente para o Golgi e na rede trans-Golgi (Figura 9, Stx6), e está também presente, embora em menor grau, em VV-36 contendo caseína. VAMP4 também está localizada na região sub-apicais de MESCs, mas a rotulagem parece ser mais punctata e é acumulada por baixo da membrana plasmática apical (Figura 9, VAMP4) devido à sua associação com ambas as CLD e caseína-ContaSVs ining 36. Controle negativo, sem anticorpo primário não deu origem a qualquer rotulagem.

    figura 1
    Figura 1. Rato desenvolvimento da glândula mamária durante a vida embrionária e adulta. (A) As glândulas mamárias do rato começar a desenvolver em torno do dia embrionário 10 (E10) a partir das linhas de leite ectodérmica (luz azul) (cor de rosa). No E11.5, placodes formar simetricamente ao longo da linha de leite mamário eo mesênquima circundante (azul escuro) começa a condensar. Os placodes invaginar para formar gomos (E12.5-E14.5) e, por E15.5, o epitélio mamário (rosa), proliferar e alongar para formar o broto principal que empurra através da mesenchyme mamária em direção a almofada de gordura (verde claro ). Forma-se um lúmen oco e se abre para dar lugar ao mamilo (roxo). Em E18.5, o epitélio mamário forma uma RudimentaRY estrutura ramificada ligada ao exterior. Adaptado de 6 por permissão de Macmillan Publishers Ltd: Nature Reviews Genetics, copyright 2007. (B) Durante a puberdade, o epitélio mamário (roxo) entra em uma fase de crescimento significativo (extensa alongamento, bifurcação e ramificação lateral). No início da gestação, proliferação rápida e extensa, bem como a ramificação lateral ocorrer, o que leva a uma expansão considerável do epitélio mamário, que invade totalmente toda a almofada de gordura mamaria. O epitélio mamário atinge um estado funcional altamente diferenciados durante a lactação quando MESCs luminais secretam grandes quantidades de leite. Quando a lactação cessa após o desmame, os involutes da glândula mamária. MESCs são removidos por apoptose e fagocitose, levando ao desaparecimento das estruturas lóbulo-alveolar que são substituídas por tecido adiposo. Adaptado de um esquema de http://brisken-lab.epfl.ch/research e capítulo 2.2. http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/index.html. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2. Arquitetura da glândula mamária durante o aleitamento. Durante a lactação, o totalmente desenvolvido e epitélio altamente ramificada (roxo) é responsável pela grande maioria do tecido mamário. O tecido epitelial é formado por estruturas tubulo-alveolar embutidos em um estroma que contém vários tipos de células (fibroblastos, adipócitos, células musculares lisas, sangue e vasos linfáticos e terminações nervosas). MESCs são organizados em estruturas ou alvéolos acinares, reunidos em lóbulos que formam lobos. Cada alvéolo é uma unidade de produção de leite funcional que está ligado a uma rede de canais altamente ramificada lobular e interlobulares, permitindo assim que o leite a ser dchuva para o exterior. Cada alvéolo é delimitado por uma monocamada de MESCs polarizadas, o lado apical de que faz fronteira com um lúmen central. O lado basal do MESCs está em contacto estreito com uma matriz extracelular e células mioepiteliais contráteis. Produtos lácteos são liberados no lado apical de MESCs. Major do leite (caseínas) são secretadas como micelas de caseína (pontos pretos) por exocitose de vesículas secretoras derivadas do Golgi-(SVS), ao passo que os lípidos são libertados na forma de glóbulos de gordura do leite (MFG) por germinação da membrana plasmática apical de MESCs. Cálc: citoplasmática de gotículas de gordura; ER: retículo endoplasmático; MEC: células epiteliais mamárias. Adaptado do capítulo 2.2. http://tvmouse.ucdavis.edu/bcancercd/22/index.html., Fig. Www.cellbiol.net/ste/alpHERCEPTIN1.php 02, Fig. 26-02 em 58, e de 50. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    .within-page = "always"> Figura 3a

    Figura 3b
    Figura 3. Procedimento Experimental para executar imunofluorescência indireta em cortes congelados de glândula mamária do mouse. A glândula mamária é recolhida a partir de um rato fêmea CD1 no dia 10 da lactação. O tecido mamário é cortado em pequenos fragmentos que são corrigidos com paraformaldeído e infundidos em sacarose, antes de ser incorporado no composto outubro e snap-congelado. As amostras da glândula mamaria são então cortadas em secções congeladas finas e processados ​​para IFI por incubação sucessiva com anticorpos primários e secundários de fluorocromo-conjugados, respectivamente. Após a montagem, as amostras são analisadas com um microscópio de fluorescência, permitindo a aquisição de imagens que podem posteriormente ser pós-tratado."Target =" _ blank /53179/53179fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    . Figura 4. anatômico localização das glândulas mamárias do rato esquerda: vista ventral do sistema mamário de ratinho na fase final da gestação. Direita: localização e aspecto da glândula mamaria na fase final da gestação no ratinho. Note-se que durante a lactação, as glândulas mamarias são mais espessa e mais branca aparecer, devido à presença de leite nos alvéolos. Adaptado de http://ctrgenpath.net/static/atlas/mousehistology/Windows/femaleu/mousemammgldiagram.html e http://www.pathbase.net/Necropsy_of_the_Mouse/index.php?file=Chapter_3.html. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    -together.within-page = "always"> Figura 5
    Figura 5. Identificação de células epiteliais luminais e células mioepiteliais basais na glândula mamaria do rato. MESCs luminais e células mioepiteliais são identificados por IIF na glândula mamaria do rato no dia 10 da lactação, com base na sua expressão de CK-8 e CK-14 , respectivamente. DNA nuclear foi corado com DAPI (azul). As imagens foram adquiridas com um microscópio de epifluorescência convencional. A imagem composta (mesclar) mostra a sobreposição da rotulagem correspondente a caseínas (vermelho) e núcleos (azul), respectivamente. -Ig1, Controle negativo, sem anticorpo primário. Os asteriscos indicam lúmens. Scale bar = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    e 6 "src =" / files / ftp_upload / 53179 / 53179fig6.jpg "/>
    Figura 6. Localização celular de caseínas na glândula mamária do mouse. As caseínas são detectados por IFI na glândula mamaria do rato no dia 10 da lactação. A glândula mamaria foi recolhido a partir de fêmeas na presença (+ p) ou na ausência (-p) das crias. As imagens foram adquiridas com um equipamento convencional (direito painel, caseínas, núcleos e mesclar) ou um confocal (caseínas (vermelho), painel esquerdo) microscópio de fluorescência. Em ambas as condições, caseínas (vermelhas) são detectados na região apical (pontas de seta) e mais ou menos ao basal de MESCs (setas). Os controlos negativos sem anticorpos primários não mostram qualquer rotulagem (-Ig1). DNA nuclear está manchado com DAPI (azul). A imagem composta (mesclar) mostra a sobreposição da rotulagem correspondente a caseínas (vermelho) e núcleos (azul), respectivamente. Os asteriscos indicam lúmens. Barra de escala = 100 mm para imagens de epifluorescência (painel direito, caseínas, núcleos, mesclar) e = 10 &# 181;. M para imagens confocal (coluna esquerda) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 7
    Figura 7. Localização celular de produtos lácteos na glândula mamaria do rato. As caseínas (vermelhas) são detectados por IFI na glândula mamaria do rato no dia 10 de lactação na presença (+ p) ou na ausência (-p) das crias. Lipídios neutros (CLDS e MFG) são contrastadas com BODIPY 493/503 (verde). As imagens compostas (mesclagem) mostram a sobreposição das duas bulas. As imagens foram adquiridas como Z-stacks com um microscópio confocal. Z-stacks foram pós-tratadas com ImageJ para gerar projeções Z (Zproj) ou projeções em 3D (eixo y) (proj 3D) das pilhas inteiras em cada canal para ambos (juntar). Os asteriscos indicam lúmens. Barra de escala= 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 8
    Figura 8. localização celular da butyrophilin e lípidos na glândula mamaria do rato. Btn1 (vermelho) é detectada por IFI em glândula mamaria do rato no dia 10 de lactação na ausência das crias. Lipídios neutros (CLDS e MFG) e DNA nuclear são contrastadas com BODIPY 493/503 (verde) e DAPI (azul), respectivamente. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal como imagem Z-stacks. Os resultados são apresentados como uma única imagem extraída da pilha de imagens (imagem, btn1, lípidos, núcleos e mesclar) ou depois de pós-tratamento com ImageJ para gerar uma visão 3D (eixo y) de toda a pilha de imagens (proj 3D, btn1 , lípidos, núcleos, mesclar). As imagens compostas (mesclagem) mostram asobreposição dos três canais de cor. -Ig1, Controle negativo, sem anticorpo primário. Os asteriscos indicam lúmens. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 9
    Figura 9. Localização celular de duas proteínas laço no rato glândula mamária. Sintaxina 6 (Stx6) e VAMP4 (V4) são detectados por IFI na glândula mamária do mouse no dia 10 da lactação. As imagens foram adquiridas com uma (conv) epifluorescência convencional ou um confocal (LSM) microscópio. As imagens compostas (mesclagem) mostram a sobreposição da rotulagem observada para cada proteína SNARE (vermelho) e para o DNA nuclear contrastadas com DAPI (cor verde false), respectivamente. -Ig1, Controle negativo, sem anticorpo primário. Asteriscos indicam lúmens. Barra de escala = 10 mm para imagens confocal e = 100 mm para epifluorescência imagens. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Quadro 1a

    Tabela 1b

    Tabela 1. guia resolução de problemas imuno-histoquímica.

    figura 1
    Filme suplementares 1. Localização dos butyrophilin na glândula mamária do mouse. Btn1 (vermelho) é detectada pelo IIF na glândula mamária do mouse no dia 10 da lactação. As imagens foram adquiridas com um co microscópio nfocal como uma pilha-Z e pós-tratadas com ImageJ para gerar um filme. A pilha-Z é lido a partir do topo ao fundo. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

    figura 1
    Filme Suplementar 2. Localização dos butyrophilin e lipídios neutros na glândula mamária do mouse. Btn1 (vermelho) é detectada pelo IIF em rato glândula mamária no dia 10 da lactação. Lipídios neutros (CLDS e MFG) e DNA nuclear são contrastadas com BODIPY 493/503 (verde) e DAPI (azul), respectivamente. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal como uma pilha de Z para cada canal de cor e foram pós-tratadas com ImageJ para gerar um composto Z-pilha que sobrepõe os três canais de cor. O Z-pilha compósito resultante é lida a partir do topo para o fundo.https://www.jove.com/files/ftp_upload/53179/supvid2.mp4 "target =" _ blank "> Clique aqui para ver este vídeo.

    figura 1
    Suplementar filme 3. Localização dos butyrophilin na glândula mamaria do rato. Btn1 (vermelho) é detectada por IIF na glândula mamaria do rato no dia 10 da lactação. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal como uma pilha-Z e com ImageJ (projeção 3D) tratou-post para gerar um (eixo-y) rotativa visão espacial da rotulagem btn1. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

    figura 1
    Filme Suplementar 4. Localização dos butyrophilin e neutros lipídios no ma ratoglândula mmary. btn1 (vermelho) é detectada pelo IIF na glândula mamária do mouse no dia 10 da lactação. Lipídios neutros (CLDS e MFG) e DNA nuclear são contrastadas com BODIPY 493/503 (verde) e DAPI (azul), respectivamente. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal como uma pilha de Z para cada canal de cor e foram pós-tratadas com ImageJ para gerar um composto Z-pilha que sobrepõe os três canais de cor. ImageJ (projeção 3D) foi ainda usado para gerar um (eixo-y) rotativa visão espacial do Z-stack composto. Por favor clique aqui para ver este vídeo.

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    Discussion

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    IHC é um método experimental simples e relativamente simples para localizar antigénio em secções de tecido, o qual depende primariamente em interacções epitopo-anticorpo específicos. Embora um grande número de protocolos são utilizados para localizar uma proteína por IFI, a essência destes procedimentos é quase sempre o mesmo. No entanto, existem alguns aspectos críticos que podem influenciar fortemente o resultado e, por conseguinte, devem ser optimizadas para cada estudo IHC indivíduo. O maior desafio desta abordagem é a de determinar as melhores condições experimentais, isto é., Os que gerar um sinal forte e específico para o antigénio de interesse. As variáveis ​​que devem ser considerados para a concepção experimental e optimização são: (1) o tipo de antigénio (espécies, os níveis de expressão, a localização sub-celular); (2) o tipo de epitopo (sequência, a conformação e as modificações pós-traducionais putativos); (3) a preparação da amostra (inclusão em parafina ou secções congeladas para); (4) a fixação metOD (perfusão ou imersão); (5) o fixador utilizado (formaldeído, álcool ou acetona); (6) o reagente de bloqueio utilizado (soro normal, de BSA ou leite magro); (7) o passo de AR; (8) o método de detecção (direta ou indireta); (8) do tipo de anticorpo primário (soro policlonal ou monoclonal); (9) O anticorpo secundário (espécies e rótulo); (10) (counterstains nuclear e / ou outra rotulagem compartimento celular); e (11) o meio de montagem (ver Tabela 1 para detalhes). A fixação e os passos de bloqueio, pelo menos, requer a optimização de outros factores tais como a concentração, pH, temperatura, tempo de incubação e diluente.

    O primeiro aspecto crucial diz respeito à preparação de amostras de tecido, o que está intimamente relacionado com o método de fixação, que por sua vez influencia a qualidade dos resultados. Por exemplo, pedaços de tecido pode ser fixa ou não antes da incorporação. Este passo pode também depender do método de incorporação escolhido, isto é, composto de outubro vs parafina, Que por sua vez depende, por vezes, o anticorpo primário utilizada. Fixação do tecido pode ser realizada in vivo por um animal anestesiado perfusão com uma solução fixadora. Este método é útil para conservar os antigénios quando se estuda tecidos intactos, mas pode não ser suficiente para fixar o tecido de interesse. Neste caso, pequenos pedaços de tecido (com a espessura de 10 mm) pode ser imersa na solução fixadora. Tecido congelado pode ser preparada por imersão do tecido em azoto líquido, ou isopentano, e snap-congelamento é altamente recomendável para a subsequente detecção de modificações pós-translacionais, tais como a fosforilação. No entanto, ao contrário de tecidos embebidos em parafina, congelação não é adequado para a preservação a longo prazo dos tecidos devido à formação de cristais de gelo dentro das células, que podem alterar a morfologia subcelular. Uma vez cortada, secções de tecido congeladas podem ser armazenadas a -80 ° C durante até 1 ano. Em qualquer caso, a preparação das amostras de tecido é um compromisso entre a preservação do tecido/ arquitetura celular e preservando a integridade epitopo.

    Uma vez que altera a composição química de tecidos, que é crítica para optimizar as condições de fixação para evitar tanto incompleta (fi xação sob) e excesso (excessiva fixação) fi xação.

    Com efeito, underfixation pode reduzir o sinal específico, promovendo a degradação proteolítica de certos antigénios. Por outro lado, com excessiva pode alterar a marcação específico, mascarando o epitopo ou a geração de um fundo não específica forte. Assim, para além da escolha da solução fixadora, outros parâmetros tais como o tempo de incubação, a temperatura e o pH vai afectar a fixação do tecido. Embora PFA é o fixador mais comum utilizado para a IHQ, não pode ser considerado como um fixador "universal". PFA induz proteína-proteína e ácido ligações cruzadas de proteína-nucleico e pode, assim, modificar o epitopo artefactually (excessiva fixação) e, em seguida, evitar a sua recognition pelo anticorpo primário. No entanto, o epitopo adicional pode ser desmascarada por técnicas de AR (ver abaixo). PFA podem também ser inadequados para a detecção de determinados antigénios, como tem sido demonstrado induzir a translocação de algumas proteínas fosforiladas a partir da membrana para o citoplasma. Em tais casos, o PFA tem de ser substituído por fixadores alternativos apropriados, tais como o álcool. Ao contrário de PFA, álcoois, tais como metanol ou etanol não mascarar epitopos uma vez que permitem a fixação do tecido, substituindo as moléculas de água nos tecidos. Isso pode levar à precipitação de proteínas e, em seguida, evitar a interacção anticorpo / epítopo devido a alterações conformacionais. É amplamente pensava que álcoois não penetram e, portanto, não preservam morfologia do tecido, bem como PFA. A acetona é mais um fixador alternativo, que é comumente usado quando se trabalha com cortes de tecido não corrigidos, o snap-congelados. No entanto, a acetona é um forte agente desidratante e pode levar à precipitação irreversível das proteínas de tecido.

    Para alguns antigénios, um passo adicional de AR pode ser necessária para obter um bom sinal, principalmente se o fixador provoca a mudança conformacional ou altera a carga electrostática do epitopo (mascaramento do epitopo). AR métodos destinam-se a reverter estes processos para restaurar a imunorreactividade do epitopo e sua subsequente interacção com o anticorpo primário. AR métodos baseiam-se principalmente duas abordagens: (1) de recuperação de epítopo induzida pela protease, ou seja, com enzimas tais como a proteinase K, tripsina ou pepsina, que cliva péptidos que mascaram o epítopo; e (2) a recuperação epitopo induzida por calor, ou seja, usando um forno de microondas, panelas de pressão, vapores vegetais, autoclaves ou banhos de água. Esta última abordagem é especialmente tempo-, com temperatura, buffering, e sensível ao pH, e as condições óptimas devem ser empiricamente determinado (um exemplo é fornecido na secção de Protocolo). Alternativamente, a afinidade de um anticorpo para o seu antigénio pode ser melhoradapor alteração do pH ou a concentração do catião do diluente de anticorpo.

    Um passo permeabilização, por vezes é necessário para obter um bom sinal para um epitopo intracelular em secções de tecido grosso, particularmente para a coloração de antigénio nuclear. Isto pode ser conseguido de várias maneiras, utilizando: (1) álcoois ou acetona como fixadores; ou (2) detergentes como Triton, NP-40 (0,1-0,2% em PBS, 10 min), digitonina, saponina ou Tween 20 (0,2-0,5% durante 10 a 30 min) após a fixação do PFA. No entanto, a escolha do detergente depende da localização celular do epitopo detectada. Na verdade, detergentes agressivos, tais como Triton-X100, que solubilizar membranas celulares, são adequados para a detecção epitopo nuclear, mas pode levar a sinalizar a alteração sobre a extração de algumas proteínas membranosas. A utilização de detergentes mais leves (de saponina e Tween 20) são mais adequados para a detecção de epítopos citoplasmáticos.

    O segundo passo crítico é o blocking de coloração não específica. A ligação de um anticorpo ao seu epítopo alvo é governada pelas forças intermoleculares (por exemplo, interacções, hidrofóbicas e de ligação de hidrogénio, iónicas). Assim, as interacções de anticorpos primários e / ou secundários com outras proteínas do que os seus antigénios alvo podem resultar em coloração não específica. Isto gera o fundo de fluorescência elevada, o que impede a visualização da proteína de interesse (baixa relação de sinal / ruído). Reagentes de bloqueio reduz a interacções não específicas sem prejudicar a interacção anticorpo / epítopo específico. Um procedimento comum consiste em incubando secções de tecido com inativado pelo calor soro normal ou BSA. Quando se utiliza um soro normal, deve ser da mesma espécie que a do animal hospedeiro do anticorpo secundário ou de uma espécie não relacionada. Em todos os casos, o reagente de bloqueio seleccionado também deve ser adicionado aos diluentes de os anticorpos primários e secundários. Além disso, a utilização de detergentes não-iónicos, tais como Triton X-100, Tween 20 ou saponina ajuda a reduzir as interacções não específicas.

    O terceiro e provavelmente o mais importante parâmetro é a seleção anticorpo primário e otimização. Obviamente, a melhor escolha é um anticorpo de alta qualidade com um mínimo de reactividade cruzada. Como anticorpos monoclonais geralmente apresentam alta afinidade e especificidade para um epitopo simples, eles são as melhores ferramentas para discriminar um determinado membro de uma família de proteínas com alta identidade de sequência. No entanto, a interacção anticorpo / epítopo pode ser comprometida se o epitopo-alvo tenha perdido o seu estado de conformação nativo ou quando o acesso ao epitopo é impedida por interacções com outras proteínas, modificações pós-traducionais, temperatura, pH, concentração de sal e de fixação. Em tais casos, os anticorpos policlonais são mais adequadas como eles reconhecem epitopos múltiplos da mesma proteína. Além disso, são muitas vezes mais estável do que os anticorpos monoclonais através de uma vasta gama de pH e concentração de sal.Estudos preliminares para definir as condições de incubação adequadas, isto é, a diluição (anticorpo monoclonal: 5-25 mg / ml, anticorpo policlonal: 1,7-15 mg / ml) de trabalho, tempo de incubação, diluente e de temperatura, que têm de ser determinados empiricamente para cada anticorpo primário. Estes parâmetros têm de ser otimizado para determinar as condições que produzem o melhor sinal com baixo ruído de fundo. A especificidade da marcação é favorecido por tempos de incubação mais longos a temperaturas mais baixas (isto é., 4 ° C versus RT).

    A escolha para executar a detecção directa ou indirecta, muitas vezes depende do nível de expressão do antigénio. Por exemplo, um epitopo altamente expresso pode simplesmente ser detectada com um anticorpo primário conjugado com fluorocromo, permitindo, assim, uma coloração multicolor rápido e simples possível, evitando fundo não específica, devido à utilização de um anticorpo secundário. No entanto, direta Se Maio gera um sinal de baixa, a um custo mais elevado e pode sometimes ser difícil, anticorpo marcado quando não estão disponíveis comercialmente. Por outro lado, IIF é mais sensível para detectar epítopos expressos inferiores como o sinal gerado é mais intensa devido à interacção de pelo menos dois anticorpos secundários marcados (criado contra as espécies hospedeiras anticorpo primário) com o anticorpo primário (amplificação). Além disso, uma grande variedade de anticorpos secundários conjugados com fluoróforos diferentes estão comercialmente disponíveis, relativamente barato, e qualidade controlada. No entanto, esta abordagem pode induzir a reactividade cruzada e, assim, obriga a escolher cuidadosamente anticorpos primários que não são produzidos na mesma espécie ou de diferentes isotipos quando realizando experiências de rotulagem múltipla. IIF também às vezes requer passos adicionais de bloqueio e devem incluir controlos negativos sistemáticos (ver abaixo). A amplificação pode ser adicionalmente conseguido através da utilização de um anticorpo secundário conjugado com biotina e avidina marcada fluorescentemente ou estreptavidina (ligada por quatro biotinas MOlecule). No entanto, este método de amplificação requer passos adicionais para prevenir a ligação não específica e não podem ser adaptados para a coloração de alguns tecidos (fígado, rim, coração, cérebro, pulmão e lactantes glândula mamária), devido à presença de níveis elevados de biotina endógena . No entanto, biotina endógena pode ser bloqueada por pré-incubação da amostra com avidina e com biotina posteriormente antes da incubação com o anticorpo primário. A escolha dos fluorocromos conjugados, que são pequenas moléculas químicas com a propriedade de emitir luz quando excitado por luz de um comprimento de onda mais curto, depende principalmente do tipo de equipamento disponível microscópio.

    Quando adequadamente concebidos para limitar tanto a reactividade cruzada entre os anticorpos e passagem entre as propriedades espectrais dos fluorocromos utilizados, baseado no IHC imunofluorescência permite a visualização simultânea de vários alvos celulares.

    A última críticaponto sobre experiências IHC diz respeito aos controlos positivos e negativos que devem ser executadas para suportar a validade de coloração, para identificar artefactos experimentais e para a interpretação dos resultados precisos. Alguns tecidos apresentam alta fundo fluorescente (referido como autofluorescência) que poderia levar a uma má interpretação dos resultados. Assim, cortes de tecido tem que ser observada tanto sob iluminação fluorescente e brilhante-campo antes do início do experimento IHC. Um controlo negativo que omite o anticorpo primário tem de ser sistematicamente incluídos em cada experiência de IHC, a fim de assegurar que um não-específica potencial de ligação do anticorpo secundário é insignificante e não dissimulam ou assemelhar-se ao padrão de coloração específica. Um controlo de isotipo pode ser realizada quando se trabalha com um anticorpo monoclonal primário, substituindo-o com um anticorpo não-imune do mesmo isotipo (por exemplo, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgM) com a mesma concentração. Esse controle ajuda a estimate a coloração não específica, o que pode ser devido às interacções de anticorpos com a amostra. Para demonstrar a ligação de um anticorpo para o seu antigénio específico, um controlo de absorção pode ser conseguida de duas formas por pré-incubação do anticorpo primário: (1) com o seu imunogénio solúvel (10: 1 razão molar) O / N a 4 ° C ; e (2) com células ou secções de tecidos que expressam o epitopo de interesse, mas que diferem do tecido estudado (por exemplo, ver Figura 4B em 59). Em ambos os casos, a consequente esgotamento do anticorpo primário deve levar a pouca ou nenhuma coloração. Um outro tipo de controlo pode ser feito usando um anticorpo irrelevante primário, isto é., Dirigido contra um epitopo que exibe uma localização celular que é diferente do epitopo de interesse (vs nuclear citoplasmático). O anticorpo irrelevante deve ser do mesmo isotipo e espécies como o anticorpo primário de interesse. Controlos adicionais para experiências de IHC pode incluir o uso de amostras de tissUEs que se sabe expressarem (animais transgénicos) ou não (animais knock-out) do epítopo de interesse. Isto pode fornecer uma referência útil e ajudar a otimizar o procedimento IHC.

    A principal limitação de técnicas IF é que eles só podem ser aplicadas a fixa (morto) e / ou células permeabilizadas, ambos procedimento potencialmente induzir artefatos. Outras limitações desta abordagem são, devido à utilização de um microscópio para a observação das amostras. Em primeiro lugar, como a resolução óptica de epifluorescência e confocal microscópios é limitado, localização ou co-localização das proteínas detectadas não deve ser sobre-interpretados. Em segundo lugar, a fotodegradação, isto é. desvanecimento da intensidade de fluorescência ao longo do tempo quando expostos à luz, é essencialmente devido à geração de espécies reactivas de oxigénio na amostra após a excitação de fluorescência, que, por sua vez, leva à destruição fotoquímica do fluoróforo. Fotodegradação pode ser reduzido por: a) manter as amostras protegidas deluz durante o experimento IF e armazenamento até que a sua observação; b) usando um agente antifade (espécies reativas de oxigênio catadores) no meio de montagem; c) redução da intensidade e / ou duração da luz de excitação; d) aumento da concentração de fluoróforos ou usando uma concentração baixa de um fluorocromo com alta eficiência quântica-; ee) usando fluorophores robustos que são menos propensos a fotodegradação (ie. Alexa Fluors, Seta Fluors, ou DyLightFluors). Em terceiro lugar, autofluorescência é muitas vezes devido à presença de coenzima flavina (FAD e FMN: absorção, 450 nm; emissão, 515 nm) e nucleótidos de piridina reduzidos (NADH: absorção, 340 nm; emissão, 460 nm) em células de mamíferos. Além disso, a utilização de aldeídos, em especial glutaraldeído, para fixar as amostras, pode resultar em elevados níveis de autofluorescência. Isto pode ser minimizado através da lavagem das amostras com boro-hidreto de sódio a 0,1% em PBS antes da incubação com o anticorpo e / ou por selecção de sondas e filtros ópticos que maximize o sinal de fluorescência em relação à autofluorescência. Em quarto lugar, a sobreposição de fluorescência (também denominado bleed-through, de passagem ou de diafonia) é principalmente devido à emissão propriedades espectrais dos fluoróforos como eles frequentemente apresentam larguras de banda muito largos, diferentes, perfis espectrais assimétricos, bem como vários comprimentos de onda de emissão de pico, o número de maxima. Fluorescência sobreposição ocorre quando se trabalha com vários fluoróforos (rotulagem multicolor) e é caracterizada pela emissão de um fluoróforo no canal (filtro) de outro fluoróforo. Artefactos a infiltração deve ser minimizado, pois muitas vezes complicar a interpretação dos resultados IF, em particular no caso de co-localização ou estudos quantitativos. Como o balanceamento da emissão fluorophores só pode ser ligeiramente melhorada pelo procedimento IF, sangrar-through pode ser reduzida, principalmente no momento da aquisição de imagem usando um otimizadas conjuntos de filtros de fluorescência e / ou detector fotomultiplicador, a fim de adequadamente separComeram os perfis espectrais dos fluoróforos. A este respeito, microscopia confocal é bem adaptado para imagiologia multicolor, pois permite que o espectro de emissão de fluorescência de fluoróforos diferenciação individuais, orientando cada sinal a um canal de detecção em particular. Além disso, a microscopia confocal permite ajustar o ganho, a voltagem do fotomultiplicador, ou a potência do laser para os canais de detecção individuais para a aquisição sequencial (apenas um fluoróforo de cada vez) de rotulagem. Idealmente, os controles de rótulo único deve ser realizada para quantificar o sangramento-through e, eventualmente, removê-lo computacionalmente. Um controle sem anticorpos secundários (controlo de fundo) pode ser preparado para definir os limites de ganho de sinal e deslocamento de cada canal para aquisição de imagem ideal. Ele também pode ser usado para o processamento pós-aquisição para background image correta (autofluorescência).

    Em conclusão, o método descrito proporciona um protocolo padrão simples para realizati fáceisem imunocoloração em secções de glândula mamária. No entanto, as principais etapas de um ensaio IHC deve ser optimizada para cada antigénio / anticorpo pares, a fim de visualizar coloração específica e minimizar os sinais espontâneos não-específicos. O método descrito também inclui vários métodos básicos para o pós-tratamento da maioria das imagens obtidas. Imunodetecção à base de fluorescência é um método poderoso com uma vasta gama de aplicações, desde a localização celular de um antigénio de diagnóstico. Novos avanços na estas abordagens será alcançado com o desenvolvimento futuro de novos fluoróforos, dispositivos de aquisição e técnicas de microscopia, a imagem previamente não observados detalhes de estruturas e processos biológicos.

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    Disclosures

    Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

    Acknowledgments

    Os autores agradecem à facilidade núcleo imagiologia INRA MIMA2 (INRA, UMR1198, Jouy-en-Josas) e ao pessoal da unidade IERP (UE 0907, INRA, Jouy-en-Josas) por cuidar dos animais e instalações. Gostaríamos também de agradecer a IH Mather, MC Neville e S. Tooze por nos fornecer antibodie muito útil.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Dissection
    Pins
    Ethanol
    Scissors
    Scalpel and adapted blades
    Ice
    Towel paper
    Tissue sample preparation Company Catalog Number Comments/Description
    Phosphate Buffered Saline (pH7.4) Sigma P-3813
    Paraformaldehyde (PFA, 32% EM grade, 100 ml) Electron Microscopy Sciences 15714-S personnal protection equipment required WARNING: this product will expose you to Formaldehyde Gas, a chemical known to cause cancer
    OCT compound/Tissue Tek Sakura 4583
    Sucrose (D-saccharose) VWR 27480.294
    Plastic molds Dominique Dutscher 39910
    Liquid nitrogen
    Cryostat/sample support Leica  CM3050S
    Razor blades (SEC35) Thermo Scientific 152200
    Slide box
    Glass slides Superfrost/Superfrost Ultra Plus Thermo Scientific 10143560W90/1014356190
    Brushes
    IHC Company Catalog Number Comments/Description
    Super Pap Pen Sigma Z377821-1EA
    Permanent marker (black)
    50 mM NH4Cl in PBS Sigma A-0171
    0.1 M glycine in PBS VWR 24403.367
    Antigen Retrieval solution: Tris 100 mM 5% urea pH9.6
    Heater (up to 100°C)
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906-100G
    Vectashield (anti-fading mounting medium) without DAPI/with DAPI Vector Laboratories H-1000/H-1200
    Glass coverslips 22x50mm (microscopy grade) VWR CORN2980-225
    Nail polish
    Primary antibodies Company Catalog Number Comments/Description
    Rabbit anti-mouse caseins (#7781; 1:50 dilution) generously gifted by M.C. Neville (University of Colorado Health Sciences
    Center, USA)
    Mouse anti-cytokeratin 8 (CK8, clone 1E8, 1:50 dilution) Biolegend (Covance) MMS-162P
    Mouse anti-cytokeratin 14 (CK14, cloneLL002, 1:50 dilution) Thermo Scientific MS-115-P0/P1
    Rabbit anti-butyrophilin (1:300 dilution) generously gifted by I.H. Mather (Department of Animal and Avian Sciences University of Maryland College Park, USA)
    Rabbit anti-Stx6 (1:50 dilution) generously gifted S. Tooze
    (Cancer Research UK, London Research Institute, London, UK)
    Rabbit anti-VAMP4 (1:50 dilution) Abcam ab3348
    Secondary antibodies Company Catalog Number Comments/Description
    Rhodamine-conjugated goat anti-rabbit IgG (H + L) (1:300 dilution) Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-025-003
    Counterstains Company Catalog Number Comments/Description
    Bodipy 493/503 Life Technologies (Molecular Probes) D-3922
    DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole) Life Technologies (Molecular Probes) D-1306
    Observation/Image capture Company Catalog Number Comments/Description
    conventional fluorescence microscope Leica Leitz DMRB
    microscope
    Standard filters for FITC, Rhodamine
    and DAPI emissions,                     ×63 oil-immersion objective (NA 1.3), DP50 imaging camera (Olympus), CellˆF software (Olympus)
    Laser Scanning Microscope (confocal microscopy) Zeiss LSM
    510 microscope
    Plan-Apochromat ×63 oil-immersion objective (NA 1.4),                  CLSM 510 software,               Confocal facilities, MIMA2 Platform, INRA Jouy-en-Josas, France, http://mima2.jouy.inra.fr/mima2)
    Image treatment Company Catalog Number Comments/Description
    ImageJ 1.49k software Free software

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: a journey of morphogenesis and commitment. Development. 135-995 (2008).
    2. Smith, G. H. Experimental mammary epithelial morphogenesis in an in vivo model: evidence for distinct cellular progenitors of the ductal and lobular phenotype. Breast Cancer Res Treat. 39, 21-31 (1996).
    3. Van Keymeulen, A., et al. Distinct stem cells contribute to mammary gland development and maintenance. Nature. 479, 189-193 (2011).
    4. Oakes, S. R., Gallego-Ortega, D., Ormandy, C. J. The mammary cellular hierarchy and breast cancer. Cell Mol Life Sci. 71, 4301-4324 (2014).
    5. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes & development. 28, 1143-1158 (2014).
    6. Robinson, G. W. Cooperation of signalling pathways in embryonic mammary gland development. Nat Rev Genet. 8, 963-972 (2007).
    7. Cowin, P., Wysolmerski, J. Molecular mechanisms guiding embryonic mammary gland development. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003251 (2010).
    8. Brisken, C., O'Malley, B. Hormone action in the mammary gland. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2, a003178 (2010).
    9. Gjorevski, N., Nelson, C. M. Integrated morphodynamic signalling of the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 581-593 (2011).
    10. Daniel, C. W., Smith, G. H. The mammary gland: a model for development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 3-8 (1999).
    11. Howlett, A. R., Bissell, M. J. The influence of tissue microenvironment (stroma and extracellular matrix) on the development and function of mammary epithelium. Epithelial Cell Biol. 2, 79-89 (1993).
    12. Edwards, G., Streuli, C. Signalling in extracellular-matrix-mediated control of epithelial cell phenotype. Biochem Soc Trans. 23, 464-468 (1995).
    13. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Think globally, act locally: the making of a mouse mammary gland. Genes & development. 12, 449-455 (1998).
    14. Topper, Y. J., Freeman, C. S. Multiple hormone interactions in the developmental biology of the mammary gland. Physiol Rev. 60, 1049-1106 (1980).
    15. Brisken, C., et al. A paracrine role for the epithelial progesterone receptor in mammary gland development. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 5076-5081 (1998).
    16. Ormandy, C. J., Binart, N., Kelly, P. A. Mammary gland development in prolactin receptor knockout mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2, 355-364 (1997).
    17. Oakes, S. R., Rogers, R. L., Naylor, M. J., Ormandy, C. J. Prolactin regulation of mammary gland development. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 13, 13-28 (2008).
    18. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 715-725 (2005).
    19. Kouros-Mehr, H., Werb, Z. Candidate regulators of mammary branching morphogenesis identified by genome-wide transcript analysis. Dev Dyn. 235, 3404-3412 (2006).
    20. Khaled, W. T., et al. The IL-4/IL-13/Stat6 signalling pathway promotes luminal mammary epithelial cell development. Development. 134, 2739-2750 (2007).
    21. Asselin-Labat, M. L., et al. Gata-3 is an essential regulator of mammary-gland morphogenesis and luminal-cell differentiation. Nat Cell Biol. 9, 201-209 (2007).
    22. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105, 223-235 (1989).
    23. Robinson, G. W., McKnight, R. A., Smith, G. H., Hennighausen, L. Mammary epithelial cells undergo secretory differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation. Development. 121, 2079-2090 (1995).
    24. Streuli, C. H., Bissell, M. J. Mammary epithelial cells, extracellular matrix, and gene expression. Cancer Treat Res. 53, 365-381 (1991).
    25. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. J Cell Biol. 129, 591-603 (1995).
    26. Boudreau, N., Sympson, C. J., Werb, Z., Bissell, M. J. Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix. Science. 267, 891-893 (1995).
    27. Pullan, S., et al. Requirement of basement membrane for the suppression of programmed cell death in mammary epithelium. J Cell Sci. 109, (Pt 3), 631-642 (1996).
    28. Schmidhauser, C., Bissell, M. J., Myers, C. A., Casperson, G. F. Extracellular matrix and hormones transcriptionally regulate bovine beta-casein 5' sequences in stably transfected mouse mammary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9118-9122 (1990).
    29. Streuli, C. H., et al. Stat5 as a target for regulation by extracellular matrix. J Biol Chem. 270, 21639-21644 (1995).
    30. Sollner, T., et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion. Nature. 362, 318-324 (1993).
    31. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
    32. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
    33. Sollner, T., Bennett, M. K., Whiteheart, S. W., Scheller, R. H., Rothman, J. E. A protein assembly-disassembly pathway in vitro that may correspond to sequential steps of synaptic vesicle docking, activation, and fusion. Cell. 75, 409-418 (1993).
    34. McNew, J. A. Regulation of SNARE-mediated membrane fusion during exocytosis. Chem Rev. 108, 1669-1686 (2008).
    35. Wang, C. C., et al. VAMP8/endobrevin as a general vesicular SNARE for regulated exocytosis of the exocrine system. Mol Biol Cell. 18, 1056-1063 (2007).
    36. Chat, S., et al. Characterisation of the potential SNARE proteins relevant to milk product release by mouse mammary epithelial cells. Eur J Cell Biol. 90, 401-413 (2011).
    37. Reinhardt, T. A., Lippolis, J. D. Bovine milk fat globule membrane proteome. J Dairy Res. 73, 406-416 (2006).
    38. Robenek, H., et al. Butyrophilin controls milk fat globule secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10385-10390 (2006).
    39. Fujimoto, T., Ohsaki, Y., Cheng, J., Suzuki, M., Shinohara, Y. Lipid droplets: a classic organelle with new outfits. Histochem Cell Biol. 130, 263-279 (2008).
    40. Mather, I. H., Keenan, T. W. Origin and secretion of milk lipids. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3, 259-273 (1998).
    41. Heid, H. W., Keenan, T. W. Intracellular origin and secretion of milk fat globules. Eur J Cell Biol. 84, 245-258 (2005).
    42. McManaman, J. L., Russell, T. D., Schaack, J., Orlicky, D. J., Robenek, H. Molecular determinants of milk lipid secretion. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 12, 259-268 (2007).
    43. de Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in mammary gland morphology and breast cancer risk in rats. Journal of visualized experiments : JoVE. (2010).
    44. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. Journal of visualized experiments : JoVE. (2011).
    45. Galio, L., et al. MicroRNA in the ovine mammary gland during early pregnancy: spatial and temporal expression of miR-21, miR-205, and miR-200. Physiol Genomics. 45, 151-161 (2013).
    46. Linzell, J. L., Peaker, M. The effects of oxytocin and milk removal on milk secretion in the goat. J Physiol. 216, 717-734 (1971).
    47. Knight, C. H., Peaker, M., Wilde, C. J. Local control of mammary development and function. Rev Reprod. 3, 104-112 (1998).
    48. Walid, M. S., Osborne, T. J., Robinson, J. S. Primary brain sarcoma or metastatic carcinoma? Indian J Cancer. 46, 174-175 (2009).
    49. Hue-Beauvais, C., et al. Localisation of caveolin in mammary tissue depends on cell type. Cell Tissue Res. 328, 521-536 (2007).
    50. McManaman, J. L., Neville, M. C. Mammary physiology and milk secretion. Adv Drug Deliv Rev. 55, 629-641 (2003).
    51. Mather, I. H., Jack, L. J. A review of the molecular and cellular biology of butyrophilin, the major protein of bovine milk fat globule membrane. J Dairy Sci. 76, 3832-3850 (1993).
    52. Heid, H. W., Winter, S., Bruder, G., Keenan, T. W., Jarasch, E. D. Butyrophilin, an apical plasma membrane-associated glycoprotein characteristic of lactating mammary glands of diverse species. Biochim Biophys Acta. 728, 228-238 (1983).
    53. Bock, J. B., Klumperman, J., Davanger, S., Scheller, R. H. Syntaxin 6 functions in trans-Golgi network vesicle trafficking. Mol Biol Cell. 8, 1261-1271 (1997).
    54. Tran, T. H., Zeng, Q., Hong, W. VAMP4 cycles from the cell surface to the trans-Golgi network via sorting and recycling endosomes. J Cell Sci. 120, 1028-1041 (2007).
    55. Wendler, F., Page, L., Urbe, S., Tooze, S. A. Homotypic fusion of immature secretory granules during maturation requires syntaxin 6. Mol Biol Cell. 12, 1699-1709 (2001).
    56. Wendler, F., Tooze, S. Syntaxin 6: the promiscuous behaviour of a SNARE protein. Traffic. 2, 606-611 (2001).
    57. Shitara, A., et al. VAMP4 is required to maintain the ribbon structure of the Golgi apparatus. Mol Cell Biochem. 380, 11-21 (2013).
    58. Thibault, C., Levasseur, M. C. La reproduction chez les mammifères et l'homme. INRA Editions. 928 (2001).
    59. Truchet, S., Wietzerbin, J., Debey, P. Mouse oocytes and preimplantation embryos bear the two sub-units of interferon-gamma receptor. Mol Reprod Dev. 60, 319-330 (2001).
    Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária
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    Honvo-Houéto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. J. Vis. Exp. (106), e53179, doi:10.3791/53179 (2015).More

    Honvo-Houéto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. J. Vis. Exp. (106), e53179, doi:10.3791/53179 (2015).

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