Abstract
检测低浓度的分子到单分子限制对如能早期发现疾病，并在分子的行为基础研究领域的影响。单分子检测技术通常利用诸如荧光标签或量子点，标签然而，标签不总是可用的，增加了成本和复杂性，并可能扰乱所研究的事件。光学谐振器已成为一个有前途的手段来检测单分子，而不使用标签。目前在溶液通过非plasmonically增强裸光谐振器系统检测到的最小的颗粒是25纳米的聚苯乙烯球1。我们已经开发了一种称为频率锁定光学花落逝谐振器（花），可以在水溶液中2超过这个限制，实现无标记单分子检测的技术。由于信号强度与尺度颗粒体积，我们的工作表示> 100X improveme核苷酸中的信号，以对现有技术的当前状态的噪声比（SNR）。这里后面FLOWER的程序都在努力提高在该领域的使用情况。
Introduction
单分子检测的实验是用于降低用于疾病的早期检测的分析物的生物传感器的使用量，是有用的，并且用于检查分子3的基本性质。这种实验是使用标签，但是，标签不总是能够获得对特定蛋白质，增加了成本，可能扰乱正在研究中的事件，并且可以是不方便，尤其是即时现场实验或点OF-典型地护理诊断。
目前金标准的无标记生物传感器是表面等离子体共振4，但是商业表面等离子体共振系统通常具有检测纳米的量级的典型下限。近日，光学谐振器已成为一个有前途的技术，无标签的单分子生物检测5。基于长期（NS）光学谐振器的工作光6,7限制。光是渐逝典型地通过光纤耦合到这些设备。当经过光纤的光的波长的谐振器的谐振波长相匹配时，点亮有效地耦合到谐振器。此耦合光谐振器的空腔中的谐振器的周附近产生的渐逝场中的全内反射。作为颗粒进入渐逝场和绑定到谐振器中，谐振器的变化成比例地粒子8的容积的谐振波长。
在检测能力方面，微谐振器前面已用于检测单个A型流感病毒颗粒（100纳米）9,10。最近，plasmonically增强微球的光学谐振器已经被用于检测的单牛血清白蛋白分子 11和8-mer的寡核苷酸12，但是这种方法限制了粒子捕捉区域至0.3μm2每日副。面积较大的捕捉生物传感器是理想的最大化粒子探测的机会。当前的解决方案为基础的无标记生物传感技术与大（> 100微米2）捕获的区域被限制于检测到聚苯乙烯颗粒≥25纳米。
我们已开发了一种基于光谐振器技术被称为频率锁定光学耳语倏逝谐振器（花）13（图1）一个无标记生物传感系统，其能够时间分辨单分子检测在溶液中的。花使用微型环光谐振器结合频率锁定反馈控制，平衡检测，并计算滤波以向下检测小颗粒以单个蛋白质分子的长光子寿命。使用频率锁定的允许系统始终跟踪微型环的移位共振作为颗粒结合，而无需扫或扫描激光波长过大范围。可以使用花的原理来增强的其他技术的检测能力包括电浆增强。在下文中，该程序用于执行FLOWER进行说明。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.实验装置和样品制备
- 使用光刻，蚀刻和如先前6所述熔化过程制造microtoroids。制造上的硅晶片（芯片）的顶部microtoroids通常具有80-100微米的大直径，以及2微米的小直径。
- 放松大致从它的纤维卷轴的米单模光纤（125微米包层，4.3微米的模场直径）。
- 在光纤的开卷部分的中间，剥去光纤使用剥线围绕聚合物涂层的一小部分（2.5厘米）。注意：这是光纤，其将被用来渐逝地将光耦合到所述微型环的部分。
- 清洁剥离的纤维用异丙醇酒精和无尘擦拭。
- 持使用由磁性压块的一个光纤夹持该部分的纤维就位。
- 薄的剥离纤维〜500nm下meltin克，并用氢气火炬和两个步进电机在相反的方向移动，在60微米/分钟牵引。光纤定位火焰的顶端部，它应该是约10毫米高的内部。停止拉光纤时通过光纤传输将停止脉动，它可以通过视觉监视（通过观察即从纤维眨眼侧向散射和关闭光），或通过光纤连接到其连接到示波器的光电二极管。
- 切割光纤的一端，并把它插入到裸光纤适配器。放置光纤的这一端进入光接收器的输入端。
- 纤维耦合光纤线轴到激光的通过使用一个光纤耦合器的另一端。
- 放置使用任一环氧树脂或双面胶带的微型环芯片上的样品架的顶部（不锈钢，37.8毫米×6.4毫米×3.2毫米）。
- 装入样品支架上的定位台，其包括3轴纳米定位的顶部（正anocube）阶段（参照设备列表）上的3轴千分尺的顶部。执行一个气动隔离光表中的所有实验，以减少震动。
- 粗略位置使用3轴千分尺的样品芯片。
- 对准芯片平行于光纤使用纳米定位器的含微型环-。注意：输入光（〜633纳米）中的一个波长的距离内对齐微型环。为这一过程的可视化使用两个成像列（管与物镜和相机，见设备清单），其定位在顶部和在芯片的一侧。
- 优化通过光纤使用一种在线偏振控制器引导所述激光的偏振（见设备列表）与旋钮调节极化。注意：当在光纤的传输所测量的倾角出现最窄最佳偏振的实现。注意这浸在示波器（详情参见步骤2.2）。
- 构造通过环氧树脂将玻璃盖玻片上使用玻璃显微镜载玻片作为间隔物样品台上的样品室。注：有机玻璃外壳覆盖了整个安装程序可能最大限度地减少气流非常有用。一个小的开放应该留给允许的解决方案中使用管道进行抽水。
- 热平衡粒子混悬液或单分子水溶液为≥1小时在室温水浴（〜500毫升）。注：样品使用从制造商， 例如 ，PBS或HEPES中指定的相关联的缓冲器稀释至所需浓度在微量离心管中。如果没有检测到结合事件，增加缓冲液的盐浓度。
- 含有溶液（1毫升）中简要地为〜2秒涡旋粒子。
- 注入含粒子溶液到样本室以1ml / min，使用1ml注射器泵。
- 后样品室填补，关闭注射器泵。
- 等待30秒前记录数据，以减少从流体流动会影响测量所得的机械振动的影响。
2.频率锁定
- 重新耦合圆环到光纤通过移动样品支架与纳米定位，因为耦合将因受到干扰到注射液。
- 由通过各种波长的扫描计算机控制的输入激光定位微型环的谐振波长。执行此步骤通过发送一个三角波电压信号，以调整所述激光的波长的激光控制器内的压电元件。执行使用可见光（635纳米±2.5纳米），因为是光在水在此波长吸收少的实验。
- 通过插入的光纤的输出入一个自动均衡光器测量的光透射通过光纤。插入受光的输出转换成使用BNC电缆的示波器。观察Øn中的示波器，在该微型环的谐振波长，通过光纤传输下降。
- 附加光接收器的输出对所述频率通过电缆锁定反馈控制器（见设备清单）的主输入端。
- 采用顶级的高峰期为2 kHz的抖动频率和19个FM波长振荡的幅度锁定在运行模式下自动锁定的频率锁定反馈控制器。经验设定在使用齐格勒- Nichols整定规则14的软件窗口的比例-积分-导数设置。注意：这些值只需要在所有实验的开始设置一次。
- 自动锁定激光器的波长到微型环的谐振波长。执行填充样品室之后此步骤。注意：如果波长偏移过大，则反馈控制器将失去锁定并自动切换到扫描模式以找到谐振波长位置。这OC小人的波长偏移超过约一线宽（至少600 FM这里考察的所有系统）放大。
- 使用24位数据采集卡上记录所述反馈控制器的输出在20千赫。导出的数据，经由数据采集软件的文本文件。
3.数据处理和分析
- 傅立叶变换在MATLAB中的数据。
- 低通使用“砖墙”滤波器的截止在1 kHz，除去2千赫强加抖动频率的数据（见补充代码文件截图1）。
- 采用16赫兹的窗口大小计算陷波滤波器的数据。注意：这样做是为了除去已知噪声源，在这种情况下，60赫兹电子线路噪声和谐波，以及100赫兹（从激光驱动未来）和它的谐波（见补充编码文件截图1）。
- 逆傅立叶变换的数据回时域。
- 值滤波器使用窗口中的数据1,001样品尺寸（见补充代码文件截图2）。
- 定位使用Kerssemakers 等人 15的步骤寻找算法步骤中的变化谐振波长。
- 生成每个结合步骤的幅度的直方图。
- 使用公式计算粒径。 （1）（见讨论）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
粒子结合事件清楚地视为阶梯状变化微型环的谐振波长随时间（图2A）。这些步骤的高度被示为在图2B中的直方图。 图2-4示出从外来体的结合代表迹线（纳米囊泡），5纳米二氧化硅珠，和单人白细胞介素2分子，分别。该阶梯状的事件比例与粒径的事实表明，该技术已被正确地执行。这可以通过产生的台阶高度（图2B）的直方图和比较观察到的理论预测的最大台阶高度进行分析，如下面讨论的。
环形感应系统的 图1. 框图。从调谐二极管激光光被分W¯¯第i通过光纤耦合光进入环形，并直接发送到一个自动均衡光器的一个输入端的另一部分中发送的部分。该光纤的输出被发送到自动平衡光接收器的第二输入。光接收器的输出被发送到调制该激光定位微型环的共振波长的值的反馈控制器。作为粒子结合于环形，共振频率偏移。激光的波长和微型环的谐振波长之间的差被发送到比例-积分-微分控制器，其允许激光尽可能快圆环的波长匹配和尽可能顺利。 请按此查看大版本这个数字。
p_upload / 53180 / 53180fig2.jpg“/>
随着时间的推移20纳米珠子结合到微型环的表面 图2. 共振波长的变化。（A）的移位的微型环的谐振波长随着时间的推移20纳米珠子结合到表面。高度的每个谐振波长一步事件（振幅）（二）直方图。 请点击此处查看该图的放大版本。
随着时间的推移作为单个外来体结合到微型环的表面上。图3的共振波长的变化。个别结合事件被视为随着时间的推移离散变化（步骤）中的谐振波长。“>点击此处查看该图的放大版本。
随着时间的推移5nm的硅珠图4.共振波长变化结合到微型环的表面上。颗粒通过被动吸附粘附在环形表面。粒子结合事件被视为在环形随时间的谐振波长离散的步骤。粒子解吸被看作是一个向下的台阶。 请点击此处查看该图的放大版本。
随着时间的推移，IL-2分子图5.共振波长变化结合到微型环的表面上。大分子结合事件被看作是在谐振波长随着时间的推移离散的步骤。这些步骤看起来类似于在图4中的两种类型的颗粒是大致相同的尺寸。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
作为粒子结合，的环形增大的谐振波长 （λ）。如果粒子解除绑定，谐振波长相应减少（降压事件）。粒径（d）可以通过各波长步骤的幅度的直方图来确定。每个波长台阶的高度而变化，由于结合的粒子的尺寸变化和由于对那里的粒子结合的微型环的位置。当颗粒粘合在微型环其中电场（E 0，max）为最高的赤道在共振波长（步骤高度）的最大变化发生。这个最大阶梯高度（Δλ）是相关的粒径通过公式（1）8， 其中 a是颗粒半径，D是根据绑定粒子的折射和其周围介质的折射率的介电常数，V m是二极管灯的模体积的微型环内吨通过有限元模拟2来确定， 以及 E 0（R s）是电场在粒子赤道通过有限元模拟还确定的幅度：
反转式。 （1）表示的信号强度（Δλ）秤与颗粒体积（3）。我们的介电系数定义为：
其中是折射周围介质的折射率，并且是指数折射颗粒。基于式（1）以及额外的直方图和大小校准为粒径理论估计算结果列于2，16。
花可以通过增加在其频率锁定反馈控制器跟踪微型环的波长的频率进行修改快速跟踪。数据处理过程可以通过使用移动平均，而不是中值滤波器进行修改，结合事件仍可以恢复，但中值滤波器使台阶边缘是较好的保存。这种技术的局限性包括事实的微型环的颗粒时结合波长偏移取决于那里的谐振器的粒子土地。因此，确认的单个颗粒的结合的依赖于许多离散的结合事件的直方图的生成。如果没有检测到不同的结合事件，增加了溶剂的盐浓度有所帮助。
这种技术对于现有方法的意义在于，没有需要标签来询问目标分子。然而，选择性结合需要官能与抗体的传感器。其它的优点包括这样的事实，由于微型环谐振器具有更大的捕获区相比，高灵敏度的表面等离子体共振方法，粒子结合事件更可能发生。此外，由于花并不要求可光漂白荧光标签，花能够长（> 10秒）测量具有快速（毫秒）的时间分辨率。
在协议中的关键步骤包括对准光纤锥与微型环。一旦环形浸渍于通过液体的纤维的液体，运动过多可能导致锥形断裂，从而结束了实验。花目前的措词，因此不适合在小时的时间规模实验。此外，一旦微型环一直沉浸在液体和颗粒结合，所述品质因数（Q）无可挽回滴过的小时和峰值升时间尺度ocking最终可能会变得不稳定。在这种情况下，一个新的设备是必需的。因为我们抖动我们的激光频率在一个很小的范围内围绕共振峰，花不同时在整个共振谱扫描，因此不测量实时质量变化因素，因为颗粒结合。综观之前，只有少数颗粒的结合后的品质因数，我们没有看到显著Q因子的降解。我们预期这是因为原来的原始环形具有相对低的Q因数（载Q中的〜1×10 5 -5×10 6的水）。
我们注意到，激光诱导波动噪声中减去出使用自动平衡光器。我们通过将光纤直接接触的微型环尽量减少光纤对环形的波动。此外，如果PID参数设置不正确，波动就会出现，也就是说，系统将不会快速accurat伊利轨道波长偏移。齐格勒-尼科尔斯调整规则，可以用来设置正确的PID设定14。按照此处列出的步骤，它应该是能够检测和尺寸的纳米粒子，从几百纳米至几纳米，包括单一的生物分子。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
- Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
- Su, J., Goldberg, A. F. G., Stoltz, B. Label-free detection of single nanoparticles and biological molecules using microtoroid optical resonators. Light: Science and Applications. , (2016).
- Knight, A. Single molecule biology. , Elsevier/Academic. (2009).
- Jonsson, U., et al. Real-time biospecific interaction analysis using surface plasmon resonance and a sensor chip technology. BioTechniques. 11, 620-627 (1991).
- Vollmer, F., Arnold, S. Whispering-gallery-mode biosensing: label-free detection down to single molecules. Nat. Methods. 5, 591-596 (2008).
- Armani, D. K., Kippenberg, T. J., Spillane, S. M., Vahala, K. J. Ultra-high-Q toroid microcavity on a chip. Nature. 421, 925-928 (2003).
- Vahala, K. J. Optical microcavities. Nature. 424, 839-846 (2003).
- Arnold, S., Khoshsima, M., Teraoka, I., Holler, S., Vollmer, F. Shift of whispering-gallery modes in microspheres by protein adsorption. Opt. Lett. 28, 272-274 (2003).
- Vollmer, F., Arnold, S., Keng, D. Single virus detection from the reactive shift of a whispering-gallery mode. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 20701-20704 (2008).
- He, L., Ozdemir, S. K., Zhu, J., Kim, W., Yang, L. Detecting single viruses and nanoparticles using whispering gallery microlasers. Nat Nano. 6, 428-432 (2011).
- Dantham, V. R., et al. Label-free detection of single protein using a nanoplasmonic-photonic hybrid microcavity. Nano Lett. 13, 3347-3351 (2013).
- Baaske, M. D., Foreman, M. R., Vollmer, F. Single-molecule nucleic acid interactions monitored on a label-free microcavity biosensor platform. Nat Nanotechnol. 9, 933-939 (2014).
- Su, J. Label-Free Single Exosome Detection Using Frequency-Locked Microtoroid Optical Resonators. ACS Photonics. (9), 1241-1245 (2015).
- Åström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems : an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2008).
- Kerssemakers, J. W., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442, 709-712 (2006).
- Su, T. -T. J. Label-free detection of single biological molecules using microtoroid optical resonators. , California Institute of Technology. (2014).
