Abstract
ダウン単一分子の限界に分子の低濃度を検出することは、そのような疾患の早期発見、および分子の挙動に関する基礎的研究などの分野に影響を与えています。単一分子検出技術は、一般に、蛍光タグまたは量子ドットなどのラベルを使用し、しかし、ラベルは常に利用可能ではない、コストと複雑さが増大し、研究されているイベントを乱すことができます。光共振器は、ラベルを使用せずに単一分子を検出するための有望な手段として浮上しています。現在、溶液中の非plasmonically増強裸光共振器システムによって検出された最小粒子が25nmのポリスチレン球1です。私たちは、この制限を超えると水溶液2のラベルフリーの単一分子検出を達成することができ、周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー）と呼ばれる技術を開発しました。信号強度は粒子体積に比例するように、私たちの仕事は、> 100倍improvemeを表しNT現在の技術水準を超える信号対雑音比（SNR）です。ここFLOWERの背後にある手順は、フィールドでの使用を高めるために提示されています。
Introduction
単一分子検出実験は、疾患の早期発見のために、及び分子 3の基本特性を調べるために、バイオセンサーに使用される分析物の量を減少させるために有用です。このような実験は通常、ラベルを使用して実行されますが、ラベルは、特定のタンパク質を得ることが常に可能ではない、コストを増加させ、オンサイト実験やポイント・オブ・イベントが検討されて乱すことができ、かつ不便であることができ、特にリアルタイムのためのケア診断。
無標識バイオセンシングのための現在のゴールドスタンダードは、表面プラズモン共鳴4であり、ただし、商業表面プラズモン共鳴システムは、典型的には、nMの程度の検出の典型的な下限を有します。最近では、光共振器は、ラベルフリー単一分子の生物学的検出のための5有望な技術として浮上しています。光共振器は、光6,7の長期（NS）閉じ込めに基づいて動作します。光がエバネッセントです一般的に光ファイバを介してこれらのデバイスに結合されました。光ファイバを通過する光の波長が共振器の共振波長と一致すると、共振器に効率的にカップルを点灯。この結合された光は、全内部共振器の周付近にエバネッセント場を発生させる共振器の空洞内に反映されます。粒子は、共振器、 粒子 8の体積に比例して共振器の変化の共振波長にエバネセント場とバインドを入力します。
検出能力の点で、微小球共振器は、以前の（100 nm）の9,10ウイルス粒子の単一のインフルエンザを検出するために使用されてきました。最近、plasmonically増強微小球光共振器は、 分子 11と8マーのオリゴヌクレオチド12を 、単一のウシ血清アルブミンを検出するために使用されている、しかし、このアプローチは、デ0.3ミクロン2に粒子捕捉領域を制限します副。大きなキャプチャエリアのバイオセンサーは、粒子検出の可能性を最大化するための理想的です。 （> 100μmの2）大と現在のソリューションベースのラベルフリーバイオセンシング技術領域をキャプチャポリスチレン粒子≥25 nmの検出に限られていました。
我々は、溶液中の単一分子の時間分解検出が可能な周波数ロック光ウィスパリングエバネッセント共振器（フラワー）13（ 図1）として知られている光共振器技術に基づくラベルフリーバイオセンシングシステムを開発しました。花がダウンして、単一のタンパク質分子に小さな粒子を検出するために、周波数ロックフィードバック制御、バランス検出、計算フィルタリングと組み合わせたマイクロトロイドの光共振器の長い光子寿命を使用しています。周波数ロックの使用は、掃引またはレーザ波長を走査する必要なしに、粒子を結合するように、システムは、常に、マイクロトロイドのシフト共鳴を追跡することができ大規模な範囲です。 FLOWERの原理は、プラズモン増強を含む他の技術の検出能力を向上させるために使用することができます。以下では、FLOWERを実行するための手順が記載されています。
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Protocol
1。実験のセットアップとサンプルの調製
- 以前に6説明したように、リソグラフィ、エッチング、および融解手順を使用して、マイクロトロイドを製作。一般的に80〜100ミクロンの主要な直径を有するシリコンウェハ（チップ）の上にマイクロトロイドを製作し、2μmの短径。
- その繊維スプールからおよそシングルモード光ファイバ（125μmのクラッド、4.3ミクロンのモードフィールド径）のメーターをおくつろぎください。
- 光ファイバの巻き出し部分の途中に、ワイヤーストリッパーを使用して光ファイバの周りにポリマーコーティングの小部分（2.5センチ）ストリップ。注：これは、マイクロトロイドにエバネッセント光を結合するために使用される光ファイバの一部です。
- イソプロパノールアルコールとフリーワイプリントでストリップ繊維をきれいにしてください。
- 磁気クランプ製のファイバホルダを使用して所定の位置に光ファイバのこの部分を持ってください。
- MELTINによって〜500 nmの薄い取り除か繊維グラム水素トーチ60ミクロン/分の速度で反対方向に動く2ステッピングモータを使用して引っ張ります。 〜10ミリメートル背が高くあるべきである炎の上部、内部に光ファイバを配置します。ファイバを通して送信は（オフに繊維点滅から横方向に散乱した光を見て）、またはオシロスコープに接続されているフォトダイオードに光ファイバを接続することにより、視覚的に監視することのできる、変動停止したときに、繊維を引っ張って停止。
- 光ファイバの一端を切断し、裸ファイバアダプタに挿入します。受光の入力に繊維のこの端を置きます。
- 光ファイバカプラを使用してレーザーのファイバーカップル繊維スプールのもう一方の端を。
- エポキシ又は両面テープのいずれかを使用して試料ホルダーの上にマイクロトロイドチップ（ステンレス鋼37.8ミリメートル×6.4ミリメートルX 3.2ミリメートル）を配置します。
- 3軸ナノポジショニング（Nで構成位置決めステージの上に試料ホルダーをマウント3軸マイクロメータの上anocube）ステージ（機器リストを参照してください）。振動を最小限に抑えるために、空気圧で分離された光学テーブル上のすべての実験を行います。
- 粗位置3軸マイクロメータを使用して、サンプルチップ。
- ナノポジショナーを使用して光ファイバにマイクロトロイド含有チップ並列の位置を合わせます。注：入力光（〜633 nm）での1波長の距離内にマイクロトロイドの位置を合わせます。このプロセスの可視化のための2つの撮像列使用上、チップの側に位置する（対物レンズとカメラとチューブを、機器リストを参照してください）。
- 偏光を調整するつまみで（機器のリストを参照）、インライン偏光制御器を用いた光ファイバを介して照射されるレーザ光の偏光を最適化します。注意：光ファイバの伝送で測定されたディップが狭く表示されたときに最適な偏光が達成されます。 （詳細については、ステップ2.2を参照）、オシロスコープ上でこのディップを守ってください。
- 構成しますスペーサーとしてガラス顕微鏡スライドを用いて、試料ステージの上にカバーガラスをepoxyingにより試料室。注：全体のセットアップを覆うプレキシグラスエンクロージャは、空気の流れを最小化するために有用であり得ます。小さな開口部は、チューブを使用してポンピングするためのソリューションを可能にするようにしておく必要があります。
- 熱RT水浴（〜500 mL）中≥1時間粒子懸濁液または単一分子の水性溶液を平衡化。注：サンプルは、メーカー、 例えば 、PBSまたはHEPESから指定された関連したバッファを使用してマイクロ遠心チューブに所望の濃度に希釈します。いかなる結合事象が検出されない場合、緩衝液の塩濃度を増加させます。
- 〜2秒のためのソリューション（1ミリリットル）を簡単に含む渦粒子。
- 1mlシリンジポンプを用いて1ml /分で試料チャンバに溶液を含む粒子を注入します。
- 試料室を充填した後、シリンジポンプをオフにします。
- 最小限に抑えるために、データを記録する前に30秒待ってください測定に影響を与えることができ、流体の流れに起因する機械的振動の影響。
2.周波数のロック
- カップリングが原因で流体の注入に邪魔されるため、ナノポジショナーと試料ホルダーを移動させることにより、光ファイバに再結合しトロイド。
- 様々な波長を介してコンピュータ制御入力レーザを走査することにより、マイクロトロイドの共振波長の位置を確認します。レーザの波長を調整するレーザコントローラ内の圧電素子に三角波電圧信号を送信することによって、この手順を実行します。この波長での水の光の低い吸収があるため、可視光（2.5 nmの±635 nm）を用いた実験を行います。
- オートバランス受光に光ファイバの出力を接続することにより、光ファイバを介して光透過率を測定します。 BNCケーブルを使用して、オシロスコープに受光の出力を接続します。 O観察nはマイクロトロイドの共振波長において、光ファイバを介して伝送が低下オシロスコープ。
- ケーブルを介して（機器のリストを参照）、周波数ロックフィードバック制御装置の主入力に受光の出力を接続します。
- 2 kHzから19 FMの波長振動の振幅のディザリング周波数を持つトップのピークロックを使用して、オートロックモードでフィードバック制御をロックする周波数を実行します。経験的に、チーグラー・ニコルスのチューニング規則14を使用して、ソフトウェアのウィンドウで、比例・積分・微分設定値を設定します。注：これらの値は、すべての実験の開始時に一度設定するだけで済みます。
- マイクロトロイドの共振波長に対するレーザの波長を自動ロック。試料室を充填した後、この手順を実行します。注：波長シフトが大きすぎる場合には、フィードバック制御がロックを失うことになると自動的に共振波長の位置を見つけるために走査モードに切り替えます。このOC波長に対するCURSは約1線幅（ここでは調査したすべてのシステムのために少なくとも600 FM）よりも大きくシフトします。
- 24ビットのデータ・アクイジション・カードを使用して、20 kHzでフィードバック制御器の出力を記録します。データ収集ソフトを経由してテキストファイルとしてデータをエクスポートします。
3.データ処理と解析
- フーリエ変換は、MATLABのデータを変換します。
- ローは、2 kHzで課されるディザ周波数を除去するために、1 kHzでカットオフを持つ「ブリックウォール」フィルターを使用してデータを渡す（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）。
- 計算ノッチ16ヘルツのウィンドウサイズを使用してデータをフィルタリングします。注意：これは、この場合には、ノイズの既知のソースを除去するために行われ、60 Hzの電子線ノイズとその高調波、（レーザドライバからの）だけでなく、100ヘルツとその高調波（補足コードスクリーンショット1ファイルを参照してください）。
- 逆フーリエ変換は、時間領域に戻ってデータを変換します。
- メディアンフィルタウィンドウを使用してデータ1,001サンプルの大きさ（補足コードはスクリーンショット2ファイルを参照してください）。
- Kerssemakers ら 15のステップ発見アルゴリズムを用いて、共振波長のステップ変化を探します。
- 各結合工程の振幅のヒストグラムを生成します。
- 式を使用して粒子サイズを計算します。 （1）（説明を参照）。
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Representative Results
粒子結合事象は明らかに時間をかけてマイクロトロイドの共振波長の階段状の変化（ 図2A）と見られています。これらのステップの高さは。 図2Bのグラフとして示さ2-4はそれぞれ、代表エキソソームの結合からのトレース（nanovesicles）、5 nmのシリカビーズ、および単一のヒトインターロイキン2分子を示しています。階段状のイベントは、粒子サイズにスケーリングするということは、技術が正しく行われたことを示しています。以下に説明するように、これは、ステップの高さ（ 図2B）のヒストグラムを生成し、理論的な予測に観察された最大ステップ高さを比較することによって分析することができます。
トロイドセンシングシステムの 図1 のブロック図。波長可変ダイオードレーザーからの光はワット分割されカップルがトロイドとオートバランス受光の一方の入力に直接送られ、他の部分に光を光ファイバを介して送信される部分番目。光ファイバの出力はオートバランス受光の第二の入力に送信されます。受光器の出力は、マイクロトロイドの共振波長の値を検索するために、レーザ光を変調フィードバック制御装置に送信されます。粒子は、トロイド、共振周波数シフトに結合しています。レーザの波長とマイクロトロイドの共振波長との差は、レーザーが早くかつできるだけスムーズトロイドの波長を合わせることができ、比例・積分・微分コントローラに送信されます。 拡大表示はこちらをクリックしてくださいこの図のバージョン。
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図 経時 2 共鳴波長の変化を20nmのビーズは、マイクロトロイドの表面に結合するように経時マイクロトロイドの共振波長における（A）シフトは20nmビーズが表 面に結合します。 （B）それぞれの共振波長ステップイベントの高さ（振幅）のヒストグラム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
時間の経過とともに図3.共鳴波長変化個々のエキソソームは、マイクロトロイドの表面に結合している。個々の結合事象は、時間の経過とともに、共振波長の離散的な変化（ステップ）と見られています。">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
5 nmのシリカビーズのような時間をかけて、図4共振波長の変化は、マイクロトロイドの表面に結合する。粒子は、受動的吸着を介しトロイドの表面に付着します。粒子結合事象は、時間の経過にトロイドの共振波長の離散的なステップとして見られています。粒子の脱着は下向きのステップとして見られている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
IL-2分子のような時間をかけて、図5共振波長の変化は、マイクロトロイドの表面に結合する。高分子結合事象を時間をかけて、共振波長の離散的なステップとして見られています。これらのステップは、2種類の粒子がほぼ同じサイズであるとして、図4のものと似ています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
粒子が結合するように、トロイドは増加の共鳴波長（λ）。粒子がアンバインドした場合、共振波長は、それに応じて（ステップダウンイベント）を減少させます。粒子径（d）は、各波長ステップの振幅のヒストグラムを介して決定することができます。各波長ステップの高さは、結合した粒子の大きさの変化に起因し、粒子が結合マイクロトロイドの位置により変化。粒子が電界（E 0、MAX）は最大でマイクロトロイドの赤道に結合すると共鳴波長（ステップ高さ）の最大変化が起こります。この最大ステップ高さ（Δλ）は 、式を通じて粒子径に関連しています。 （1）8、粒子半径であり、Dは、結合した粒子の屈折率と周囲の媒体に基づいて、誘電率、V mはガーゼのモード体積でありますマイクロトロイドの中tは、有限要素シミュレーション2を通じて決定し、E 0（R s）はまた、有限要素シミュレーションを介して決定粒子赤道での電界の振幅であり：
式を反転。 （1）信号強度（Δλ）は粒子体積（3）に比例することを示しています。私たちの誘電率は以下のように定義されます：
ここで、周囲の媒体の屈折率であり、粒子の屈折率の屈折率です。式（1）と同様に、追加のヒストグラムおよびサイズ的に基づいて、粒子サイズの理論的見積もりculationsは、16 2に示されています。
FLOWERは、フィードバックコントローラをロックする周波数は、マイクロトロイドの波長を追跡する頻度を増加させることによって、より高速な追跡のために変更することができます。しかしながら、メディアンフィルタは、ステップエッジがよりよく保存されるようになり、データ処理の手順ではなく、メディアンフィルタの移動平均を使用して変更することができ、そして結合事象がまだ回復させることができます。この技術の制限は、粒子結合の際にマイクロトロイドの波長シフトがどこに共振器の粒子の土地に依存するという事実があります。このように、単一の粒子の結合の確認は、多くの別々の結合事象のヒストグラムの生成に依存しています。明確な結合事象が検出されない場合、溶媒の塩濃度を増加させることに役立ちます。
既存の方法に関して、この技術の重要性にはラベルが標的分子を調べるために必要とされないことです。選択的結合は、しかし、抗体を用いたセンサーを官能必要です。他の利点は、マイクロトロイドの共振器は高感度表面プラズモン共鳴法に比べてより大きな捕捉面積を有するので、粒子結合事象が発生する可能性が高いという事実が挙げられます。花は光退色も蛍光タグを必要としないためまた、花は高速（ミリ秒）の時間分解能で長い（> 10秒）の測定が可能です。
プロトコル内の重要なステップは、マイクロトロイドと光ファイバテーパを揃えるあります。トロイドを液体中に浸漬されると、液体を介して繊維のあまり動きは、このような実験を終了する、破壊するテーパーを引き起こす可能性があります。現在の製剤中の花は時間の時間スケールでの実験のために不適当です。マイクロトロイドを液体に浸漬した粒子が結合された後に加えて、品質係数（Q）は、回復不可能時間ピークLの時間スケールにわたって低下しますockingは、最終的に不安定になることがあります。この状況では、新しいデバイスが必要とされます。私たちは、共振ピークの周りに非常に小さな範囲で、当社のレーザ周波数をディザリングするので、花が同時に全体の共鳴スペクトルを横切って走査されず、粒子が結合しそのため、リアルタイムでの品質係数の変化を測定しません。前とわずか数粒子の結合後の品質係数を見ると、私たちはかなりのQ値の低下が表示されません。我々は、元の自然のままのトロイドが比較的低いQ値（〜1×10 5 -5x10 6の水にロードされたQ）を持っているので、これがあることを期待しています。
我々は、レーザー誘起変動ノイズが自動バランス受光を用いて差し引かれることに注意してください。私たちは、直接接触してマイクロトロイドの繊維を配置することによって、トロイドに対する光ファイバの変動を最小限に抑えることができます。 PIDパラメータが正しく設定されていない場合はさらに、変動は、 すなわち 、表示されますシステムしません迅速かつaccuratエリー波長シフトを追跡します。チーグラー・ニコルスチューニングルールが正しくPID設定値14を設定するために使用することができます。ここで概説した手順に従うことで、それは数百ナノメートルから単一の生物学的分子を含む、数ナノメートル、まで及ぶナノ粒子を検出し、サイズが可能であるべきです。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tunable diode laser | Newport | TLB-6300 | |
| Laser controller | Newport | TLB-6300-LN | |
| Frequency locking feedback controller | Toptica Photonics | Digilock 110 | |
| Auto-balanced photoreceiver | Newport | Model 2007 | |
| In-line polarization controller | General Photonics | PLC-003-S-90 | |
| 24-bit data acquisition card | National Instruments | NI-PCI-4461 | |
| Recombinant human interleukin-2 | Pierce Biotechnology | R201520 | |
| 20 nm polystyrene beads | Thermo Scientific | 3020A | |
| NanoCube XYZ Piezo Stage | Physik Instrumente | P-611.3 | |
| Optical table | Newport | VH3660W-OPT | |
| Objective lens for imaging column | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| Imaging column (adaptor tube) | Navitar Machine Vision | 1-60228 | |
| High-Res CCD camera for imaging column | Edmund Industrial Optics | NT39244 |
References
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