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Bioengineering

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Published: December 29, 2015 doi: 10.3791/53180

Abstract

아래로 단일 분자 한계 분자의 작은 농도를 검출하는 것은 이러한 질병의 조기 발견 및 분자의 행동에 기초 연구 등의 분야에 영향을 미친다. 단일 분자 검출 기술은 일반적 그러나, 라벨 비용 및 복잡성을 증가, 항상 사용할 수 없으며, 이벤트가 연구되고있다 교란 형광 태그 또는 양자점과 같은 라벨을 사용한다. 광학 공진기는 라벨의 사용없이 하나의 분자를 검출하는 수단으로서 유망 나왔다. 현재 용액에 비 plasmonically 향상된 베어 광 공진기 장치에 의해 검출 된 가장 작은 입자는 25 nm의 폴리스티렌 구 1이다. 우리는 위스퍼 에바 네 센트 광 공진기 수용액 2 라벨없는 단일 분자 검출이 한계를 능가 달성 (FLOWER)를 잠그기 주파수로 알려진 기술을 개발했다. 신호 강도가 입자 볼륨 확장, 우리의 작품은> 100 배의 양식 개선을 나타냅니다NT 기술의 현재 상태 위에 잡음비 (SNR)에 신호한다. 여기 FLOWER 뒤에 절차 야전에서의 사용을 증가시키기위한 노력으로 제시된다.

Introduction

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단일 분자 검출 실험은 질병의 조기 진단을위한 바이오 센서에 사용되는 분석 물의 양을 감소시키는 데 유용하며, 분자 (3)의 기본 특성을 조사하기위한. 이러한 실험은 일반적으로 라벨 그러나, 라벨은 항상 이벤트가 검토되고 교란 수, 비용 증가, 특정 단백질을 얻을 수없고, 특히 현장 실험 또는 포인트 외 실시간 들면 불편할 수있다하여 수행 의료 진단.

라벨없는 바이오 센서에 대한 현재 금 표준 그러나 상업적 표면 플라즈몬 공명 시스템은 전형적 nm 인 검출 순서에 전형적인 하한을 가지고, 표면 플라즈몬 공명 (4)이다. 최근, 광 공진기는 라벨이없는 단일 분자 biodetection 5 유망 기술로 등장했다. 장기 (NS)에 기초하여 광 공진기 일 -6,7-의 광 가둠. 빛은 순간적이다일반적으로, 광섬유를 통해 이러한 장치에 연결된다. 섬유 거치지 광의 파장 공진기의 공진 파장과 일치 할 때, 효율적으로 공진기에 커플 빛. 이 결합 된 광은 완전히 내부 공진기의 둘레 근방에 소 산장을 발생 공진기의 공동 내에 반영한다. 입자는 공진기, 입자 (8)의 체적에 비례하여 변화 공진기의 공진 파장 산장 인드에 진입.

검출 능력의 관점에서, 미세 공진기 이전 단일에게 인플루엔자 바이러스 입자 (100 ㎚) 9,10 검출하는데 사용되어왔다. 최근 plasmonically 향상된 미세 광학 공진기 그러나이 접근법은 드 0.3 μm의 (2)에 입자 포획 영역을 제한하고, 분자 (11) 및 8 량체 올리고 12 알부민 단일 소 혈청을 검출하는데 사용되어왔다바이스. 큰 캡처 영역 바이오 센서는 입자 검출의 가능성을 최대화 이상적이다. 큰 (> 100 μm의 2) 캡쳐 영역과 현재 솔루션 기반의 라벨없는 바이오 센싱 기술은 폴리스티렌 입자를 ≥ 25 nm의 검출에 한정되어있다.

우리는 용액 중의 분자의 단일 시간 - 분해 검출 할 수있는 에바 네 슨트 광 위스퍼 링 공진기 (FLOWER) (13) (도 1)을 잠그기 주파수라고도 광 공진기 기술 기반의 라벨없는 바이오 센싱 시스템을 개발 하였다. FLOWER 주파수 로크 피드백 제어, 평형 검출 한 단일 단백질 분자로 내려 작은 입자를 검출하는 필터링 연산과 결합 microtoroid 광학 공진기의 길이 광자 수명을 이용한다. 주파수 록의 이용은 스위프 또는 레이저 파장을 스캐닝 할 필요없이, 입자 결합으로 시스템이 항상 microtoroid의 이동 공명을 추적 할 수 있도록큰 범위. 꽃의 원리 플라즈몬 강화를 포함하는 다른 기법의 검출 능력을 향상시키기 위해 사용될 수있다. 다음 것에서, FLOWER를 행하는 절차를 설명한다.

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Protocol

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1. 실험 설정 및 샘플 준비

  1. 리소그래피를 사용하여 에칭하고, 이전에 설명 된 바와 같이 6 과정을 용융 microtoroids를 제작. 일반적으로 80 내지 100 ㎛의 주요 직경, 2 ㎛의 작은 직경을 갖는 실리콘 웨이퍼 (칩)의 상단에 microtoroids를 제작.
  2. 대략의 섬유 스풀에서 단일 모드 광섬유 (125 μm의 클래딩, 4.3 μm의 모드 필드 직경)의 미터 긴장을 풀고.
  3. 광섬유의 풀린 부분의 중간에, 와이어 스트리퍼를 사용하여 광 화이버의 주위에 폴리머 코팅재의 작은 세그먼트 (2.5 cm)를 스트립. 주 :이 microtoroid 순간적으로 커플 광에 사용되는 광섬유의 부분이다.
  4. 이소프로판올 알코올과 무료로 닦아 보풀 제거 섬유를 청소합니다.
  5. 자기 클램프로 만든 섬유 홀더를 사용하는 대신에 섬유의이 부분을 잡으십시오.
  6. meltin으로 ~ 500 nm의 얇은 스트립 섬유g 및 수소 토치가 60㎛ / 분에서 서로 반대 방향으로 움직이는 두 개의 스텝퍼 모터를 사용하여 당기는. ~ 10mm 높이 있어야 화염의 상부 내부에 광섬유를 위치. 광섬유를 통해 전송이 (오프 섬유 점멸로부터 측 방향으로 산란되는 광을 보면서)이나 오실로스코프에 연결된 포토 다이오드에 섬유를 연결하여 시각적으로 감시 할 수있는 요동 정지시 섬유 당기는 중지 .
  7. 광섬유의 한쪽 끝을 절단 및 베어 섬유 어댑터에 삽입합니다. 수광부의 입력에 섬유의 끝을 놓습니다.
  8. 섬유 커플 광섬유 결합기를 이용하여 레이저 광 스풀의 타단.
  9. 에폭시 또는 양면 테이프를 사용하여 샘​​플 홀더의 상단에있는 microtoroid 칩 (스테인레스 스틸, 37.8 mm X 6.4 mm X 3.2 mm)를 놓습니다.
  10. (3 축 나노 포지셔닝 포함하는 위치 결정 스테이지의 상부에 샘플 홀더를 마운트 N3 축 마이크로 미터 위에 anocube) 단계 (장치 목록 참조). 진동을 최소화하기 위해 공압 고립 된 광학 테이블에 모든 실험을 수행합니다.
  11. 조대 위치 3 축 마이크로 미터를 사용하여 샘​​플 칩.
  12. 나노 포지셔너를 사용하여 광섬유에 microtoroid 함유 칩과 평행을 맞 춥니 다. 참고 : 입력 광 (~ 633 ㎚)의 한 파장의 거리에 microtoroid을 맞 춥니 다. 이 프로세스의 시각화를위한 두 개의 촬상 컬럼 사용 상단과 칩의 측면 상에 위치 (대물 렌즈 및 카메라를 가진 튜브를 장비 목록 참조).
  13. 인라인 편광 제어기를 사용하여 광섬유를 통해 지향 레이저 광의 편광을 최적화하는 편광을 조정 노브 (장치 목록 참조). 주 : 광섬유의 전송에서 측정 된 딥 좁은 나타날 때 최적의 편광이 달성된다. 오실로스코프 (자세한 내용은 단계 2.2 참조)이 수영을 관찰한다.
  14. 구축스페이서로서 유리 현미경 슬라이드를 사용하여 샘​​플 스테이지 위에 유리 커버 슬립을 epoxying 의해 샘플 챔버. 참고 : 전체 설치를 포함하는 플렉시 유리 인클로저는 공기 흐름을 최소화하는 데 유용 할 수 있습니다. 작은 개구는 튜브를 사용하여 펌핑 할 수있는 솔루션을 수 있도록 남아 있어야합니다.
  15. 열적 RT 수조 (~ 500 ml)에 1 시간 동안 ≥ 입자 현탁액 또는 단일 분자 수용액 평형. 참고 : 시료는 제조 업체, 예를 들어, PBS 또는 HEPES에서 지정한 관련 버퍼를 사용하여 마이크로 원심 튜브에 원하는 농도로 희석한다. 어떠한 바인딩 이벤트가 검출되지 않은 경우, 버퍼의 염 농도를 증가시킨다.
  16. ~ 2 초 동안 솔루션 (1 ml)을 간략하게 포함 소용돌이 입자.
  17. 1 mL의 샘플에서 챔버 내로 입자 함유 용액을 주입 / 1ml를 주사기 펌프를 사용하여 민.
  18. 샘플 챔버가 작성되면, 주사기 펌프의 전원을 끄십시오.
  19. 기록 데이터를 최소화하기 전에 30 초를 기다립니다측정에 영향을 미칠 수있는 유체의 흐름으로 인한 기계적인 진동의 영향.

2. 주파수 잠금

  1. 커플 링은 유체의 주입으로 인해 방해되기 때문에, 나노 위치로 샘플 홀더를 이동시킴으로써 광섬유에 토 로이드 - 커플 재.
  2. 다양한 파장 통해 컴퓨터 제어 입력을 레이저 스캐닝하여 microtoroid의 공진 파장을 찾아. 레이저의 파장을 조절하는 레이저 컨트롤러 내의 압전 소자에 삼각파 전압 신호를 전송하여이 단계를 수행한다. 이 파장에서 물에 빛의 낮은 흡수가로 가시 광선 (2.5 nm의 ± 635 나노 미터)를 사용하여 실험을 수행합니다.
  3. 자동 평형 수광부로 광섬유의 출력을 연결하여 광섬유를 통해 광 투과율을 측정한다. BNC 케이블을 사용하여 오실로스코프에 수광부의 출력을 연결합니다. O 관찰n은 오실로스코프는 microtoroid의 공진 파장에서, 광섬유를 통해 전송 방울있다.
  4. 케이블을 통해 피드백 컨트롤러 (장비 목록 참조) 고정 주파수의 주요 입력 수광부의 출력을 연결합니다.
  5. 2 kHz의 디더 주파수와 19 FM의 파장 진동의 진폭과 잠금 최고 수준의 피크를 사용하여 자동 잠금 모드에서 주파수 잠금 피드백 제어를 실행합니다. 경험적으로 지글러 - 니콜스 튜닝 규칙 (14)을 사용하여 소프트웨어 창의 비례 적분 미분 설정을 설정한다. 참고 :이 값은 모든 실험의 시작 부분에 한 번 설정 만하면됩니다.
  6. microtoroid의 공진 파장 레이저의 파장을 자동 - 잠금. 샘플 챔버를 충전 한 후이 단계를 수행합니다. 주 : 파장 변화가 너무 큰 경우, 피드백 제어기는 잠금을 잃게 자동 공진 파장의 위치를​​ 찾기 위해 스캔 모드로 전환. 이 OC파장에 대한 CURS 약 1 선폭 (여기 조사 모든 시스템에 대해 적어도 600 FM)보다 큰 이동합니다.
  7. 24 비트 데이터 수집 카드를 사용하여 20 kHz에서 피드백 제어기의 출력을 기록한다. 데이터 수집 소프트웨어를 통해 텍스트 파일로 데이터를 내보낼.

3. 데이터 처리 및 분석

  1. 푸리에 MATLAB에서 데이터를 변환.
  2. 낮은 2 kHz에서의 부과 디더 주파수를 제거하기 위해 1 kHz에서 컷오프와 "벽돌 벽"필터를 사용하여 데이터를 전달 (보충 코드 스크린 샷 1 파일 참조).
  3. 계산적 노치는 16 Hz의 윈도우 크기를 사용하여 데이터를 필터링. 참고 :이이 경우에, 소음의 알려진 원인을 제거하기위한 것입니다, 60 Hz의 전자 라인 노이즈 및 고조파 (레이저 드라이버에서 오는)뿐만 아니라 100 Hz에서의 고조파 (보충 코드 스크린 샷 1 파일 참조).
  4. 역 푸리에 변환은 시간 도메인으로 데이터를 다시 변환.
  5. 메디안 필터 창을 이용하여 상기 데이터1,001 샘플의 크기 (보충 코드 스크린 샷 2 파일 참조).
  6. Kerssemakers 등. (15)의 스텝 찾는 알고리즘을 사용하여 공진 파장의 단계 변화를 찾습니다.
  7. 각 바인딩 단계의 진폭의 히스토그램을 생성합니다.
  8. 식을 사용하여 입자 크기를 계산한다. (1) (토론 참조).

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Representative Results

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이벤트를 결합 입자는 분명히 시간 (그림 2A)를 통해 microtoroid의 공진 파장의 단계와 같은 변화로 볼 수 있습니다. 이러한 단계 높이는.도 2b에 도시 된 바와 같이, 히스토그램은 각각 2-4, 대표 엑소 좀의 결합에서 트레이스 (nanovesicles), 5 nm의 실리카 비드, 및 단일 인간 인터루킨 2 분자를 표시하는 도면이다. 계단 형 이벤트 입경 확장된다는 사실은이 기술이 정확하게 수행되었음을 나타낸다. 후술하는 바와 같이 이것은, 단차 (도 2b)의 히스토그램을 생성하고, 이론적으로 예측 관찰 최대 스텝 높이를 비교하여 분석 할 수있다.

그림 1
파장 가변 다이오드 레이저에서 그림 1. 블록 환상 감지 시스템의 도면이다. 빛은 W 분할 커플 토 로이드와 자동 균형 수광부의 하나의 입력에 직접 보내 다른 부분에 빛을 광섬유를 통해 전송 부분 i 번째. 광섬유의 출력은 자동 균형 수광부의 제 2 입력에 전송된다. 수광부의 출력 microtoroid의 공진 파장의 값을 찾기 위해, 레이저 광을 변조하는 피드백 제어기로 전송된다. 입자 트로이드, 공진 주파수의 변화에​​ 결합있다. 레이저의 파장과 microtoroid의 공진 파장의 차이는 레이저가 원활 가능한 한 빨리 환상의 파장과 일치 할 수있는 비례 적분 미분 컨트롤러로 전송됩니다. 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

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20 ㎚ 비드 microtoroid의 표면에 결합 시간이 지남도 2 공진 파장 변화. 20 ㎚ 비드 시간이 지남 microtoroid의 공진 파장의 (A) 이동은 표면에 결합한다. 높이 각각의 공진 파장 단계 이벤트 (진폭)의 (B) 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
도 3. 시간에 따른 공진 파장 변화가 개별 엑소 좀 microtoroid의 표면에 결합 된 바와 같이. 개별 결합 사건은 시간이 지남에 따라 공진 파장의 변화 불연속 (단계)으로 간주된다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
5 nm의 실리카 비드 등의 시간에 따른도 4의 공진 파장 변화가 microtoroid의 표면에 결합한다. 입자는 수동 흡착을 통해 환상의 표면에 부착. 입자 결합 이벤트는 시간이 지남에 환상의 공진 파장에서 이산 단계로 간주된다. 입자의 탈착은 아래 단계로 볼 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
IL-2 분자가 같은 시간에 따른도 5의 공진 파장 변화가 microtoroid의 표면에 결합한다. Macromolecular의 결합 이벤트시간에 따른 공진 파장에서 이산 단계로 간주된다. 이 단계는 입자의 두 가지 유형이 대략 비슷한 크기의 같은 그림 4에서와 유사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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입자가 결합 된 바와 같이, 환형 상승의 공진 파장 (λ). 입자가 바인딩 해제하면, 공진 파장은 대응 (스텝 - 다운 이벤트)를 감소시킨다. 입자 직경 (d)는 각각의 파장 단계의 진폭 히스토그램을 통해 결정될 수있다. 각 파장 단계의 높이가 결합 입자의 크기 변화로 인해 입자가 결합 microtoroid의 위치로 인해 변한다. 입자는 전기장 (E 0 맥스)이 최대가 microtoroid의 적도에 결합 할 때, 공진 파장 (단차)에서의 최대 변화가 발생한다. 이 최대 단차 (Δλ)은 식을 통해 입경에 관한 것이다. 입자 반경은 (1) 8, D는 입자 경계의 굴절 매체와 그 주변의 인덱스에 기초하여 유전 상수이고, V의 m은 Light 미사용의 모드 볼륨microtoroid 내의 t는 유한 요소 시뮬레이션을 통해 결정 2, 0E (r에 S)는 또한 유한 요소 시뮬레이션을 통해 결정 입자 적도에서 전기장 진폭 :

식 (1)

식 반전. (1) 신호 강도 (Δλ)는 입자의 양 (3)에 따라 확장을 나타냅니다. 우리의 유전 인자는 다음과 같이 정의된다 :

식 (2)

여기서 주변 매체의 굴절률이며, 입자의 굴절 지수이다. 식 (1)뿐만 아니라 부가적인 히스토그램과 크기에 기초하여 CAL 입경 이론적 추정culations는, 16 (2)에 제시되어있다.

꽃 피드백 제어기 잠금 microtoroid 주파수의 파장을 추적하는 주파수를 증가시켜 빠르게 추적 변형 될 수있다. 그러나 메디안 필터 단계 가장자리 나은 보존되도록, 데이터 처리 절차 대신 메디안 필터의 이동 평균을 이용하여 변형 될 수 있으며, 바인딩 이벤트가 여전히 복구 될 수있다. 이 기술의 한계 결합 입자시 microtoroid의 파장 변화가 어디 공진기의 입자 땅에 따라 사실을 포함한다. 따라서, 하나의 입자의 결합의 확인은 많은 이산 바인딩 이벤트 히스토그램의 생성에 의존한다. 뚜렷한 바인딩 이벤트가 검출되지 않은 경우, 용매의 염 농도를 증가시키는 데 도움이.

기존의 방법과 관련하여이 기술의 중요성은 라벨 표적 분자를 심문 요구되지 않는다는 것이다.선택적 바인딩 그러나 항체와 센서를 기능화가 필요합니다. 다른 장점 microtoroid 공진기 고감도 표면 플라스 몬 공명 방법에 비해 더 큰 캡쳐 영역을 갖기 때문에, 입자 결합 사건이 발생할 가능성이 있다는 사실을 포함한다. 꽃이 photobleach 수 형광 태그를 필요로하지 않기 때문에 또한, 꽃은 빨리 (밀리 초) 시간 해상도와 긴 (> 10 초) 측정 할 수있다.

프로토콜 내에서 중요한 단계는 microtoroid와 광섬유를 정렬하는 테이퍼를 포함한다. 토 로이드는 액체를 통해 섬유의 액체, 너무 많은 운동에 몰입되면, 따라서 실험을 종료, 테이퍼가 중단 될 수 있습니다. 현재 공식 꽃은 시간의 시간 규모의 실험 때문에 적합하지 않다. microtoroid가 액체에 침지하고 입자가 결합 된 후에 또한, 품질​​ 계수 (Q)를 복구 불가능 시간과 피크 (L)의 시간 스케일 위에 상품ocking 결국 불안정해질 수 있습니다. 이 상황에서 새로운 장치가 필요합니다. 우리가 공명 피크 주위에 아주 작은 범위에서 우리의 레이저 주파수 디더링 때문에, 꽃 동시에 입자가 결합으로 실시간으로 품질 계수의 변화를 측정하지 않고, 따라서 전체 공명 스펙트럼에 걸쳐 스캔하지 않습니다. 이전과 몇 입자의 결합 후 품질 계수를 살펴보면, 우리는 중요한 Q 값 저하를 볼 수 없습니다. 우리는 원래의 깨끗한 토 로이드는 (~ 1 × 5 -5x10 (6)의 물에 들어 Q) 상대적으로 낮은 Q 값을 가지고 있기 때문에이 것을 기대합니다.

우리는 레이저 유발 변동 잡음 자동 균형 수광부를 이용하여 감산 있습니다. 우리는 직접 접촉을 microtoroid 섬유를 배치하여 환상에 대해 광섬유의 변동을 최소화한다. PID 매개 변수가 올바르게 설정되지 않은 경우 또한, 변동, 나타납니다 시스템하지 않습니다 신속하고 accurat엘리 트랙 파장 이동합니다. 지글러 - 니콜스 튜닝 규칙 바르게 PID (14)를 초기 설정으로 설정하는데 사용될 수있다. 여기에 설명 된 절차에 따라, 그것을 검출하고, 수백 나노 미터 단일 생체 분자를 포함하는 몇 나노 미터까지 이르는 크기의 나노 입자를 할 수 있어야한다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tunable diode laser Newport TLB-6300
Laser controller Newport TLB-6300-LN
Frequency locking feedback controller Toptica Photonics Digilock 110
Auto-balanced photoreceiver Newport Model 2007
In-line polarization controller General Photonics PLC-003-S-90
24-bit data acquisition card National Instruments NI-PCI-4461
Recombinant human interleukin-2 Pierce Biotechnology R201520
20 nm polystyrene beads Thermo Scientific 3020A
NanoCube XYZ Piezo Stage Physik Instrumente P-611.3
Optical table Newport VH3660W-OPT
Objective lens for imaging column Navitar Machine Vision 1-60228
Imaging column (adaptor tube) Navitar Machine Vision 1-60228
High-Res CCD camera for imaging column Edmund Industrial Optics NT39244

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References

  1. Lu, T., et al. High sensitivity nanoparticle detection using optical microcavities. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 5976-5979 (2011).
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