Generation av prostatacancer Patient Härstammar xenograft-modeller från cirkulerande tumörceller

Introduction

Patient härledda xenografter blir alltmer populära experimentella modeller som används för cancerforskning. De kan användas för karakterisering av biomarkörer och biologiska vägar, pre-klinisk utvärdering av läkemedlets effektivitet och skapande av avatarer för personligt cancerterapier ^1,2. Tidigare har andra forskargrupper utvecklade PDX modeller antingen genom att implantera eller injicera enstaka tumör cellsuspensioner eller hela tumör explants i nedsatt immunförsvar möss ^1. Dessa PDX modeller kräver kirurgisk samling av färsk solid tumör, malign ascites eller pleurautgjutning från en patient som genomgår ett kirurgiskt ingrepp som är både kostsamt och utsätter patienten för ökad risk för iatrogen sjuklighet.

En betydande ny utveckling inom cancerforskningen har varit att upptäcka, isolering och karakterisering av cirkulerande tumörceller. Dessa tumörceller fly från den primära tumörmassan och börjar cirkuleradär de spelar en avgörande roll i metastas och återfall, den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet ^3. Utvärderingen och karakterisering av CTCs från flera solida tumörtyper har gett klinisk information för diagnos, prognos och övervakning kvarvarande sjukdom ^3. En mängd olika för närvarande använda metoder som förlitar sig på antingen de fysikaliska egenskaper, uttryck av biomarkörer, eller funktionella egenskaper hos CTCs kan användas för att effektivt isolera CTC ^4. Befintliga makroskala CTC isoleringsmetoder inkluderar densitetsgradientcentrifugering, fysisk filtrering med filter porer och separation mot ytmolekyler. Den mest använda CTC isolering metoder är baserade på antikroppsbaserad infångning av CTCs. Både positiva och negativa urval av cellytemarkörer kan användas för att isolera CTCs från perifert blod. Positiv selektion för CTCs i perifera cirkulationen använder vanligen epitelceller markörer (t.ex. EpCAM) som enre uttrycks på CTCs men inte hematopoietiska celler. Nackdelen med denna metod är att CTCs med metastatisk potential ofta har genomgått epitelial-till-mesenkymala övergång (EMT), som nedreglerar epiteliala ytmarkörer ^3. För att isolera CTCs med metastatisk potential, till en negativ selektionsmetodik vilken utnyttjar det hematopoietiska ytmarkör, CD45, utarma den normala cellpopulationen av leukocyter kan användas ^5.

Prostatacancer är den vanligaste diagnosen cancer och en viktig orsak till cancerrelaterade dödsfall hos män ^6. Mekanismerna för tumörprogression och aggressivitet är inte klarlagd och därför genereringen och karakteriseringen av experimentella modeller som rekapitulera den molekylära heterogeniteten hos prostatacancer är av betydande intresse. PDX modeller av prostatacancer har varit tidigare genereras genom inympning av humana prostatacancerceller i immunocomutlovade möss ^7,8. Emellertid genereringen av sådana modeller har hämmats av den låga engraftment hastigheten för prostatacancer i immunförsvagade möss, som i första hand tillskrivs den indolenta sjukdomens art. Nyligen har CTC använts för att generera bröstcancer ^9, lungcancer ¹⁰ och prostatacancer ¹¹ PDX modeller. Dessa proof-of-concept studier infört möjligheten att generera PDX modeller oberoende av behovet av kirurgisk provtagning. I denna artikel kommer vi i detalj beskriva en metod för generering av denna nya experimentmodell.

Protocol

Detta protokoll har genomförts på vår institution med godkännande från den institutionella forskningsetiska ombord och är i överensstämmelse med alla institutionella, nationella och internationella riktlinjer för mänsklig välfärd.

1. Insamling av perifert blod från patienter med avancerad prostatacancer

Obs: Välj patienter med metastaserande prostatacancer. Införskaffa en skriftlig patientens medgivande och spela kliniska egenskaper hos patienter, inklusive ålder vid isolering och tidigare kemoterapi och hormonbehandling. Patienter med metastatisk sjukdom kommer potentiellt högsta koncentrationen av CTCs i perifert blod.

1. Samla blodprov efter informerat samtycke och under en lämplig Institutional Review Board godkänt protokoll. Använd latexhandskar och laboratorierock hela förfarandet.
2. Anslut 25 G fjärilsnål och slangar till nålhållaren. Använd en spritsudd för att rengöra områdetantekubitalvenen mellan biceps och underarm, sedan använda tryckförband på patientens överarm.
3. Sätt fjärilsnål i antekubitalvenen och tryck blodinsamling röret i nålhållaren för att börja insamling. Samla cirka 10 ml blod i uppsamlingsrör som innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för att förhindra koagulering.
4. Ta fjärilsnål från patient och utöva påtryckningar med steril kompress över platsen för venpunktion under 1 minut. Täck webbplats med ett sterilt bandage.

2. Isolering av mononukleära celler

Obs: blod från steg 1 kommer att innehålla perifera mononukleära blodceller (PBMC) (t.ex. lymfocyter och monocyter) utöver de mononukleära CTC.

1. Pipett helblod i 50 ml polystyren koniskt rör med en 5 ml serologisk pipett och tillsätt Hanks balanserade saltlösning (HBSS) i en 1: 1-förhållande. Försiktigt pipett blandningen att homogenisera.
2. Tillsätt 15 ml av en kommersiellt framställd lösning (Ficoll-Paque) för att separera blodkomponenter från låg hastighet densitetsgradientcentrifugering till en tom 50 ml polystyren koniskt rör.
3. Pipetten lätt helblod och HBSS blandning, från steg 2,1, till polystyrenröret från steg 2,2, för att bilda distinkta övre lagret. Ställ pipett till lägsta inställningen för att minimera blandning av lösningar, kommer detta att säkerställa en effektiv separation.
4. Centrifugera vid 400 xg under 30 min vid RT (25 ° C). Ställ retardation till lägsta inställningen för att förhindra blandning av lösningar efter separation. Acceleration kan ställas in på valfri hastighet.
5. Efter centrifugering, identifiera den tunna vitgrå rand av PBMC och CTCs inklämt skikt mellan plasma ovanpå och separation lösning i botten av röret.
6. Samla cellerna från vitgrå rand i steg 2.5 till ett polystyrenrör med hjälp av en plast överföringspipett 50 ml.
7. Lägg HBSS till 50 ml polystyren koniska rör med PBMC och CTC och centrifuge igen vid 400 xg under 10 min RT för att tvätta.
8. Dekantera vätskan och återsuspendera pelleten i 50 ml HBSS och centrifugera igen vid 400 xg under 3 min vid RT för att tvätta.
9. Kassera supernatanten, resuspendera den återstående pelleten med 5 ml av röda blodkroppar Lysbuffert och inkubera lösningen under 5 min vid RT.
10. Ta bort den röda blodkroppar lysbuffert genom centrifugering vid 400 xg under 3 min vid RT.
11. Kasta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 1 ml PBS 1x kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) för att blockera före antikroppsfärgning.

3. Färgning mononukleära celler med CD45-FITC antikropp för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)

1. Kvantifiera antalet viabla (trypanblått-negativa) celler (från steg 2,11) med användning av en hemocytometer eller automatiserad cellräknare. Bered en 1 x 10 ⁶ celler / ml suspension (i PBS 1x med 10% FBS) och placera den på is under 1 timme.
2. Fördela kvantifierascellsuspension från föregående steg i två rör. Etikett rör som kontroll och CD45 färgning.
3. I styrröret, till IgG1K-FITC (2,5 | ig / ml) vid en utspädning av 1: 250. I CD45 färgnings röret, tillsätt CD45 FITC (2,5 | ig / ml) konjugerad primär antikropp vid en utspädning av 1: 250 och inkubera cellsuspensioner på is under 30 minuter. CD45 antigen märkning används för att utesluta hematopoietiska celler.
4. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 3 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten.
5. Tvätta cellerna två gånger, genom att suspendera varje pellet med steril 1 x PBS kompletterad med 10% FBS, följt av centrifugering vid 400 xg under 3 min vid 4 ° C.
6. Resuspendera cellerna i en 1 ml lösning av PBS 1x innehållande 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) vid en koncentration av 10 | ig / ml.
7. Filtrera den slutliga lösningen genom 35 pm sil lock i 12 mm x 75 mm polystyrenrör.

4. Isolering av prostata CTCs avFACS

Obs: Använd en flödescytometer för att samla in levande CD45 negativa CTC.

1. Ställ kontroller ersättnings användning av celler från röret märkt "Kontroll".
2. Skapa grindar som utesluter skräp och kluster av celler med hjälp av lämpliga framåt scatter och sido scatter parametrar.
3. Upprätta FITC grindarna med hjälp av cellsuspensioner från röret märkt "CD45-FITC."
4. Gate livskraftiga (DAPI-negativa) celler med användning av Pacific Blue-En kanal.
5. Samla CD45 negativ befolknings i en steril 15 ml polystyren koniskt rör innehållande 2 ml av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kompletterat med 10% FBS.
6. Centrifugera sorterade prostatatumörcellsuspension vid 400 xg under 3 min, därefter resuspendera pelletsen i 200 - 500 | il RPMI kompletterat med 10% FBS.

5. Injektion av CTCs i möss och övervakning av xenograft tillväxt

Notera:Genomföra alla djurförsök i enlighet med protokoll som godkänts av den institutionella djurvård kommitté. Detta protokoll har genomförts på vår institution under en specifik Animal Använd protokollet godkänd av vår Animal Care kommittén i enlighet och överensstämmelse med alla relevanta rättsliga och institutionella organ, regler och riktlinjer.

1. Blanda den sorterade prostatatumörcellsuspension med extracellulär matris vid ett 1: 1-förhållande och placera på is.
2. Söva mus före subkutan implantering i en kammare som levererar 5% (volym / volym) inhalerade isofluran i ett L / min av syre. Säkerställa en lämplig bedövning genom att kontrollera för förlust av ögon- och tå reflex i musen.
3. Med användning av en 25 G-nål och en 1 ml spruta, injicera 250 pl prostatatumörcell och extracellulär matriscellsuspension subkutant i båda övre flanker en 8-10 veckor gammal manlig nedsatt immunförsvar mus. Injicera 250 pl oavsett CTC koncentration som injektionsvolymen är important värde. Maximal SQ administration i mus är inte mer än 1 ml.  
4. Övervaka möss genom att utföra vecko palpation av mus injektionsställen för tillväxt av subkutana nodulära densiteter och genom att mäta möss vikt två gånger i veckan.
5. Euthanize möss genom kvävning med koldioxid, följt av halsdislokation och skörd subkutana mänskliga prostatacancer xenografter när tumörstorleken är mer än 0,5 cm och mindre än 1 cm i störst diameter för att säkerställa tillräckligt med tumörvävnad för molekylära analyser och seriepassage. Euthanize möss med tecken på ångest eller viktförlust på 15% trots att ingen tumör är påtaglig.

Representative Results

Detta protokoll kommer att leda till generering av PDX modeller från isolerade CD45 negativ prostatacancer CTC. Baserat på den negativa selektionsmetod som används i våra protokoll är det nödvändigt att utesluta döda celler med användning av DAPI-infärgning. Den procentuella andelen CD45-negativa celler detekterades genom flödescytometri är variabel och beror på tumörbelastning hos patienten (Figur 1A). Immunofluorescens färgning av osorterade celler med användning av CD45 och DAPI (för att identifiera cellkärnor) avslöjar CD45-negativa celler, såsom visas med de vita pilarna (figur 1B). I Figur 1C, kan subkutana nodulära densiteter ses på båda flankerna hos musen. Varje nodulär densitet representerar xenograft tillväxt och kan uppskattas till skillnad från frisk vävnad som sticker ut från rygg muskulaturen i musen och är fastare i konsistensen. Tidsintervallet mellan implantering och xenotransplantat utveckling kan variera kraftigt beroende på CTC bördan av patient prov, antalet celler implanterade och biologiska aggressiviteten hos CTCs. Prostata PDX genereras från CTC rekapitulera humant prostatatumör som sett av hematoxylin och eosin-färgning, och genom immunhistokemi för prostataspecifikt cellulära markörer, såsom androgenreceptorn (AR) och prostataspecifikt membranantigen (PSMA) (figur 1D).

Figur 1. Generering av prostatacancer PDX modeller från Human Prostate Cancer CTC. (A) Flödescytometri diagram som illustrerar specifika CD45-färgning cellpopulationer från perifert blod från en patient med prostatacancer. . Celler med positiv DAPI-infärgning är döda och uteslutits genom gating för att säkerställa endast viabla celler isoleras (B) CD45-immunofluorescensfärgning av osorterat befolkning bekräftar närvaro av CD45 ^-.-Celler (vita pilar) (C) in vivo och efter tumör skörd (D) Analys av CTC PDX modeller med konventionell Hematoxylin och Eosin och de specifika prostata markörer. androgenreceptorn (AR) och prostataspecifikt membranantigen (PSMA). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta manuskript beskriver ett förfarande för generering av prostatacancer PDX modeller ur CTC. Användningen av CTCs för genereringen av PDX modeller har flera potentiella viktiga fördelar jämfört med existerande metoder. Först, tillgänglig samling av CTCs från perifert blod möjliggör generering av experimentella modeller från samma patient vid olika sjukdomsstadier. För det andra representerar bloduppsamling en säkrare och billig metod för att isolera tumörceller jämfört med befintliga metoder som kräver kirurgiska förfaranden för insamling av tumörceller.

Flera metoder för CTC anrikning har beskrivits men många är inte tillgängliga för alla laboratorium på grund av finansierings och resursbegränsningar. Vi försökt utveckla en analys i vårt laboratorium som kan kapitalisera i användningen av FACS, en praktiskt, prisvärt och lättillgängligt metodik för många laboratorier. En potentiell begränsning av denna metod ärotillräcklig känslighet för detektion av sällsynta celler som skulle kunna begränsa användningen av detta protokoll till patienter med stor tumörbörda. Flera ytterligare tekniker som utnyttjar fysikaliska eller biologiska egenskaper hos epitelceller kan användas för att över mildra denna begränsning och öka detektion och isolering av denna sällsynta cellpopulation ^4. Metoden för CTC anrikning beskrivs i detta protokoll använder negativ selektion; CD45 ⁺ leukocyter kasseras och CD45 ^- CTC bibehålls. Det är viktigt att ta bort potentiellt förorenande CD45 ^- element från cellsuspensioner vid sortering efter flödescytometri (t.ex. icke-livsdugliga celler.). I synnerhet användningen av röda blodkroppar lysbuffert och utelämnandet av icke-livsdugliga celler genom DAPI färgning är kritiska faktorer. Även om dessa åtgärder kan inte garantera att icke-CTC delar inte förorenar CD45 ^- befolkningen, våra tidigare studier tyder på att den önskade cell pBefolknings är tillräckligt berikad med dessa metoder ^11. Det är möjligt att renheten hos CTC populationen skulle kunna förbättras genom positiv selektion med användning av antikroppar mot cellytmarkörer unika för prostatacancerceller ^3. Dessutom kan CTC heterogenitet och antal epitelceller som finns i provet testas med hjälp av EpCAM eller andra lämpliga fläckar. Men ytterligare bearbetning av den perifera blodprovet kan i slutändan öka renheten samtidigt minska totalutbyte.

I detta protokoll utförde vi subkutan injektion av isolerade CTCs som möjliggör enkel implantation och övervakning av utvecklings tumören. Men subkutana modeller har dålig näring utbud som kan äventyra tumör inympning och förlust av tumör cellsubpopulationer. Alternativa injektionsställen såsom mus prostata (ortotropiskt), som främjar en prostata mikro och subrenala kapsel injektion, vilket förbättrar successful inympning och bevarar tumör heterogenitet, kan utföras på grundval av utredare önskemål ^1,2. Optimalt bör NOD / SCID / IL2λ-receptor null (NSG) musmodeller användas för att öka graden av xenograft engraftment ¹² emellertid andra stammar av immunförsvagade möss (NOD / SCID eller, naken, SCID / beige) har också använts med framgång i genereringen av solida tumörer härrör PDX modeller ^1. Genererade PDX modeller kan seriepasse och stabilitet ursprungliga tumören egenskaper övervakades med användning av etablerade genetiska metoder ^9-11,13.

Utvinningen av ett stort antal livskraftiga prostatacancer CTCs är beroende av sjukdomsstadium. Den framgångsrika generationen av PDX modellerna bäst garanteras när CTC isoleras från blodet hos patienter med hög metastatisk belastning. Vi har framgångsrikt genererat PDX modeller från blodprov med ett intervall av 100 till 10 tusen CTC. I vår erfarenhet, är det nödvändigt att välutbildad arbetskraftAtory personal att utföra protokollet ofta för att säkerställa framgångsrik isolering av prostata CTCs från blodprov. Vi rekommenderar att laboratoriepersonal initialt utbildade i detta protokoll genom att använda blodprover från normala friska individer spetsade med celler från tumörcellinjer. Frånvaron eller lågt antal CTCs i primär prostatacancer kan begränsa användningen av denna metod för att metastaserande prostatacancer.

Metoden för generering av CTC härrör PDX modeller som beskrivs i detta protokoll kan därefter användas i många forskningsansökningar, inklusive molekylär karakterisering av prostatacancer, läkemedelsscreening, övervakning terapisvar, biomarkör utveckling och andra framsteg i personligt cancerterapier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe