Generering af prostatakræft Patient Afledt xenograftmodeller fra Cirkulerende tumorceller

Introduction

Patient afledte xenotransplantater bliver stadig mere populære eksperimentelle modeller, der anvendes til kræftforskning. De kan bruges til karakterisering af biomarkører og biologiske veje, præklinisk evaluering af narkotika effekt, og skabelse af avatarer for personlige behandlinger mod kræft ^1,2. Tidligere har andre forskergrupper udviklet PDX-modeller enten ved at implantere eller indsprøjte en enkelt tumor celle suspensioner eller hel tumoreksplantater i immunkompromitterede mus ^1. Disse PDX modeller kræver kirurgisk samling af fersk fast tumor, maligne ascites eller pleuraeffusion fra en patient, der gennemgår et kirurgisk indgreb, som er både dyrt og udsætter patienten for forøget risiko for iatrogen sygelighed.

En væsentlig seneste udvikling i cancerforskning har været påvisning, isolering og karakterisering af cirkulerende tumorceller. Disse tumorceller undslippe fra den primære tumormasse og komme i omløbhvor de spiller en afgørende rolle i metastase og tilbagefald, den mest almindelige årsag til kræft dødelighed ^3. Evalueringen og karakterisering af CTCs fra flere solide tumortyper har givet klinisk information til diagnose, prognose, og overvågning af residual sygdom ^3. En række tiden anvendte fremgangsmåder er afhængige af enten de fysiske egenskaber, ekspression af biomarkører, eller funktionelle kendetegn CTCs kan anvendes til effektivt at isolere CTCs ^4. Eksisterende makroskala CTC isoleringsmetoder omfatter densitetsgradientcentrifugering, fysisk filtrering med filterporer og separation mod overflademolekyler. Den mest udbredte CTC isolation metoder er baseret på antistof-baserede indfangning af CTCs. Både positive og negative udvælgelse af celleoverflademarkører kan anvendes til at isolere CTCs fra perifert blod. Positiv selektion for CTCs i den perifere cirkulation anvender almindeligvis epiteliale markører (f.eks EpCAM), som enre udtrykt på CTCs men ikke hæmatopoietiske celler. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at CTCs med metastatisk potentiale ofte har undergået epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), som nedregulerer epiteloverflade ³ markører. For at isolere CTCs med metastatisk potentiale, at en negativ selektion metode, som anvender det hæmatopoietiske overflade markering, CD45, nedbryder den normale cellepopulation af leukocytter kan anvendes ^5.

Prostatacancer er den hyppigst diagnosticerede cancer og en væsentlig årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt mænd ^6. Mekanismerne på tumorudvikling og aggressivitet er ikke fuldstændig forstået, og derfor generering og karakterisering af eksperimentelle modeller, der rekapitulere molekylære heterogenitet af prostatacancer er af væsentlig interesse. PDX modeller af prostatacancer har været tidligere genereret ved transplantation af humane prostata kræftceller ind immunocomlovede mus ^7,8. Men frembringelsen af ​​sådanne modeller har været hæmmet af den lave pris indpodning af prostatacancer i immunkompromitterede mus, der primært tilskrives den indolente sygdommens art. For nylig har CTCs blevet anvendt til at generere brystcancer ^9, lungecancer ^{10 og} prostatacancer ¹¹ PDX modeller. Disse proof-of-concept studier indført mulighed for at generere PDX modeller uafhængigt af behovet for kirurgisk prøveindsamling. I denne artikel beskriver vi i detaljer en fremgangsmåde til frembringelse af denne hidtil ukendte forsøgsmodel.

Protocol

Denne protokol er blevet udført på vores institution med godkendelse fra den institutionelle forskningsetik bestyrelse og er i overensstemmelse med alle institutionelle, nationale og internationale retningslinjer for menneskelig velfærd.

1. Indsamling af perifert blod fra patienter med fremskreden prostatakræft

Bemærk: Vælg patienter med metastatisk prostatacancer. Indhente skriftlig patient samtykke og optage kliniske karakteristika for patienter, herunder alder ved isolering og tidligere kemoterapi og hormonbehandlinger. Patienter med metastatisk sygdom vil potentielt have højeste koncentration af CTCs i perifert blod.

1. Saml blodprøver efter informeret samtykke og under en passende Institutional Review Board godkendte protokol. Bær latex handsker og en kittel hele proceduren.
2. Tilslut 25 G butterfly-nål og slangen til nåleholderen. Brug en spritserviet til at rense området forantecubital vene mellem bicep og underarm, derefter anvende årepresse for patientens overarm.
3. Indsæt sommerfugl nål i antecubital vene og skub blodtapning røret i nåleholderen at starte indsamlingen. Indsamle ca. 10 ml blod i opsamlingsrør, der indeholder ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) for at forhindre koagulation.
4. Fjern sommerfugl nålen fra patienten og pres med sterilt gaze i stedet for venepunktur i 1 min. Cover site med en steril forbinding.

2. Isolering af mononukleære celler

Bemærk: Blodet opsamles fra trin 1 skal indeholde perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) (f.eks lymfocytter og monocytter) i tillæg til de mononukleære CTCs.

1. Pipette fuldblod i 50 ml polystyren konisk rør med en 5 ml serologisk pipette og tilsæt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i en 1: 1-forhold. Forsigtigt pipette blandingen homogeniseres.
2. Der tilsættes 15 ml af en kommercielt tilberedt opløsning (Ficoll-Paque) for at adskille blodkomponenter ved lav hastighed densitetsgradientcentrifugering til en tom 50 ml polystyren konisk rør.
3. Forsigtigt pipettere fuldblod og HBSS blanding fra trin 2.1, i polystyrenrør fra trin 2.2, til dannelse af særskilte toplag. Indstil pipette til laveste indstilling for at minimere blanding af løsninger, vil dette sikre en effektiv adskillelse.
4. Der centrifugeres ved 400 xg i 30 minutter ved stuetemperatur (25 ° C). Indstil deceleration til laveste indstilling for at forhindre sammenblanding af løsninger efter separation. Acceleration kan indstilles til enhver hastighed.
5. Efter centrifugering identificere den tynde hvide-grå ​​stribe af PBMC'er og CTCs klemt lag mellem plasma på toppen og adskillelse opløsning ved bunden af ​​røret.
6. Opsamle cellerne fra den hvide-grå ​​stribe i trin 2.5 i en 50 ml polystyren rør under anvendelse af en plast transfer pipette.
7. Tilføj HBSS til 50 ml polystyren konisk rør med PBMC'er og CTCs og centrifuge igen ved 400 x g i 10 min RT at vaske.
8. Dekanteres væske og resuspender pellet i 50 ml HBSS, og der centrifugeres igen ved 400 x g i 3 minutter ved stuetemperatur for at vaske.
9. Supernatanten fjernes, resuspender pellet resterende med 5 ml af Red Blood Cell Lysis buffer og inkuberes opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur.
10. Fjern de røde blodlegemer lysepuffer ved centrifugering ved 400 xg i 3 minutter ved stuetemperatur.
11. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 1 ml PBS 1x suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) for at blokere før antistoffarvning.

3. Farvning mononukleære celler med CD45-FITC-antistof til fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)

1. Kvantificere antallet af levedygtige (trypan blå-negative) celler (fra trin 2.11) ved hjælp af et hæmocytometer eller automatisk celletæller. Forbered en 1 x 10 ⁶ celler / ml suspension (i PBS 1x med 10% FBS), og læg den på is i 1 time.
2. Fordel kvantificeretcellesuspension fra det foregående trin i to rør. Label rør som kontrol og CD45 farvning.
3. I kontrolgruppen røret, tilsæt IgG1ĸ-FITC (2,5 ug / ml) ved en fortynding på 1: 250. I CD45-farvning røret, tilsæt CD45 FITC (2,5 ug / ml) konjugeret primære antistof ved en fortynding på 1: 250 og inkuber cellesuspensioner på is i 30 minutter. CD45 antigen mærkning anvendes til at udelukke hæmatopoietiske celler.
4. Centrifuger cellerne ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C, og supernatanten.
5. Vask cellerne to gange ved at suspendere hver pellet med sterilt 1 x PBS suppleret med 10% FBS efterfulgt af centrifugering ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
6. Resuspender cellerne i en opløsning af PBS 1x indeholdende 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i en koncentration på 10 ug / ml 1 ml.
7. Filter den endelige løsning gennem 35 um si hætter i 12 mm x 75 mm polystyrenrør.

4. Isolering af prostata CTCs vedFACS

Bemærk: Udnyt en flowcytometer at indsamle levende CD45 negative CTCs.

1. Indstil kontroller kompensation ved hjælp celler fra røret mærket, "Control".
2. Opret porte, der udelukker snavs og klynger af celler ved hjælp af hensigtsmæssige fremadrettede scatter og side-scatter parametre.
3. Fastsætte FITC porte ved hjælp af cellesuspensioner fra røret mærket "CD45-FITC."
4. Gate levedygtige (DAPI-negative) celler ved hjælp af Pacific Blue-en kanal.
5. Saml CD45 negative population i en steril 15 ml konisk rør polystyren indeholdende 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suppleret med 10% FBS.
6. Centrifuger sorteret prostatatumor cellesuspension ved 400 xg i 3 min, derefter resuspenderes pellets i 200 - 500 pi RPMI suppleret med 10% FBS.

5. Injektion af CTCs i mus og overvågning af xenotransplantat Vækst

Note:Udføre alle dyreforsøg i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af den institutionelle dyr pleje udvalg. Denne protokol er blevet udført på vores institution under en specifik Animal Brug protokol godkendes af vores Animal Care udvalg i overensstemmelse og overensstemmelse med alle relevante lovgivningsmæssige og institutionelle agenturer, bestemmelser og retningslinjer.

1. Bland sorteret prostatatumor cellesuspension med ekstracellulær matrix ved en 1: 1-forhold og anbring på is.
2. Bedøver musen før subkutan implantering i et kammer leverer 5% (v / v) inhaleret isofluran i 1 L / min oxygen. Sikre passende bedøvelse ved at kontrollere for tab af hornhinde og tå refleks i musen.
3. Anvendelse af en 25 G nål og en 1 ml sprøjte, injiceres 250 pi prostata tumor celle og ekstracellulær matrix cellesuspension subkutant i begge flanker af øvre en 8-10 uger gammel mand immundefekte mus. Injicere 250 pi uanset CTC koncentration som injektionsvolumenet er jegVIGTIG værdi. Maksimal SQ administration i mus er ikke mere end 1 ml.  
4. Overvåg mus ved at udføre ugentlige palpering af mus injektionssteder for vækst af subkutane nodulær tætheder og ved at måle mus vægt to gange om ugen.
5. Aflive mus ved kuldioxid kvælning efterfulgt af cervikal dislokation og høst subkutane menneskelig prostatakræft xenografter når tumor størrelse er mere end 0,5 cm og mindre end 1 cm i største diameter for at sikre tilstrækkelig tumorvæv til molekylære analyser og seriel passage. Aflive mus med tegn på angst eller vægttab på 15% på trods af ingen tumor er håndgribelig.

Representative Results

Denne protokol vil føre til dannelse af PDX-modeller fra isolerede CD45 negativ prostatakræft CTCs. Baseret på den negative udvælgelsesmetode anvendes i vores protokol er det nødvendigt at udelukke døde celler ved hjælp af DAPI-farvet. Procentdelen af CD45-negative celler påvist ved flowcytometri er variabel og afhænger af tumorbyrde af patienten (figur 1A). Immunfluorescensfarvning af usorterede celler under anvendelse af CD45 og DAPI (til identifikation cellekerner) afslører CD45-negative celler, som angivet ved de hvide pile (figur 1B). I figur 1C, kan subkutane nodulær tætheder ses på begge flanker af musen. Hver nodulær densitet repræsenterer xenograft vækst og kan forstås som forskellig fra sundt væv, som det rager frem fra den dorsale muskulaturen i mus og er fastere i tekstur. Tidsintervallet mellem implantation og xenograft udvikling kan variere meget afhængigt af CTC byrden af ​​patient prøve, antal celler implanterede og den biologiske aggressivitet CTCs. Prostata PDX genereret fra CTCs rekapitulere human prostatatumor som set af hematoxylin og eosin-farvning og ved immunhistokemi for prostata specifikke cellulære markører, såsom androgen receptor (AR) og prostata-specifikt membran-antigen (PSMA) (figur 1D).

Figur 1. Generering af prostatakræft PDX modeller fra human prostatacancer CTCs. (A) Flowcytometri plot, der illustrerer specifikke CD45-farvning cellepopulationer fra perifert blod fra en patient med prostatacancer. . Celler med positiv DAPI pletten er døde og udelukket ved gating at sikre kun levedygtige celler er isolerede (B) CD45 immunfluorescensfarvning af usorteret befolkning bekræfter tilstedeværelsen af CD45 ^-. Celler (hvide pile) (C) in vivo og efter tumor høst (D) Analyse af CTC PDX-modeller ved hjælp af konventionelle Hematoxylin og eosin og de ​​specifikke prostata markører.; androgen receptor (AR) og prostata-membranantigen (PSMA). Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Dette manuskript beskriver en metode til generering af prostatacancer PDX modeller CTCs. Anvendelsen af ​​CTCs til generering af PDX modeller har flere potentielle vigtige fordele sammenlignet med eksisterende fremgangsmåder. Først tilgængelige samling af CTCs fra perifert blod giver genereringen af ​​eksperimentelle modeller fra den samme patient ved forskellige sygdomsstadier. For det andet, repræsenterer blodtapning en mere sikker og billig metode til at isolere tumorceller sammenlignet med eksisterende metoder, der kræver kirurgiske procedurer til indsamling af tumorceller.

Flere metoder til CTC berigelse er blevet beskrevet men mange ikke er tilgængelige for alle laboratorier på grund af finansiering og ressourcemæssige begrænsninger. Vi søgte at udvikle et assay i vores laboratorium, der kunne udnytte i brugen af ​​FACS, en praktisk, økonomisk overkommelige og tilgængelige metode til mange laboratorier. En potentiel begrænsning af denne metode erden utilstrækkelige følsomhed til påvisning af sjældne celler, som kan begrænse brugen af ​​denne protokol til patienter med høj tumorbyrde. Adskillige yderligere teknologier, der anvender fysiske eller biologiske egenskaber af epitelceller kan anvendes til over afbøde denne begrænsning og øge påvisning og isolering af denne sjældne cellepopulation ^4. Metoden til CTC berigelse beskrevet i denne protokol beskæftiger negativ selektion; CD45 ⁺ leukocytter kasseres og CD45 ^- CTCs bevares. Det er vigtigt at fjerne potentielt forurenende CD45 ^- elementer fra cellesuspensioner ved sortering ved flowcytometri (f.eks, ikke-levedygtige celler.). Især anvendelsen af ​​røde blodlegemer lysisbuffer og udeladelsen af ​​ikke-levedygtige celler ved DAPI farvning er kritiske overvejelser. Selv om disse foranstaltninger ikke kan garantere for, at ikke-CTC elementer ikke forurene CD45 ^- befolkning, vores tidligere undersøgelser tyder på, at den ønskede celle population er tilstrækkeligt beriget med disse metoder ^11. Det er muligt, at renheden af CTC befolkningen kunne forbedres gennem positiv selektion under anvendelse af antistoffer mod celleoverflademarkører unikke for prostatacancerceller ^3. Desuden kan CTC heterogenitet og antallet af epitelceller til stede i prøven testes ved hjælp EpCAM eller andre passende pletter. Men yderligere forarbejdning af blodprøven perifere kan i sidste ende øge renheden, mens faldende samlede udbytte.

I denne protokol vi udførte subkutan injektion af isolerede CTCs der giver mulighed for nem implantation og overvågning af udviklingen tumor. Men subkutane modeller har utilstrækkelig ernæring levering, der kan kompromittere tumor engraftment og tab af tumor celle subpopulationer. Alternative injektionssteder såsom muse prostata (orthotrop), som fremmer en prostata mikromiljø, og subrenal kapsel injektion, som forbedrer successful engraftment og bevarer tumor heterogenitet, kan udføres på grundlag af investigator præference ^1,2. Optimalt set bør NOD / SCID / IL2λ-receptor null (NSG) musemodeller anvendes til at øge hastigheden af xenograft transplantation ^12, men andre stammer af immunsvækkede mus (NOD / SCID eller Nude, SCID / beige) har også været anvendt med succes i dannelsen af faste tumorer afledt PDX modeller ^1. Genereret PDX modeller kan serielt passeret og stabiliteten af originale tumor egenskaber overvåges ved hjælp af etablerede genetiske metoder ^9-11,13.

Genopretningen af ​​høje antal levedygtige prostatakræft CTCs er afhængig af sygdom scenen. Den vellykkede generation af PDX-modeller er bedst sikret, når CTCs isoleres fra blod fra patienter med højt metastatisk byrde. Vi har med succes skabt PDX-modeller fra blodprøver med en rækkevidde på 100 til 10.000 CTCs. Det er vores erfaring, er det nødvendigt for veluddannet arbejdskraftDELSE personale til at udføre protokollen ofte for at sikre en vellykket isolering af prostata CTCs fra blodprøver. Vi anbefaler, at laboratoriepersonale i første omgang blive uddannet i denne protokol ved at bruge blodprøver fra normale sunde individer tilsat celler fra tumorcellelinier. Fravær eller lavt antal CTCs i primær prostatacancer kan begrænse anvendelsen af ​​denne metode på metastatisk prostatacancer.

Metoden til generering af CTC afledte PDX-modeller, der er beskrevet i denne protokol kan efterfølgende anvendes i mange forskningsansøgninger, herunder molekylær karakterisering af prostatakræft, narkotika screening, overvågning terapi respons, biomarkør udvikling og andre fremskridt i personlig behandlinger mod kræft.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe