Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Introduction

Patiënt afgeleid xenotransplantaten worden steeds populairder experimentele modellen gebruikt voor kankeronderzoek. Ze kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van biomerkers en biologische pathways, pre-klinische evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen, en het creëren van virtuele personen gepersonaliseerde kankertherapieën ^1,2. Eerder hebben andere onderzoeksgroepen PDX modellen ontwikkeld ofwel door het implanteren of het injecteren van enkele tumorcel schorsingen of hele tumor explantaten in immunogecompromitteerd muizen ^1. Deze PDX modellen vereisen chirurgische collectie van verse vaste tumoren, kwaadaardige ascites en pleurale effusie van een patiënt die een chirurgische procedure die zowel kostbaar en loopt de patiënt een verhoogde kans op iatrogene morbiditeit.

Een belangrijke recente ontwikkeling in kankeronderzoek detectie, isolatie en karakterisering van circulerende tumorcellen. Deze tumorcellen ontsnappen uit de primaire tumor massa en voer circulatiewaar ze spelen een cruciale rol in metastase en terugval, de meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfte ^3. De evaluatie en karakterisering van CTCs uit verschillende solide tumor types zijn klinische informatie voor de diagnose, prognose en monitoring residuele ziekte ³ voorzien. Verschillende momenteel gebruikte methoden een beroep op zowel de fysische eigenschappen, expressie van biomarkers of functionele kenmerken van CTCs gebruikt kunnen worden om efficiënt isoleren CTCs ^4. Bestaande macroschaal CTC isolatiemethoden omvatten dichtheidsgradiënt centrifugering, filtratie fysiek met filter poriën en scheiding tegen oppervlaktemoleculen. De meest gebruikte CTC isolatie methoden zijn gebaseerd op antilichamen gebaseerde vastlegging van CTCs. Zowel positieve als negatieve selectie van celoppervlak markers kunnen worden toegepast voor het isoleren CTCs uit perifeer bloed. Positieve selectie van CTCs in de perifere circulatie gewoonlijk gebruikt epitheliale merkers (bijvoorbeeld EpCAM), dat eenre uitgedrukt op CTCs maar niet hematopoëtische cellen. Het nadeel van deze methode is dat CTCs met metastatische potentie vaak ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), waarbij epitheliale oppervlak ³ merkers downreguleert. Om CTC met metastatische potentieel te isoleren, een negatieve selectie methodiek die de hematopoietische oppervlak marker CD45 telt, om afbrekende de normale cel populatie van leukocyten kan worden gebruikt ^5.

Prostaatkanker is de meest gediagnosticeerde kanker en een belangrijke oorzaak van kankersterfte bij mannen ^6. De mechanismen van de tumorprogressie en agressiviteit niet volledig begrepen en dus het genereren en karakteriseren van experimentele modellen die de moleculaire heterogeniteit van prostaatkanker herhalen van groot belang. PDX modellen van prostaatkanker zijn geweest eerder gegenereerd door implantatie van menselijke prostaatkankercellen in immunocombeloofde muizen ^7,8. Echter de vorming van dergelijke modellen wordt bemoeilijkt door het lage percentage enting van prostaatkanker in immuungecompromitteerde muizen, die voornamelijk aan de indolente aard van de ziekte. Recent zijn CTCs gebruikt om borstkanker ^{9, 10} longkanker en prostaatkanker ¹¹ PDX modellen genereren. Deze proof-of-concept studies introduceerde de mogelijkheid van het genereren van PDX modellen onafhankelijk van de noodzaak voor chirurgische monstername. In dit artikel beschrijven we in detail een werkwijze voor het verkrijgen van deze nieuwe experimentele model.

Protocol

Dit protocol is uitgevoerd op onze instelling met de goedkeuring van het institutioneel onderzoek ethische raad van bestuur en is in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn.

1. Verzameling van perifere bloed van patiënten met gevorderde prostaatkanker

Opmerking: Selecteer patiënten met gemetastaseerde prostaatkanker. Verkrijgen schriftelijke toestemming van de patiënt en het opnemen klinische kenmerken van de patiënten, met inbegrip van leeftijd bij de isolatie en eerdere chemotherapie en hormonale behandelingen. Patiënten met gemetastaseerde ziekte zal kunnen hebben de hoogste concentratie van CTC's in het perifere bloed.

1. Verzamelen van bloedmonsters na geïnformeerde toestemming en onder een geschikte Institutional Review Board goedgekeurd protocol. Draag latex handschoenen en een labjas gedurende de gehele procedure.
2. Sluit 25 G vlinder naald en leidingen aan naaldhouder. Gebruik een alcoholdoekje om de oppervlakte van schoonantecubitale ader tussen de biceps en onderarm, dan van toepassing tourniquet op de bovenarm van de patiënt.
3. Steek vlinder naald in antecubitale ader en duw bloedafname buis in naaldhouder aan collectie te starten. Verzamel ongeveer 10 ml bloed in verzameling buizen die ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) om stolling te voorkomen bevatten.
4. Verwijder vlinder naald van patiënt en druk uit te oefenen met een steriel gaasje in plaats van ader punctie gedurende 1 min. Cover site met een steriel verband.

2. Isolatie van mononucleaire cellen

Opmerking: De verzamelde uit stap 1 bloed perifere mononucleaire cellen (PBMC's) (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) naast de mononucleaire CTCs bevatten.

1. Pipetteer volbloed in 50 ml polystyreen conische buis met 5 ml serologische pipet en voeg Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in een 1: 1 ratio. Voorzichtig pipet mengsel te homogeniseren.
2. Voeg 15 ml van een commercieel bereide oplossing (Ficoll-Paque) te scheiden bloedcomponenten door lage snelheid dichtheidsgradiënt centrifugeren met een lege 50 ml conische buis van polystyreen.
3. Voorzichtig pipet volbloed en HBSS mengsel uit stap 2.1, in de polystyreen buis uit stap 2.2, met verschillende toplaag te vormen. Set pipet op de laagste stand om het mengen van oplossingen te minimaliseren, dit zal zorgen voor efficiënte scheiding.
4. Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (25 ° C). Stel vertraging op de laagste stand om het mengen van oplossingen na scheiding te voorkomen. Versnelling kan worden ingesteld op een snelheid.
5. Na centrifugeren identificeren van de dunne witgrijze streep PBMCs en CTCs laag gesandwiched tussen plasma boven en scheidingsoplossing op de bodem van de buis.
6. Verzamel de cellen van het wit-grijze streep in stap 2,5 in een 50 ml polystyreenbuis met een plastic pipet overdracht.
7. Voeg aan 50 ml HBSS polystyreen conische buis met PBMCs en CTCs en centrifuge opnieuw bij 400 xg gedurende 10 min RT te wassen.
8. Giet vloeistof en resuspendeer pellet in 50 ml HBSS en centrifugeren weer bij 400 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te wassen.
9. Verwijder het supernatant, resuspendeer de resterende pellet met 5 ml van rode bloedcellen Lysis buffer en incubeer de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
10. Verwijder de rode bloedcel lysisbuffer door centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min bij RT.
11. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS 1x, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) te blokkeren voordat antilichaamkleuring.

3. Kleuring mononucleaire cellen met CD45-FITC antilichaam voor Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS)

1. Kwantificeren aantal levensvatbare (trypan blue-negatieve) cellen (uit stap 2,11) met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Maak een 1 x 10 ⁶ cellen / ml suspensie (in PBS 1x met 10% FBS) en plaats het op ijs gedurende 1 uur.
2. Verdeel de gekwantificeerdecelsuspensie uit de vorige stap in twee buizen. Label buizen als controle en CD45 kleuring.
3. In de controlebuis, voeg IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) bij een verdunning van 1: 250. In de CD45 kleuring buis, voeg CD45 FITC (2,5 ug / ml) geconjugeerd primair antilichaam in een verdunning van 1: 250 en incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 30 min. CD45 antigen labeling wordt gebruikt om hematopoïetische cellen sluiten.
4. Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof.
5. Was de cellen tweemaal door suspenderen elke pellet met steriel 1 x PBS gesupplementeerd met 10% FBS, gevolgd door centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C.
6. Resuspendeer de cellen in een 1 ml oplossing van PBS bevattende 1 x 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bij een concentratie van 10 ug / ml.
7. Filter de uiteindelijke oplossing door middel van 35 micrometer zeef caps in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen.

4. Isolatie van Prostaat CTC's doorFACS

Opmerking: Gebruik een flowcytometer om live CD45 negatieve CTC's te verzamelen.

1. Stel controles vergoeding gebruik van cellen uit de buis label "Control."
2. Maak poorten die puin en clusters van cellen met behulp van de juiste forward-scatter en side-scatter parameters te sluiten.
3. Bepaal de FITC poorten met de celsuspensies uit de buis label "CD45-FITC."
4. Poort levensvatbare (DAPI-negatief) cellen met behulp van de Pacific Blue-A-kanaal.
5. Verzamel CD45 negatieve populatie in een steriele 15 ml polystyreen conische buis met 2 ml van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 gesupplementeerd met 10% FBS.
6. Centrifugeer de gesorteerde prostaat tumorcel suspensie bij 400 xg gedurende 3 min, daarna resuspendeer de pellets in 200 - 500 pl RPMI gesupplementeerd met 10% FBS.

5. Injectie van CTC in Muizen en Monitoring van Xenograft Growth

Let op:Voeren alle dierlijke procedures in overeenstemming met protocollen door de institutionele dierlijke zorg commissie goedgekeurd. Dit protocol is uitgevoerd bij onze instelling onder een specifieke dieren Gebruik Protocol door onze Animal Care Committee in overeenstemming en de naleving van alle relevante wettelijke en institutionele organisaties, voorschriften en richtlijnen goedgekeurd.

1. Meng de gesorteerde prostaat tumorcel suspensie met extracellulaire matrix bij een 1: 1 verhouding en plaats op ijs.
2. Verdoven muis vóór subcutane implantatie in een kamer toevoeren 5% (v / v) ingeademd isofluraan bij 1 l / min zuurstof. Zorgen voor passende verdoving door te controleren op het verlies van het hoornvlies en de teen reflex in de muis.
3. Met behulp van een 25 G naald en een spuit 1 ml, injecteer 250 ul van de prostaat tumorcel en extracellulaire matrix celsuspensie subcutaan in zowel de bovenste flanken van een 8-10 weken oude mannelijke immunodeficiënte muis. Injecteer 250 ui ongeacht CTC concentratie het injectievolume is het important waarde. Maximum SQ toediening bij muizen niet meer dan 1 ml.  
4. Monitor muizen door het uitvoeren wekelijkse palpatie van muis injectieplaatsen voor de groei van subcutane nodulaire dichtheden en door het meten van het gewicht muizen tweemaal per week.
5. Euthanaseren muizen door kooldioxide stikken, gevolgd door cervicale dislocatie en oogsten subcutane humane prostaatkankerxenograften wanneer tumorgrootte is dan 0,5 cm en minder dan 1 cm in grootste diameter voldoende tumorweefsel voor moleculaire analyse en seriële passage zorgen. Euthanaseren muizen met tekenen van angst of gewichtsverlies van 15% ondanks dat er geen tumor is voelbaar.

Representative Results

Dit protocol zal leiden tot de vorming van PDX modellen uit geïsoleerde CD45 negatieve prostaatkanker CTC. Op basis van de negatieve selectiemethode gebruikt in ons protocol dient om dode cellen te sluiten via DAPI kleuring. Het percentage CD45 negatieve cellen gedetecteerd door flow cytometrie is variabel en hangt af van de tumor belasting van de patiënt (figuur 1A). Immunofluorescentiekleuring ongesorteerd cellen met behulp CD45 en DAPI (voor celkernen identificeren) openbaart CD45 negatieve cellen, zoals aangegeven door de witte pijlen (figuur 1B). In figuur 1C, kan subcutane nodulaire dichtheden te zien op beide flanken van de muis. Elke nodulaire dichtheid vertegenwoordigt xenograft groei zal duidelijk onderscheiden van gezond weefsel dat uitsteekt vanaf de dorsale spieren van de muis en steviger van textuur. Het tijdsinterval tussen implantatie en xenograft ontwikkeling kan sterk variëren afhankelijk van de CTC last van de patient monster, aantal cellen geïmplanteerd en de biologische agressiviteit van CTC. Prostate PDX gegenereerd uit CTCs herhalen menselijke prostaat tumor zoals gezien door hematoxyline en eosine kleuring en immunohistochemie voor prostate specifieke cellulaire merkers, zoals androgeenreceptor (AR) en prostaatspecifiek membraan antigen (PSMA) (figuur 1D).

Figuur 1. Generatie van prostaatkanker PDX Modellen van Human prostaatkanker CTC. (A) Flow cytometry grafiek illustreert specifieke CD45 kleuring celpopulaties uit perifeer bloed van een patiënt met prostaatkanker. . Cellen met positieve DAPI vlek zijn dood en uitgesloten gating te garanderen dat alleen levensvatbare cellen worden geïsoleerd (B) CD45 immunofluorescentiekleuring van ongesorteerd bevolking bevestigt aanwezigheid van CD45 ^-. Cellen (witte pijlen) (C) tumor in vivo tumor en na de oogst (D) Analyse van CTC PDX modellen met behulp van conventionele hematoxyline en eosine en de prostaat specifieke markers.; androgene receptor (AR) en prostaat-specifiek membraan antigeen (PSMA). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor het genereren van prostaatkanker PDX modellen van CTCs. Het gebruik van CTCs voor het genereren van PDX modellen heeft een aantal potentieel belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden. Eerst toegankelijke verzameling CTCs uit perifeer bloed maakt het genereren van experimentele modellen van dezelfde patiënt in verschillende stadia van de ziekte. Ten tweede bloedafname is een veiligere en goedkope methode om tumorcellen te isoleren ten opzichte van bestaande methodologieën die chirurgische procedures voor het verzamelen van tumorcellen vereist.

Meerdere methoden van CTC verrijking zijn echter beschreven velen zijn niet toegankelijk voor elk laboratorium te wijten aan de financiering en de beperkte middelen. We wilden een test in ons laboratorium die kunnen profiteren van het gebruik van FACS, een handig, betaalbaar en toegankelijk methodologie voor vele laboratoria ontwikkelen. Een mogelijke beperking van deze methode isde ontoereikende gevoeligheid voor de detectie van zeldzame cellen die het gebruik van dit protocol kan beperken tot patiënten met een hoge tumorlast. Verscheidene aanvullende technologieën die fysische of biologische eigenschappen van epitheelcellen in dienst kan worden gebruikt om deze beperking op te verzachten en verhoging van de detectie en isolatie van deze zeldzame celpopulatie ^4. De methode voor het CTC verrijking beschreven in dit protocol maakt gebruik van negatieve selectie; CD45 ⁺ leukocyten worden verwijderd en CD45 ^- CTC blijven behouden. Het is belangrijk om mogelijk te verwijderen verontreinigende CD45 ^- elementen van de celsuspensies bij het ​​sorteren door middel van flowcytometrie (bijvoorbeeld, niet-levensvatbare cellen.). Vooral het gebruik van rode bloedcellen lysisbuffer en het weglaten van levensvatbare cellen met DAPI kleuring kritisch overwegingen. Hoewel deze maatregelen kunnen niet garanderen dat niet-CTC elementen niet de CD45 vervuilen ^- de bevolking, onze eerdere studies suggereren dat de gewenste cel population voldoende verrijkt met deze methoden ^11. Het is mogelijk dat de zuiverheid van het CTC populatie kan worden verbeterd door middel van positieve selectie met behulp van antilichamen voor oppervlaktemarkers uniek prostaatkankercellen ³ cel. Bovendien kunnen CTC heterogeniteit en het aantal epitheelcellen in het monster worden getest met EpCAM of andere geschikte vlekken. Echter aanvullende bewerking van de perifere bloedmonster kan uiteindelijk toenemen zuiverheid terwijl het verminderen van de totale opbrengst.

In dit protocol uitgevoerd we subcutane injectie van geïsoleerde CTC's die het mogelijk maakt voor eenvoudige implantatie en monitoring van de ontwikkeling van tumoren. Echter, subcutane modellen hebben ontoereikende voeding aanbod dat tumor innesteling en het verlies van tumorcel subpopulaties in gevaar kan brengen. Alternatieve injectieplaatsen, zoals de muis prostaat (orthotroop), die een prostaat micro bevordert en subrenal capsule injectie, die succ verbetertessful innesteling en behoudt tumor heterogeniteit, kan worden uitgevoerd op basis van onderzoeker voorkeur ^1,2. Optimaal dienen NOD / SCID / IL2λ-receptor nul (NSG) muizenmodellen worden gebruikt om de snelheid van xenograft engraftment ¹² verhogen, maar andere stammen van immuungecompromitteerde muizen (NOD / SCID of, Naakt, SCID / Beige) zijn ook met succes toegepast bij het ​​genereren van vaste tumor afgeleide PDX modellen ^1. Gegenereerde PDX-modellen kan serieel worden gepasseerd en de stabiliteit van de oorspronkelijke tumor kenmerken gecontroleerd met behulp van gevestigde genetische methoden ^9-11,13.

Het herstel van de hoge aantallen van levensvatbare prostaatkanker CTC's afhankelijk is van de ziekte van het podium. De succesvolle productie van PDX modellen wordt het best gewaarborgd wanneer CTCs worden geïsoleerd uit bloed van patiënten met metastatische hoge belasting. We hebben met succes geproduceerd PDX modellen van bloedmonsters met een bereik van 100 tot 10.000 CTCs. In onze ervaring, is het noodzakelijk om goed opgeleide arbeidskrachtenAtory personeel om het protocol regelmatig uitvoeren om de succesvolle isolatie van prostate CTCs uit bloedmonsters te verzekeren. We raden aan dat laboratorium personeel in eerste instantie worden opgeleid in dit protocol door het gebruik van bloedmonsters van normale gezonde individuen verrijkt met cellen van tumorcellijnen. De afwezigheid of lage aantal CTC's in primaire prostaatkanker kan het gebruik van deze methode om uitgezaaide prostaatkanker beperken.

De werkwijze voor het genereren van CTC afgeleid PDX modellen dit protocol kan vervolgens worden toegepast in veel wetenschappelijke toepassingen waaronder moleculaire karakterisatie van prostaatkanker, drug screening, bewaking therapie respons, biomarkerontwikkeling en andere verbeteringen in gepersonaliseerde kankertherapieën beschreven.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe