Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Introduction

Patient xénogreffes dérivés sont des modèles expérimentaux de plus en plus populaires utilisés pour la recherche sur le cancer. Ils peuvent être utilisés pour la caractérisation de biomarqueurs et de voies biologiques, l'évaluation pré-clinique de l'efficacité des médicaments, et la création d'avatars pour les thérapies personnalisés du cancer ^1,2. Auparavant, les autres groupes de recherche ont développé des modèles PDX soit par implantation ou injection de suspensions de cellules tumorales uniques ou des explants tumoraux chez des souris immunodéprimées entier ^1. Ces PDX modèles nécessitent collection chirurgicale de la tumeur solide frais, ascite maligne ou des épanchements pleuraux provenant d'un patient subissant une intervention chirurgicale qui est à la fois coûteux et expose le patient à un risque accru de morbidité iatrogène.

Un développement récent important dans la recherche sur le cancer est la détection, l'isolement et la caractérisation des cellules tumorales circulantes. Ces cellules tumorales échappent à partir de la masse de la tumeur primaire et pénètrent dans la circulationoù ils jouent un rôle essentiel dans les métastases et la rechute, la cause la plus commune de cancer de la mortalité liée ^3. L'évaluation et la caractérisation des CTC à partir de plusieurs types de tumeurs solides ont fourni des informations cliniques pour le diagnostic, le pronostic et le suivi de la maladie résiduelle ^3. Une variété d'approches actuellement utilisées reposant soit sur ​​les propriétés physiques, l'expression de biomarqueurs, ou des caractéristiques fonctionnelles de CTC peut être utilisé pour isoler efficacement CTC ^4. Les méthodes existantes d'isolation CCT macroscopique comprennent la centrifugation en gradient de densité, filtration physique avec des pores de filtrage et de séparation contre des molécules de surface. Les méthodes d'isolement plus largement utilisés CCT sont basés sur la capture à base d'anticorps de la CTC. Tant sélection positive et négative de marqueurs de surface cellulaire peut être utilisée pour isoler les CTC partir de sang périphérique. La sélection positive pour les CTC dans la circulation périphérique utilise couramment marqueurs épithéliaux (par exemple, un EpCAM) quire exprimé sur les cellules, mais pas CTC hématopoïétiques. L'inconvénient de cette méthode est que les CTC avec un potentiel métastatique ont souvent fait l'objet d'épithéliale-mésenchymateuse transition (EMT), qui régule à la baisse des marqueurs de surface ³ épithéliales. Afin d'isoler les CTC avec un potentiel métastatique, une méthode de sélection négative qui utilise le marqueur de surface hématopoïétiques, CD45, pour épuiser la population de cellules de leucocytes normales peut être utilisé ^5.

Le cancer de la prostate est le cancer le plus fréquemment diagnostiqué et une cause majeure de décès liés au cancer chez les hommes ^6. Les mécanismes de la progression de la tumeur et de l'agressivité sont pas complètement compris et par conséquent la génération et la caractérisation des modèles expérimentaux qui récapitulent l'hétérogénéité moléculaire de cancer de la prostate sont d'un intérêt considérable. PDX modèles de cancer de la prostate ont été précédemment générée par la prise de greffe de cellules de cancer de la prostate humaines dans immunodépriméssouris promis ^7,8. Toutefois, la production de ces modèles a été entravée par le taux de prise de greffe bas de cancer de la prostate dans des souris immunodéprimées, qui est principalement attribuable à la nature indolente de la maladie. Récemment, des CTC ont été utilisées pour générer le cancer du sein ^9, le cancer du poumon et de la prostate ^{10 11 modèles} PDX. Ces études de preuve de concept introduit la possibilité de générer des modèles PDX indépendante de la nécessité pour la collecte de l'échantillon chirurgicale. Dans cet article, nous décrivons en détail un procédé pour la production de ce nouveau modèle expérimental.

Protocol

Ce protocole a été réalisée à notre institution avec l'approbation du conseil institutionnel d'éthique de la recherche et est en conformité avec toutes les directives institutionnelles, nationales et internationales pour le bien-être humain.

1. Collecte de sang périphérique de patients atteints de cancer de la prostate avancé

Remarque: Sélectionnez les patients atteints de cancer de la prostate métastatique. Obtenir le consentement écrit du patient et enregistrer les caractéristiques cliniques des patients, y compris l'âge à l'isolement et une chimiothérapie antérieure et les traitements hormonaux. Les patients atteints de la maladie métastatique auront potentiellement plus forte concentration de CTC dans le sang périphérique.

1. Prélever des échantillons sanguins après consentement éclairé et sous un Institutional Review Board appropriée protocole approuvé. Porter des gants en latex et une blouse de laboratoire pendant toute la procédure.
2. Connectez 25 G aiguille à ailettes et de tubes à porte-aiguille. Utilisez un tampon imbibé d'alcool pour nettoyer la zone deveine antécubitale entre biceps et avant-bras, puis appliquer garrot sur le bras du patient.
3. Insérez l'aiguille dans la veine de papillon coude et pousser le tube de collecte de sang dans le support de l'aiguille pour commencer la collecte. Recueillir environ 10 ml de sang dans des tubes de collecte contenant de l'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) pour empêcher la coagulation.
4. Retirer l'aiguille papillon du patient et appliquer une pression avec un tampon de gaze stérile sur le site de ponction de la veine pendant 1 min. Site Couvrir avec un pansement stérile.

2. Isolement des cellules mononucléaires

Remarque: Le sang recueilli à partir de l'étape 1 contient des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) (par exemple, les lymphocytes et monocytes), en plus des CTC mononucléaires.

1. Pipette sang entier dans 50 ml tube de polystyrène conique avec une pipette sérologique de 5 ml et ajouter une solution de sel équilibrée de Hanks (HBSS) dans un rapport de 1: 1. Doucement mélange de pipette pour homogénéiser.
2. Ajouter 15 ml d'une solution préparation du commerce (Ficoll-Paque) pour séparer des composants du sang par centrifugation en gradient de densité faible à une vitesse de 50 ml polystyrène tube conique vide.
3. Pipette doucement le sang total et mélange HBSS, de l'étape 2.1, dans le tube de polystyrène de l'étape 2.2, pour former la couche supérieure distincte. Set pipette au plus bas réglage pour minimiser le mélange de solutions, ce qui garantira une séparation efficace.
4. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à température ambiante (25 ° C). Réglez décélération au plus bas pour empêcher le mélange de solutions après la séparation. Accélération peut être réglé à toute vitesse.
5. Après centrifugation, d'identifier la bande blanc-gris de la couche mince CMSP et CTC en sandwich entre le plasma sur la solution supérieure et la séparation au fond du tube.
6. Recueillir les cellules de la bande blanc-gris à l'étape 2.5 dans un tube de 50 ml de polystyrène à l'aide d'une pipette de transfert en plastique.
7. Ajouter HBSS à 50 ml polystyrène tube conique avec CMSP et CTC et centrifuge de nouveau à 400 g pendant 10 min à RT laver.
8. Décanter culot liquide et remettre en suspension dans 50 ml de HBSS et centrifuger à nouveau à 400 g pendant 3 min à température ambiante pour se laver.
9. Jeter le surnageant, remettre le culot restant avec 5 ml de tampon de lyse de Red Blood Cell et incuber la solution pendant 5 min à température ambiante.
10. Retirer le rouge globules tampon de lyse par centrifugation à 400 g pendant 3 minutes à température ambiante.
11. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS 1x complété avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) pour bloquer avant la coloration des anticorps.

3. Les cellules mononucléaires coloration avec CD45-FITC anticorps pour cellulaire activé par fluorescence (FACS)

1. Quantifier le nombre de cellules viables (trypan bleu-négative) de l'étape (2.11) à l'aide d'un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé. Préparer un x 10 ⁶ cellules / ml de suspension 1 (dans PBS 1x avec 10% de FBS) et le placer sur la glace pendant 1 heure.
2. Distribuer le quantifiéssuspension cellulaire de l'étape précédente dans deux tubes. Tubes d'étiquetage que le contrôle et CD45 coloration.
3. Dans le tube de commande, ajouter IgG1κ-FITC (2,5 pg / ml) à une dilution de 1: 250. Dans le tube de coloration de CD45, CD45 FITC ajouter (2,5 pg / ml) anticorps primaire conjugué à une dilution de 1: 250 et on incube les suspensions de cellules sur de la glace pendant 30 min. CD45 étiquetage d'antigène est utilisée pour exclure les cellules hématopoïétiques.
4. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 3 min à 4 ° C, et jeter le surnageant.
5. Laver les cellules deux fois, en mettant en suspension chaque culot avec 1 x PBS stérile additionné de FBS à 10% suivie d'une centrifugation à 400 g pendant 3 min à 4 ° C.
6. Remettre en suspension les cellules dans une solution de 1 ml de PBS 1X contenant 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à une concentration de 10 ug / ml.
7. Filtrer la solution finale à 35 um bouchons de tamis 12 mm dans des tubes de polystyrène de 75 x mm.

4. Isolement de la prostate par CTCFACS

Remarque: Utiliser un cytomètre de flux pour recueillir en direct CTC CD45 négatives.

1. Définir les contrôles de compensation en utilisant des cellules du tube étiqueté, «contrôle».
2. Créer portes qui excluent les débris et amas de cellules en utilisant des paramètres de l'avant-scatter et dispersion latérale appropriées.
3. Mettre en place la porte de la FITC en utilisant les suspensions de cellules à partir du tube marqué "CD45-FITC."
4. (Cellules DAPI-négative) Porte viables en utilisant le bleu du Pacifique-un canal.
5. Recueillir CD45 démographique négative dans un tube de 15 ml polystyrène conique stérile contenant 2 ml de Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS.
6. Centrifugeuse de la prostate de suspension de cellules tumorales triés à 400 g pendant 3 min, puis remettre en suspension les culots dans 200 - 500 pi de milieu RPMI supplémenté avec 10% de FBS.

5. Injection de CTC dans souris et le suivi de la croissance des xénogreffes

Note:Effectuer toutes les procédures animales en conformité avec les protocoles approuvés par le comité de protection des animaux dans les institutions. Ce protocole a été réalisée à notre institution en vertu d'un protocole d'utilisation des animaux spécifiques approuvées par notre Comité de protection des animaux conformément et le respect de toutes les agences réglementaires et institutionnels, règlements et directives pertinentes.

1. Mélanger la prostate suspension de cellules tumorales triés avec la matrice extracellulaire à un ratio de 1: 1 et le placer sur la glace.
2. Anesthetize souris avant l'implantation sous-cutanée dans une chambre de fourniture de 5% (v / v) d'isoflurane inhalées dans 1 L / min d'oxygène. Assurer une anesthésie appropriée en vérifiant pour la perte du réflexe cornéen et des orteils chez la souris.
3. En utilisant une aiguille de 25 G et une seringue de 1 ml, injecter 250 ul de cellules de tumeur de la prostate et de la matrice extracellulaire suspension cellulaire sous-cutanée dans les deux flancs supérieurs de 8-10 semaines une ancienne souris immunodéficiente mâle. Injecter 250 ul indépendamment de la concentration CTC comme le volume d'injection est le important valeur. Administration SQ maximum chez la souris a pas plus de 1 ml.  
4. Surveiller les souris en effectuant palpation hebdomadaire des sites d'injection de la souris sur la croissance de densités nodulaires sous-cutanées et par la mesure de poids des souris deux fois par semaine.
5. Euthanasier souris par le dioxyde de carbone asphyxie suivie par dislocation cervicale et les xénogreffes récolte du cancer de la prostate humain sous-cutanés lorsque la taille de la tumeur est supérieure à 0,5 cm et de moins de 1 cm de plus grand diamètre pour assurer un tissu tumoral suffisant pour les analyses moléculaires et des passages en série. Euthanasier les souris présentant des signes de détresse ou de perte de poids de 15% malgré l'absence de tumeur est palpable.

Representative Results

Ce protocole permettra à la génération de modèles de PDX isolés CD45 prostate négative CTC cancéreuses. Basé sur la méthode de sélection négative utilisée dans notre protocole, il est nécessaire d'exclure les cellules mortes en utilisant DAPI tache. Le pourcentage de cellules CD45 négatives détectées par cytométrie de flux est variable et dépend de la charge tumorale du patient (figure 1A). La coloration par immunofluorescence de cellules non triées à l'aide de CD45 et DAPI (pour identifier les noyaux de cellules) des cellules CD45 négatives révèle, comme indiqué par les flèches blanches (Figure 1B). Sur la figure 1C, les densités nodulaires sous-cutanés peuvent être vus sur les deux flancs de souris. Chaque densité nodulaire représente la croissance de la xénogreffe et peut être apprécié par opposition à un tissu sain comme il fait saillie à partir de la musculature du dos de la souris est plus ferme et en texture. L'intervalle de temps entre l'implantation et le développement de xénogreffe peut varier considérablement en fonction de la charge de la CCT de la patient échantillon, le nombre de cellules implantées et l'agressivité biologique de CTC. PDX de la prostate générée par CTC récapituler tumeur de la prostate humain comme on le voit par hématoxyline et éosine, et par immunohistochimie pour les marqueurs cellulaires prostatiques spécifiques, tels que le récepteur des androgènes (AR) et l'antigène spécifique de la prostate membrane (PSMA) (figure 1D).

Figure 1. génération de modèles cancer de la prostate PDX de Human Cancer de la Prostate CTC. (A) La cytométrie en flux tracé illustrant des populations spécifiques de cellules CD45 de coloration à partir de sang périphérique d'un patient atteint de cancer de la prostate. . Les cellules avec des taches de DAPI positive sont morts et exclus par gating pour assurer que les cellules viables sont isolés (B) CD45 immunofluorescence de la population non triés confirme la présence de CD45 ^-. Cellules (flèches blanches) (C) in vivo et après la récolte de la tumeur (D) Analyse des modèles PDX CCT utilisant Hematoxylin conventionnelle et de l'éosine et les marqueurs spécifiques de la prostate. récepteur des androgènes (AR) et de l'antigène de la membrane spécifique de la prostate (PSMA). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Ce manuscrit décrit un procédé pour la génération de modèles PDX cancer de la prostate à partir de CTC. L'utilisation de CTC pour la génération de PDX modèles présente plusieurs avantages potentiels importants par rapport aux méthodes existantes. Tout d'abord, la collecte des CTC accessible à partir de sang périphérique permet de générer des modèles expérimentaux chez le même patient à différents stades de la maladie. D'autre part, la collecte de sang représente un procédé plus sûr et peu coûteux pour isoler les cellules tumorales par rapport aux méthodes existantes qui nécessitent des interventions chirurgicales pour la collecte de cellules tumorales.

Plusieurs méthodes d'enrichissement de la CCT ont été décrites mais beaucoup ne sont pas accessibles à tous les laboratoires en raison des limites de financement et de ressources. Nous avons cherché à développer un test dans notre laboratoire qui pourraient tirer profit de l'utilisation de FACS, une méthodologie pratique, abordable et accessible pour de nombreux laboratoires. Une limitation potentielle de cette méthodologie estla sensibilité insuffisante pour la détection de cellules rares qui pourrait limiter l'utilisation de ce protocole pour les patients avec une charge tumorale élevée. Plusieurs technologies supplémentaires qui utilisent les propriétés physiques ou biologiques des cellules épithéliales peuvent être utilisés pour atténuer au-dessus de cette limite et augmenter la détection et l'isolement de cette population de cellules rares ^4. La méthode pour l'enrichissement de la CCT décrit dans ce protocole utilise la sélection négative; CD45 ⁺ leucocytes sont éliminés et CD45 ^- CTC sont conservés. Il est important d'enlever potentiellement contaminant CD45 ^- éléments des suspensions cellulaires lors du tri par cytométrie de flux (par exemple, les cellules non viables.). En particulier, l'utilisation d'un tampon de lyse des globules rouges et l'omission de cellules non viables par coloration DAPI sont des considérations essentielles. Bien que ces mesures ne peuvent pas garantir que les éléments non-CTC ne contaminent pas le CD45 ^- population, nos études précédentes suggèrent que la cellule p souhaitéeopulation est suffisamment enrichi avec ¹¹ ces procédés. Il est possible que la pureté de la population CTC pourrait être améliorée par sélection positive en utilisant des anticorps dirigés contre des marqueurs de surface cellulaire spécifiques à des cellules cancéreuses de la prostate ^3. De plus, l'hétérogénéité CTC et le nombre de cellules épithéliales présentes dans l'échantillon peuvent être testés en utilisant EpCAM ou d'autres colorants appropriés. Cependant traitement supplémentaire de l'échantillon de sang périphérique peut finalement augmenter la pureté, tout en diminuant le rendement global.

Dans ce protocole, nous avons effectué injection sous-cutanée de la CTC isolés qui permet pour l'implantation et le suivi de la tumeur en développement facile. Cependant, les modèles sous-cutanés ont fourniture d'une alimentation inadéquate qui peut compromettre la prise de greffe de la tumeur et une perte de sous-populations de cellules tumorales. D'autres sites d'injection tels que la prostate de la souris (orthotrope), ce qui favorise un micro-environnement de la prostate, et l'injection de la capsule surrénale, ce qui améliore succgreffe essful et préserve l'hétérogénéité tumorale, peuvent être effectuées sur la base de l'enquêteur préférence ^1,2. Idéalement, des modèles de souris NOD / SCID / IL2λ-récepteur null (NSG) devraient être utilisés pour augmenter le taux de xénogreffe greffe ^12, mais d'autres souches de souris immunodéprimées (NOD / SCID ou, Nu, SCID / Beige) ont également été utilisés avec succès dans la génération de modèles de tumeur solide dérivé PDX ^1. PDX modèles générés peuvent être repiquées en série et la stabilité des caractéristiques de la tumeur d'origine contrôlées en utilisant des méthodes génétiques établis ^9-11,13.

La récupération du nombre élevé de cancer de la prostate viable CTC dépend du stade de la maladie. La génération avec succès des modèles PDX est mieux assurée lorsque les CTC sont isolés à partir du sang des patients atteints de forte charge métastatique. Nous avons réussi à générer des modèles PDX partir d'échantillons sanguins avec une gamme de 100 à 10 000 CTC. Dans notre expérience, il est nécessaire pour le travail bien formésAtory personnel pour exécuter le protocole fréquemment afin d'assurer l'isolement réussi de CTC de la prostate à partir d'échantillons sanguins. Nous recommandons que le personnel de laboratoire être été formés dans ce protocole en utilisant des échantillons de sang d'individus sains normaux dopés avec des cellules provenant de lignées cellulaires tumorales. L'absence ou le faible nombre de CTC en cancer de la prostate primaire peuvent limiter l'utilisation de cette méthode pour le cancer de la prostate métastatique.

La méthode pour la production de CTC dérivé modèles PDX décrites dans ce protocole peut ensuite être utilisé dans de nombreuses applications de recherche, y compris la caractérisation moléculaire du cancer de la prostate, le dépistage des drogues, la réponse thérapeutique de surveillance, le développement de biomarqueurs et d'autres avancées dans les thérapies du cancer personnalisés.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe